HepG2.2.15细胞系中HBV复制相关抑制因素的变化

目的:研究HBV对其自身复制相关抑制因素的影响,为今后探索提高抗病毒治疗的疗效提供基础.方法:采用实时荧光定量RT-PCR技术检测原蛋白转化酶(PCs)、肝细胞核因子(HNF)3*9茁和转化生长因子(TGF)*9茁1等HBV复制相关抑制因素的mRNA表达,采用Western印迹技术检测部分PCs的蛋白表达,通过比较模型细胞HepG2.2.15和其前体细胞HepG2的表达差别来判断HBV对其自身复制相关抑制因素的影响.结果:HepG2.2.15和HepG2细胞均相对高表达furin和PACE4,但HepG2细胞还高表达PC1/2.与HepG2细胞相比,HepG2.2.15细胞的PC1/3和PC7/8在mRNA水平显著被下调(均P ＜ 0.05),且PC1/3在蛋白水平的表达也显著减少.HepG2.2.15细胞的HNF3β和TGFβ1的mRNA表达水平也发生了显著改变,分别增加到5.22倍和降低到0.35倍.结论:HBV的存在对其自身复制相关抑制因素可产生显著影响.下调部分PCs和TGF*9茁1表达可能有利于HBV自身复制,但上调HNF3*9茁的意义值得深入研究.     

AT基因13387-9delG突变引起遗传性抗凝血酶缺陷症的分子病理机制研究

目的　研究AT基因 13387 9delG突变引起AT缺陷症的分子病理机制。方法　用大引物法构建 13387 9delG突变体AT重组表达质粒 (ATM) ,并将其和正常AT重组表达质粒 (ATN)分别用Superfect 试剂转染COS7细胞或CHO细胞 ,进行体外表达试验、脉冲追踪试验以及细胞免疫荧光染色。结果　ATM转染的COS7细胞培养上清液中检测不到AT抗原 ,而在细胞裂解液中 ,其AT抗原仅为转染ATN的 2 7 13%。脉冲追踪试验发现 ,在ATM转染的COS7细胞培养上清液中 ,检测不到3 5S标记的AT蛋白 ,在chase 0min时 ,ATM细胞内3 5S标记的AT蛋白只有ATN的 2 7 8% ;在chase 180min时 ,ATM细胞内3 5S标记的AT蛋白为 0min时的 5 0 %左右。细胞免疫荧光试验的结果表明 ,ATM转染的CHO细胞内荧光强度明显低于ATN转染的CHO细胞。结论　编码的突变AT蛋白分泌障碍和细胞内快速降解 ,是AT基因 13387 9delG突变引起AT缺陷症的分子病理机制     

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景：体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。目的：构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。方法：采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果与结论：重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。     

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景:体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要.目的:构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础.方法:采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72 cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定.结果与结论:重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72 cDNA,并能在COS7细胞稳定表达.成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达.     

碱性纤维母细胞生长因子对AD细胞模型PKCγ活性影响

目的 研究碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)对β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞存活率、蛋白激酶Cγ(PKCγ)蛋白表达的影响.方法 经体外培养的PC12细胞分正常对照组(常规培养液)、Aβ损伤组(加入培养液及老化Aβ25-35)、bFGF组(加入培养液、bFGF及老化Aβ25-35).MTT法检测不同处理组PC12细胞存活率,Western Blot 免疫印迹法分析PKCγ蛋白表达变化.结果 Aβ损伤组PC12细胞存活率低于正常对照组(P ＜0.05),bFGF组细胞存活率高于Aβ损伤组(P＜0.05).Western Blot 结果 显示,Aβ损伤组PKCγ(0.68±0.07)较对照组PKCγ(0.8±0.08)表达显著下降;Aβ损伤组在加入不同浓度的bFGF后PKCγ的值分别为:1.04±0.10,1.20±0.12,1.39±0.03,1.69±0.16,较 Aβ损伤组 PKCγ(0.65±0.06)蛋白表达显著增强,并与 bFGF浓度呈正相关.结论 bFGF对Aβ诱导的PC12细胞损伤具有一定保护作用,可能是通过增强PC12细胞PKCγ蛋白表达而实现.     

β淀粉样蛋白1～42诱导原代皮质神经元损伤过程中的淀粉样前体蛋白信号通路

背景:近年有研究表明纤维状β淀粉样蛋白能够促进细胞表面淀粉样前体蛋白在细胞外的积聚,导致神经损伤。目的:分析淀粉样前体蛋白信号通路在纤维状β淀粉样蛋白1～42诱导神经元损伤机制中的作用。方法:体外分离培养孕17.0～18.0d SD大鼠皮质神经元,培养7d后加入0(正常对照),0.05,0.5,5mol/L纤维状β淀粉样蛋白1～42,孵育8h建立毒性损伤模型,采用生化方法检测神经元细胞培养上清中的Calcein释放,分别用免疫荧光双标、Western blotting方法检测淀粉样前体蛋白和Fe65的表达。结果与结论:与正常对照组比较,加入不同浓度纤维状β淀粉样蛋白1～42诱导损伤8h后,神经元培养上清中Calcein释放增加(P<0.05或P<0.01),Western blotting和免疫荧光方法分别检测到淀粉样前体蛋白和Fe65的表达及共定位增加。说明纤维状β淀粉样蛋白1～42可诱导原代培养皮质神经元的毒性损伤,淀粉样前体蛋白-Fe65信号通路可能是其损伤机制之一。     

脑钠肽重组蛋白的表达及生物学活性的研究

目的 比较脑钠肽(BNP)连接在不同载体中表达的BNP成熟肽蛋白和BNP前体蛋白的生物学活性差别.方法 采用分子生物学技术构建重组质粒PGEX-20T-BNP32,PGEX-20T-BNP108,B11-BNP32和B11-BNP108,分别对其进行PCR、双酶切和测序鉴定,然后将已测序鉴定的包含四种重组质粒的工程菌,转化至大肠埃希菌BL21菌中表达BNP成熟肽蛋白和BNP前体蛋白,并用ELISA法检测4种蛋白的生物学活性作用.结果 在大肠埃希菌中表达的成熟肽蛋白BNP32和前体蛋白BNP108经过纯化、复性后具有生物学活性.结论 PGEX-20T-BNP32表达的成熟肽蛋白BNP32的生物学活性最强,为下一步单抗制备的优势蛋白.     

大鼠坐骨神经损伤对脊髓原蛋白转化酶Furin及脑源性神经营养因子表达的影响

目的:观察大鼠坐骨神经损伤对相应节段脊髓原蛋白转化酶Furin及脑源性神经营养因子(BDNF)表达的影响。方法:20只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组5只和损伤组15只。采用钳夹法制备坐骨神经损伤模型,假手术组不造成坐骨神经损伤。取L5节段脊髓,通过蛋白印迹及免疫荧光观察Furin、BDNF的表达。结果:与假手术组相比,损伤组在损伤后第7天、第14天,BDNF和Furin差异有统计学意义(P0.05或0.01)。结论:Furin可能介导坐骨神经损伤后脊髓BDNF上调过程。     

脑钠肽前体及氨基末端脑钠肽前体基因的克隆与表达

目的在大肠杆菌中表达脑钠肽前体(proBNP)及氨基末端前体蛋白(NT-proBNP)。方法采用分子生物学技术构建重组质粒PGEX-20T-proBNP和PGEX-20T-NT-proBNP,分别对其进行PCR、双酶切和测序鉴定,然后将已测序鉴定的包含两种重组质粒的工程菌,转化至大肠杆菌BL21菌中表达脑钠肽前体及氨基末端前体蛋白,并用Western-blot鉴定纯化的重组蛋白。结果在大肠杆菌中成功的表达脑钠肽前体及氨基末端前体蛋白,两种蛋白均以可溶性形式表达,更有利于保存其生物学活性。结论两种蛋白的成功表达将有利于后续的单抗制备及检测试剂盒的开发奠定基础。     

蛋白C基因C64W和F139V突变致蛋白C缺陷的分子机制研究

目的研究蛋白C（PC）基因C64W、F139V和K150缺失突变（K150d）致PC缺陷症的分子机制。方法构建PC基因野生型和突变体表达质粒（PCwt、PC C64W、PC F139V、PC K150d）并瞬时转染至COS-7细胞或CHO细胞，进行体外表达试验和细胞免疫荧光染色；用荧光实时PCR（real-time PCR）检测转染细胞PC mRNA表达量的改变；蛋白降解抑制实验检测突变蛋白在细胞内的降解途径；内糖苷酶-H（Endo H）酶切试验检测PC翻译后侧链糖化修饰。结果PC C64W未从转染细胞内分泌且在细胞内逐渐降解，PC F139V仅部分从细胞内分泌，大部分未分泌并在细胞内逐渐降解，PC K150d突变体蛋白的分泌未受突变的明显影响。real-time PCR结果显示，与野生型PC mRNA相比，突变体PC mRNA不降低；蛋白降解抑制实验显示，PC C64W和PC F139V通过蛋白酶体途径进行细胞内降解。Endo H酶切和转染细胞荧光染色显示，PC C64W和PC F139V主要位于前高尔基体。结论分泌障碍和细胞内降解是PC C64W和PC F139V导致PC缺陷症的原因，PC K150d对突变体蛋白的分泌无明显影响。     

The secretory proprotein convertases furin,PC5, and PC7 activate VEGF-C to induce tumorigenesis

The secretory factor VEGF-C has been directly implicated in various physiological processes during embryogenesis and human cancers. However, the importance of the conversion of its precursor proVEGF-C to mature VEGF-C in tumorigenesis, and vessel formation and the identity of the protease(s) that regulate these processes is/are not known. The intracellular processing of proVEGF-C that occurs within the dibasic motif HSIIRR(227)SL suggests the involvement of the proprotein convertases (PCs) in this process. In addition, furin and VEGF-C were found to be coordinately expressed in adult mouse tissues. Cotransfection of the furin-deficient colon carcinoma cell line LoVo with proVEGF-C and different PC members revealed that furin, PC5, and PC7 are candidate VEGF-C convertases. This finding is consistent with the in vitro digestions of an internally quenched synthetic fluorogenic peptide mimicking the cleavage site of proVEGF-C ((220)Q-VHSIIRR downward arrow SLP(230)). The processing of proVEGF-C is blocked by the inhibitory prosegments of furin, PC5, and PACE4, as well as by furin-motif variants of alpha2-macroglobulin and alpha1-antitrypsin. Subcutaneous injection of CHO cells stably expressing VEGF-C into nude mice enhanced angiogenesis and lymphangiogenesis, but not tumor growth. In contrast, expression of proVEGF-C obtained following mutation of the cleavage site (HSIIRR(227)SL to HSIISS(227)SL) inhibits angiogenesis and lymphangiogenesis as well as tumor growth. Our findings demonstrate the processing of proVEGF-C by PCs and highlight the potential use of PC inhibitors as agents for inhibiting malignancies induced by VEGF-C.     

Selective inhibition of proprotein convertases represses the metastatic potential of human colorectal tumor cells

The proprotein convertases (PCs) are implicated in the activation of various precursor proteins that play an important role in tumor cell metastasis. Here, we report their involvement in the regulation of the metastatic potential of colorectal tumor cells. PC function in the human and murine colon carcinoma cell lines HT-29 and CT-26, respectively, was inhibited using siRNA targeting the PCs furin, PACE4, PC5, and PC7 or by overexpression of the general PC inhibitor alpha1-antitrypsin Portland (alpha1-PDX). We found that overexpression of alpha1-PDX and knockdown of furin expression inhibited processing of IGF-1 receptor and its subsequent activation by IGF-1 to induce IRS-1 and Akt phosphorylation, all important in colon carcinoma metastasis. These data suggest that the PC furin is a major IGF-1 receptor convertase. Expression of alpha1-PDX reduced the production of TNF-alpha and IL-1alpha by human colon carcinoma cells, and incubation of murine liver endothelial cells with conditioned media derived from these cells failed to induce tumor cell adhesion to activated murine endothelial cells, a critical step in metastatic invasion. Furthermore, colon carcinoma cells in which PC activity was inhibited by overexpression of alpha1-PDX when injected into the portal vein of mice showed a significantly reduced ability to form liver metastases. This suggests that inhibition of PCs is a potentially promising strategy for the prevention of colorectal liver metastasis.     

MicroRNA-125a质粒表达载体的构建及其表达活性

背景:pSuper是一种非编码RNA的真核表达载体,可在细胞质内表达miRNA前体,经过细胞自身的Dicer酶切后形成miRNA成熟体,其过程能够完全模仿细胞内源性miRNA形成过程。因此,利用pSuper表达载体构建一种肝癌抑制性miRNA:miR-125a的表达载体,为下一步研究其抗癌机制奠定了基础。目的:构建miR-125a的真核表达质粒pSuper-miR-125a,并验证其表达miR-125a的效率和特异性。方法:PCR扩增miR-125a前体(Pre-miR-125a)的目的片段,将其T-A克隆入pMD18-T过渡质粒载体,限制性内切酶切下目的片段,连接入pSuper质粒表达载体得到pSuper-miR-125a重组质粒;将重组质粒转染Hela细胞,miRNA定量PCR检测重组质粒表达miR-125a的效率和特异性。结果与结论:成功将miR-125a前体(Pre-miR-125a)片段克隆入真核表达质粒pSuper H1启动子下游,获得pSuper-miR-125a重组表达质粒,转染该质粒进入Hela细胞后能够在细胞内高效和特异的表达miR-125a,进一步证明pSuper真核表达质粒适合miRNA的表达研究。     

MicroRNA-125a质粒表达载体的构建及其表达活性

背景：pSuper是一种非编码RNA的真核表达载体,可在细胞质内表达miRNA前体,经过细胞自身的Dicer酶切后形成miRNA成熟体,其过程能够完全模仿细胞内源性miRNA形成过程。因此,利用pSuper表达载体构建一种肝癌抑制性miRNA：miR-125a的表达载体,为下一步研究其抗癌机制奠定了基础。目的：构建miR-125a的真核表达质粒pSuper-miR-125a,并验证其表达miR-125a的效率和特异性。方法：PCR扩增miR-125a前体（Pre-miR-125a）的目的片段,将其T-A克隆入pMD18-T过渡质粒载体,限制性内切酶切下目的片段,连接入pSuper质粒表达载体得到pSuper-miR-125a重组质粒;将重组质粒转染Hela细胞,miRNA定量PCR检测重组质粒表达miR-125a的效率和特异性。结果与结论：成功将miR-125a前体（Pre-miR-125a）片段克隆入真核表达质粒pSuper H1启动子下游,获得pSuper-miR-125a重组表达质粒,转染该质粒进入Hela细胞后能够在细胞内高效和特异的表达miR-125a,进一步证明pSuper真核表达质粒适合miRNA的表达研究。     

抗凝血酶基因C2759T(Leu99Phe)突变导致抗凝血酶缺陷症的分子机制研究

目的研究抗凝血酶(AT)基因C2759T(Leu99Phe)突变引起AT缺陷症的分子机制。方法用大引物法构建C2759T突变体AT重组表达质粒(ATM2759)，并将其和正常AT重组质粒(ATN)分别用Superfect试剂转染COS7细胞或CHO细胞，进行体外表达试验和细胞免疫荧光染色。、结果转染ATM2759的COS7细胞，培养上清液和细胞裂解液中的AT抗原(AT：Ag)分别为ATN的35．63％和174．97％，而培养上清液中的AT活性(AT：A)为ATN的47．73％。细胞免疫荧光试验证实，转染ATM2759的CHO细胞，其荧光强度明显高于转染ATN的CHO细胞。结论Leu99Phe 突变可能不是由于影响AT与肝素的结合而导致AT缺陷，而是由于突变导致AT分泌障碍和细胞内滞留所致。     

A gene therapy for cancer based on the angiogenesis inhibitor,vasostatin

The growth and persistence of solid tumors and their metastasis are angiogenesis-dependent. Vasostatin, the N-terminal domain of calreticulin inclusive of amino acids 1-180, is a potent angiogenesis inhibitor. To investigate whether intramuscular administration of vasostatin gene has the antitumor activity in mouse tumor models, we constructed a plasmid DNA encoding vasostatin and a control vector. Production and secretion of vasostatin protein by COS cells transfected with the plasmid DNA encoding vasostatin (pSecTag2B-vaso) were confirmed by Western blot analysis and ELISA. Conditioned medium from vasostatin-transfected COS cells apparently inhibited human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and mouse endothelial cell (SVEC4-10) proliferation, compared with conditioned medium from the COS cells transfected with control vector or non-transfected cells. Treatment with pSecTag2B-vaso twice weekly for 4 weeks resulted in the inhibition of tumor growth and the prolongation of the survival of tumor-bearing mice. The sustained high level of vasostatin protein in serum could be identified in ELISA. Angiogenesis was apparently inhibited in tumor by immunohistochemical analysis. Angiogenesis was also inhibited in the chicken embryo CAM assay and mouse corneal micropocket assay. The increased apoptotic cells were found within the tumor tissues from the mice treated with plasmid DNA encoding vasostatin. Taken together, the data in the present study indicate that the cancer gene therapy by the intramuscular delivery of plasmid DNA encoding vasostatin, is effective in the inhibition of the systemic angiogenesis and tumor growth in murine models. The present findings also provide further evidence of the anti-tumor effects of the vasostatin, and may be of importance for the further exploration of the application of this molecule in the treatment of cancer.     

遗传性铁粒幼细胞贫血致病的ALAS2基因表达载体的构建

X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血(XLSA)是红系特异性δ-氨基-γ酮戊酸合酶(δ-amionlevulinic acid syntase 2，ALAS2)基因突变造成的，本研究构建ALAS2基因的真核表达载体，观察表达栽体转染真核细胞后蛋白表达的情况。将获自人胎肝的ALAS2基因插入到红色荧光蛋白质粒pDs—red2-N1中，命名为pDs—red2-N1／ALAS2；采用电穿孔方法将质粒转染K562细胞；转染后48小时提取细胞总RNA，进行RT—PCR检测ALAS2基因表达；流式细胞术检测红色荧光蛋白表达。再采用脂质体方法将质粒转染COS7细胞，转染后72小时提取细胞总RNA，RT—PCR检测ALAS2基因表达，荧光显微镜观察COS7细胞红色荧光蛋白表达情况。结果表明：构建了一种pDs—red2-N1／ALAS2真核表达载体，提取质粒DNA经酶切、电泳可以看到在4700bp和1764bp处存在两条电泳条带；全长测序证实构建的栽体序列正确；质粒转染K562和COS7细胞后均出现阳性ALAS2基因转录产物：流式细胞术检测转染后K562细胞红色荧光蛋白表达的阳性细胞百分率为19．2％；荧光显微镜显示转染后COS7细胞红色荧光蛋白，表达高峰出现在转染后第3天，阳性细胞百分率为10．7％，并可持续表达10天左右。红色荧光蛋白的表达可以间接说明ALAS2基因的表达。结论：ALAS2基因的真核表达载体构建成功，可以通过电穿孔和脂质体的方法转染真核细胞中并在其胞浆中表达，有可能用于XLSA患者基因替代治疗。     

人心肌肌钙蛋白I的原核表达与纯化

目的构建人心肌肌钙蛋白Ⅰ（human cmdiac troponin I,hcTnI）原核表达载体并表达、分离纯化重组蛋白。方法RT-PCR从人心肌组织中克隆出hcTnI的cDNA序列构建到原核表达载体pQE30,获得重组表达质粒pQE30-hcTnI,并在大肠杆菌M15中诱导表达。镍凝胶亲和层析纯化目的蛋白,Western Blot杂交鉴定重组蛋白。结果经测序证实,获得的目的基因与（GeneBankM64247）公布的hcTnI基因序列一致。pQE30-hcTnI在大肠杆菌M15中经WFG诱导后表达出相对分子量约为29kD的目的蛋白,镍柱纯化后经抗hcTnI单克隆抗体进行Western印记,在相对分子量约29kD处可见特异性着色带。结论体外成功诱导了重组hcTnI蛋白表达,通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的hcTnI蛋白,为进一步获得hcTnI的抗体及建立相应的临床快速检测方法奠定了实验基础。     

丙型肝炎病毒E1基因在COS-7中的表达

目的：了解丙型肝炎病毒（HCV）E1基因在真核细胞中的表达情况。方法：采用基因重组技术，构建含HCVE1基因的重组表达质粒pEE1/HisC-E1，经酶切和PCR鉴定后，用脂质体转染法将重组质粒导入COS-7进行表达，经蛋白印迹实验鉴定表达产物。结果：重组表达载体pEF1/HisC-E1在COS-7中获得表达，表达的E1糖蛋白约29kD，具有抗原性，结论：HCVE1基因在真核细胞高效表达，为进一步研究HCVE1糖蛋白的生物学特性奠定基础。     

脊髓损伤修复相关10号基因编码蛋白与促甲状腺激素释放激素受体2的相互作用

背景：前期研究中,通过酵母双杂交系统筛选出可能与脊髓损伤修复相关10号基因（No10,SCIRR10）编码蛋白相互作用的蛋白质,其中含有促甲状腺激素释放激素受体2（thyrotropin releasing hormone receptor2,TRH R2）,而SCIRR10与TRH R2是否存在相互作用尚未阐明。目的：验证SCIRR10蛋白是否作用TRH R2受体,进一步确认TRH R2为SCIRR10蛋白受体,为下一步研究提供可靠实验证据。方法：应用RT-PCR方法扩增SCIRR10和TRH R2基因,构建带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白标签的真核重组表达质粒GFP-SCIRR10和RFP-TRH R2,分别转染真核细胞COS7,培养16h后,将表达SCIRR10-GFP的细胞培养液加入到表达受体TRH R2-RFP细胞中继续培养。4h后,用40g/L多聚甲醛固定细胞,于激光共聚焦显微镜下观察蛋白GFP-SCIRR10和蛋白RFP-TRH R2两者相互结合情况。结果与结论：在荧光条件下仅能观察到SCIRR10-GFP与TRH R2-RFP相互结合,而其他对照没有观察到类似现象。通过实验以及前期研究结果证实TRHR R2就是SCIRR10作用受体。