Toll样受体在U937细胞的表达及其作用研究

本研究探讨急性髓系白血病的免疫治疗中以Toll样受体（TLRs）为靶点的可能性,研究人急性髓系白血病U937细胞TLR的表达及TLR8受体激动剂ssRNA40/LyoVec对其增殖、凋亡和细胞周期的影响。运用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测U937细胞TLR1-9mRNA的表达,用流式细胞术检测TLR8的表达。用不同浓度的TLR8激动剂ssRNA40/LyoVec作用于体外培养的U937细胞后,采用CCK-8法检测细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期。结果表明：U937细胞表达TLR1-9,TLR8激动剂ssRNA40/LyoVec作用于U937细胞明显地抑制了U937细胞生长,抑制率可达70%,且呈明显的量效关系;作用后处于G0/G1期细胞比例由（44.67±1.05）%增高到（54.08±1.19）%,但凋亡细胞的比例无明显变化。结论：TLR1-9可在U937细胞中表达,TLR8激动剂ssRNA40/LyoVec具有抗肿瘤细胞增殖的作用,使细胞阻滞在G0/G1期,但无明显的促凋亡作用。     

手霉素通过线粒体凋亡途径诱导U937和HL-60细胞凋亡

目的 研究法尼酰基转移酶抑制剂手霉素（Manumycin）诱导白血病细胞凋亡的机制。方法 用2μmol／L手霉素处理白血病细胞系U937和HL-60细胞不同时间，用流式细胞术检测细胞凋亡。免疫印迹技术检测细胞色素C、caspase9、caspase8、caspase3的表达。用荧光染料JC-1检测法测定线粒体膜电位（Δψm），并用caspase抑制剂Z—VAD—fmk阻断caspase的活化，探讨caspase在手霉素诱导白血病细胞凋亡中的作用。结果 2μmol／L手霉素处理U937和HL-60细胞16h，Δψm显著下降，相对值分别是0．51±0．07和0．41±0．06（P〈0．01）。手霉素诱导细胞色素C从线粒体释放到细胞质，激活caspase-9、caspase8和caspase-3。50μmol／L的Z—VAD—fmk可完全阻断caspase激活，但仅部分阻断手霉素诱导的U937和HL-60细胞凋亡，细胞凋亡率分别减少51．69％和56．47％。结论 手霉素通过线粒体途径诱导U937和HL-60细胞凋亡。     

组蛋白H3K27甲基化抑制剂EPZ005687对U937细胞和正常骨髓CD34^＋细胞凋亡、增殖及细胞周期的影响

本研究目的在于探讨组蛋白H3K27甲基化抑制剂新药EPZ005687对白血病细胞系U937细胞和正常骨髓CD34＋细胞的凋亡、增殖抑制和细胞周期的影响。以不同浓度的EPZ005687作用于U937细胞,在不同时间点采用Annexin V/PI法检测细胞凋亡,WST-1法检测细胞增殖,7-AAD流式细胞术检测法检测细胞周期,免疫化学法检测H3K27组蛋白甲基化活性。结果表明：EPZ005687显著诱导U937细胞的凋亡,在0.5、1、5和10μmol/L浓度下作用于U937细胞48 h后,其凋亡率分别为3.96%±0.79%、5.74%±0.73%、13.34%±1.77%和25.24%±2.55%,而EPZ005687对正常骨髓CD34＋细胞的凋亡影响较小;在0.5、1、5和10μmol/L浓度下CD34＋细胞凋亡率分别为3.64%±0.62%、4.28%±0.99%、6.18%±1.19%和7.56%±1.34%;0.5、1、5和10μmol/L浓度的EPZ005687分别作用于U937细胞12 h至96 h,作用CD34＋细胞1至5 d,明显观察到EPZ005687显著抑制U937细胞的增殖且呈剂量依赖性,而对正常CD34＋细胞的增殖抑制并不明显。细胞周期分析显示,1μmol/L EPZ005687作用72 h可使U937细胞明显阻滞于G1期（64.18%±13.27%vs 49.43%±12.54%）,S期细胞比例明显下降低（9.67%±2.61%vs 15.26%±5.58%）,而正常CD34＋细胞因多数细胞位于G1期,S期细胞较少而不受其影响。进一步的H3K27组蛋白甲基化检测分析显示,EZP005687可明显地降低U937细胞的H3K27组蛋白甲基化,而不降低正常CD34＋细胞的H3K27组蛋白甲基化。结论：组蛋白H3K27甲基化抑制剂EPZ005687明显抑制U937细胞的增殖,诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞,但对正常造血细胞CD34＋影响较小,可作为一种潜在的血液肿瘤治疗药物应用于临床。     

血小板衍生膜微粒对人脐静脉内皮细胞增殖和凋亡的影响

本研究探讨血小板衍生膜微粒（platelet-derived membrane microparticles,PMP）对人脐静脉内皮细胞（hu-man umbilical vein endothelial cells,HUVEC）增殖和凋亡的影响。用不同浓度的凝血酶激活血小板释放出PMP,采用流式细胞术检测PMP的释放量,确定制备PMP时凝血酶的最佳应用浓度。以体外培养HUVEC为载体,通过噻唑蓝（MTT）实验和流式细胞术研究不同浓度的PMP对HUVEC增殖和凋亡的影响。结果表明,2、1.5、1.0和0.5U/ml凝血酶激活血小板后PMP的释放率分别为28.7、47.7、50.1和43.9%;HUVEC的增殖与PMP呈剂量依赖关系。在培养液中添加40μg/mlPMP时,HUVEC增殖是空白对照组的1.8±0.3倍;10μl/ml血管内皮细胞生长因子（VEGF）组的HUVEC增殖是空白对照组的1.9±0.5倍,两组之间无统计学差异,（p〉0.05）;PMP能抑制HUVEC的凋亡,40μg/mlPMP组的细胞凋亡率为（3.9±0.4）%,明显低于空白对照组的细胞凋亡率（9.4±0.5）%（p〈0.05）。VEGF（10μl/ml）对HUVEC细胞的凋亡无明显抑制作用,其凋亡率为（8.0±0.8）%。结论：用1U/ml的凝血酶刺激血小板释放的PMP较为均一,且释放量最大,可促进HUVEC细胞的增殖并抑制其凋亡。     

重组变构人TRAIL联合柔红霉素对白血病细胞诱导凋亡作用及其机制的研究

为了研究重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（recombinanat mutant human TRAIL, rmhTRAIL）单用及与柔红霉素（DNR）联合应用对白血病细胞株U937、K562的诱导凋亡作用及其机制，以正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5作对照，采用MTT法检测体外培养的U937、K562白血病细胞株在rmhTRAIL单用和联合DNR作用下增殖的抑制效应；用半定量逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法检测DNR处理前后白血病细胞TRAIL死亡受体和诱杀受体的mRNA表达水平。结果表明：rmhTRAIL对白血病细胞株U937、K562有较明显的抑制增殖作用，DNR与TRAIL联合对抑制肿瘤细胞具有协同性，与各药单独使用比较均有显著差异（P〈0．05）；经DNR作用后，U937、K562细胞的死亡受体DR4、DR5水平上调，而两种诱杀受体DcR1、DcR2表达未受影响。结论：在体外rmhTRAIL单用或与DNR联用均能明显抑制白血病细胞增殖，rmhTRAIL与DNR对白血病细胞的杀伤有协同作用。其诱导机制可能与U937、K562细胞死亡受体DR4、DR5表达水平上调有关。     

高三尖杉酯碱联合三氧化二砷诱导人急性髓系白血病U937细胞株凋亡的实验研究

目的:本探讨高三尖杉酯碱(HHT)联合三氧化二砷(As_2O_3)对人急性髓系白血病细胞株U937细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用及相关机制。方法:用四甲基偶氮唑(MTT)比色法检测不同浓度HHT及As_2O_3单用及联用对U937细胞增殖的影响;应用Annexin-V-FITC/PI双染流式细胞术检测二者单用或联用对U937细胞的凋亡诱导作用,Western blot方法检测U937细胞内P-Akt~(Ser473)、P-Akt~(Thr308)、BCL-XL、BID、MCL-1与P-MCL-1等蛋白的表达。结果:HHT和As_2O_3均可明显抑制U937细胞的增殖,诱导其凋亡,两药联合可明显增加U937细胞早期凋亡率,且两药联合作用后U937细胞P-Akt~(Ser473)、P-Akt~(Thr308)、MCL-1、P-MCL-1与BCL-XL蛋白表达明显下调,而BID蛋白表达无明显变化。结论:HHT与As_2O_3联合可通过抑制PI3K/Akt信号通路及下游MCL-1蛋白协同抑制U937细胞。     

正常人外周血淋巴细胞凋亡受体的表达与细胞凋亡的关系

本研究检测凋亡受体Fas、TNFRⅠ、TNFRⅡ在人外周血淋巴细胞（PBL）增殖过程中的表达情况及其细胞周期特异性,并探讨其与凋亡受体途径介导的细胞周期特异性细胞凋亡的关联性。应用双参数流式细胞术检测人外周血淋巴细胞在G0期和经植物凝集素刺激（PHA）进入细胞周期后Fas、TNFRⅠ、TNFRⅡ的表达情况以及细胞周期特异性,同时检测肿瘤坏死因子-α、抗Fas抗体诱导人外周血淋巴细胞的凋亡。结果表明：经植物凝集素刺激24小时后的外周血淋巴细胞Fas、TNFRⅠ、TNFRⅡ表达率较G0期外周血淋巴细胞分别增加了（35.55±6.63）%,（30.63±2.66）%,（26.62±5.14）%,均具有显著性差异（P〈0.01）,而且主要表达在G1期;未经植物凝集素刺激的外周血淋巴细胞停留在G0期,TNF-α和anti-Fas诱导后没有发生凋亡,而刺激后进入细胞周期的淋巴细胞经TNF-α和anti-Fas诱导后发生凋亡,其凋亡主要在G1期。结论：凋亡受体在外周血淋巴细胞中的表达与凋亡受体途径介导的细胞凋亡有明显的量效关系,凋亡受体途径介导细胞凋亡的细胞周期特异性与凋亡受体表达的细胞周期特异性有关,细胞凋亡的发生与细胞是否进入细胞周期有关。     

雷帕霉素对白血病细胞株的影响

本研究探讨雷帕霉素对白血病细胞株的增殖抑制作用及其对细胞周期的影响,并分析该药作用前后mTOR mRNA表达水平的变化。采用四唑氮蓝比色试验（MTT）观察雷帕霉素对白血病细胞株KG1、K562和U937的体外增殖抑制作用;应用流式细胞术（FCM）检测雷帕霉素干预后的白血病细胞株的细胞周期的阻滞情况;采用实时荧光定量PCR检测白血病细胞株的mTORmRNA表达。结果表明：不同浓度的雷帕霉素作用于KG1细胞株时,20nmol／L为最佳有效浓度,细胞被明显抑制,细胞周期阻滞在G0／G1期,细胞凋亡明显,mTORmRNA的表达水平亦显著降低。与雷帕霉素作用于KG1细胞株相比,雷帕霉素对K562和U937细胞株的作用相对较弱。结论：雷帕霉素与mTOR结合后可以抑制细胞增殖,KG1细胞株对雷帕霉素最为敏感。     

阿糖胞苷联合冬凌草甲素诱导U937细胞株凋亡的初步研究

目的:探讨阿糖胞苷联合冬凌草甲素诱导白血病细胞株U937凋亡的作用。方法:用阿糖胞苷和冬凌草甲素单药或两药联合处理U937细胞后,采用细胞计数检测细胞增殖,瑞氏染色观察细胞形态,流式细胞术分析细胞磷脂酰丝氨酸外翻情况和线粒体膜电位变化,蛋白印迹法检测凋亡相关分子表达情况。结果:阿糖胞苷和冬凌草甲素单药均能抑制U937细胞增殖,而两药联合抑制作用更加明显,两者能协同诱导U937细胞凋亡,并明显促进细胞磷脂酰丝氨酸外翻和线粒体跨膜电位下降;两药联合较单药组还能明显诱导Caspase-9、Caspase-3活化及PARP的剪切。结论:阿糖胞苷与冬凌草甲素能够协同抑制U937细胞增殖、诱导细胞凋亡,其机制可能是主要通过线粒体途径介导。     

CCL23/骨髓抑制因子1(MPIF-1)对于U937细胞的增殖、凋亡和分化的影响

CCL23/MPIF-1是人类趋化因子CC家族的一员,在血细胞中仅在单核细胞源的树突状细胞中持续表达,在体内和体外实验中对人、鼠的髓系祖细胞的增殖和分化均有明显的抑制作用。最近的研究发现,CCL23在儿童急性髓系白血病骨髓和外周血样本均有高表达。为了了解CCL23的高表达在白血病进展、治疗和预后中的意义,选用白血病细胞系U937细胞作为研究对象,加入人类重组CCL23培养72小时,用CCK-8试剂盒测细胞增殖,FITC-AnnexinV/PI法检测细胞凋亡率,并观察不同处理条件下细胞分化情况及CCL23受体CCR1的表达水平。结果发现：单独的CCL23对于U937细胞的增殖、凋亡和分化无明显作用（P〉0.05）;但在U937受PMA诱导分化的过程中,CCL23有明显的促分化作用,同时发现此过程中CCR1表达显著升高（P〈0.05）。结论：CCL23对U937细胞无明显抑制作用,但可能与PMA产生协同诱导分化作用,而且该作用的出现可能与CCL23受体CCR1表达升高有关。     

索拉非尼通过抑制WNT信号通路诱导白血病细胞株U937凋亡

本研究观察多激酶活性抑制药物索拉非尼对急性白血病细胞株U937细胞增殖活力的影响及诱导凋亡的作用,并探讨其可能的作用机制。以不同浓度的索拉非尼作用于U937细胞48小时后,使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞增殖活力变化;Annexin V/PI染色后通过流式细胞仪观察索拉非尼对U937细胞株的促凋亡作用;PI染色后利用流式细胞仪分析细胞周期中各期细胞比例变化;Western blot检测GSK-3β、β-catenin、Cyclin-D1蛋白表达变化。结果表明,同对照组相比较,索拉非尼以浓度依赖方式抑制U937细胞增殖,使细胞阻滞于G1/G0期并促进其凋亡(p<0.05)。Western blot检测结果显示,与索拉非尼处理前后相比,WNT通路中失活型GSK-3β蛋白、β-catenin及cyclinD1表达均下调,并呈现出浓度依赖性。使用GSK-3β抑制剂氯化锂上调失活型GSK-3β蛋白后仍得出同样趋势(p<0.05)。结论:索拉非尼通过减少WNT信号通路负向调节蛋白GSK-3β失活,进而下调β-catenin,cyclin-D1水平,使U937细胞阻滞于G1/G0期并促进其凋亡。     

六亚甲基二乙酰胺对急性白血病细胞株HL-60和U937分化、凋亡的影响及其机制

目的　研究六亚甲基二乙酰胺 (HMBA)体外诱导HL 6 0和U937细胞分化、凋亡的作用及其机制。方法　流式细胞仪检测细胞分化抗原CD1 1b、CD1 4,细胞凋亡标记Annexin Ⅴ以及进行细胞周期分布和细胞内cyclinD、cyclinE、p2 7抗原的分析 ,RT PCR检测c myc、Rb、Bcl 2基因mRNA的表达。结果　HL 6 0、U937细胞经HMBA处理 72h后CD1 1b表达显著增高 ,高剂量HMBA促使Annexin Ⅴ表达增加。HMBA阻滞HL 6 0、U937细胞于G0 G1 期 ,并使该两种细胞内cyclinE表达显著下降 ,cyclinD、p2 7表达显著增高 ,呈剂量依赖关系 ;HMBA可使HL 6 0、U937细胞c myc、Bcl 2mRNA表达下调 ,而RbmRNA在HL 6 0细胞表达上调 ,在U937细胞则无显著改变。结论　HMBA能诱导HL 6 0、U937细胞出现明显的分化 ,高剂量的HMBA有促使HL 6 0、U937细胞凋亡的倾向 ,其机制可能是通过影响细胞周期调控分子以及有关的增殖分化相关基因的表达 ,从而抑制细胞增殖 ,促进细胞分化。     

Sensitivity of myelomonocytic leukemia cells to arsenite-induced cell cycle disruption, apoptosis, and enhanced differentiation is dependent on the inter-relationship between arsenic concentration, duration of treatment, and cell cycle phase

Arsenite treatment has been found to induce clinical remission in patients with acute promyelocytic leukemia. Although the potential therapeutic value of arsenite may lie in triggering apoptosis, it has not been established that cytotoxicity is the sole mechanism of action. We have used a myelomonocytic leukemia cell line (U937) to characterize the concentration-dependent effects of arsenite on cell growth, viability, apoptosis, and differentiation. Arsenite has multiple effects on U937 cells. Low concentrations of arsenite (i.e., < or = 1 microM) potentiate vitamin-D(3)-induced differentiation. Two markers of monocyte differentiation, Mac-1 expression and nitroblue tetrazolium reduction, are increased in arsenite-exposed, D(3)-costimulated cells. Concentrations of arsenite >10 microM rapidly induce the death of cells irrespective of cell cycle phase. Intermediate concentrations of arsenite (i.e., 5 to 10 microM) are cytostatic initially. Cell cycle analysis using elutriated, synchronous cell populations revealed that intermediate concentrations of arsenite delay both G(1) and G(2) transit. G(2) cells appear to be most sensitive to arsenite, in that transit through G(2)/M is more delayed than transit through G(1), and apoptosis is induced in these cells as they emerge from an aberrant G(2)/M. Arsenite-induced apoptosis was caspase-3 dependent. Arsenite-mediated cytotoxicity was reduced in the presence of the broad caspase inhibitor Z-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone; however, caspase inhibition did not reverse arsenite-induced cytostasis. Thus, arsenite has multiple effects on U937 cells that are dependent on concentration and cell cycle phase. Specifically, cell cycle transit and differentiation are more sensitive to arsenite than is the induction of apoptosis.     

p73基因在甲氨蝶呤诱导髓性白血病细胞系U937细胞凋亡过程中的表达

为了探讨甲氨蝶呤（MTX）诱导U937细胞凋亡过程中p73 mRNA的表达变化，用MTX诱导U937细胞凋亡，凋亡指标采用细胞形态学、DNA片段电泳、流式细胞术检测DNA含量及细胞周期的变化等方法；采用半定量反转录PCR（RT－PCR）检测p73 mRNA的表达变化。研究结果显示：MTX可诱导U937细胞凋亡。5μmol/L的MTX作用于U937细胞6小时，可见部分细胞体积缩小，染色质明显浓缩和核碎裂。DNA片段电泳，MTX处理组可见清晰的梯形条带。流式细胞仪检测发现MTX作用于U937细胞，6，8，10小时，细胞的凋亡率分别为5．15％，11．43％和14．7％，并使细胞阻滞在G2／M＋S期，而对照组细胞不发生凋亡。半定量RT－PCR结果显示在U937细胞凋亡前后，p73 mRNA的表达无明显变化。结论提示，在MTX诱导U937细胞凋亡过程中，p73的mRNA水平表达差异无显性。     

苯丁酸钠通过上调p21 WAF1/CIP1基因抑制白血病细胞系的细胞周期

目的研究组蛋白脱乙酰化酶(HDAC)抑制剂苯丁酸钠(PB)对白血病细胞系细胞周期的影响,探讨其分子机制.方法PB处理白血病细胞系Kasumi-1、U937和NB4细胞,分别于处理后24,48和72 h收集细胞.碘化丙锭DNA染色,流式细胞术分析细胞周期的变化.半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析细胞周期相关基因p21WAF1/CIP1表达的变化.在人肾上皮细胞系293T细胞用荧光素酶报告基因分析PB对p21WAF1/CIP1基因启动子活性的影响.结果PB可以抑制Kasumi-1、U937和NB4细胞的细胞周期,作用呈时间和剂量依赖关系.3 mmol/L PB作用72 h,分别使Kasumi-1、U937和NB4细胞的G0/G1期细胞比例增加42.03%、44.36%和26.82%,S期细胞比例减少31.86%、38.91%和26.77%.PB使Kasumi-1、U937和NB4细胞p21WAF1/CIP1表达增高.PB处理后,p21WAF1/CIP1的表达水平较处理前增高(2.06±0.27),(2.78±0.40)和(1.78±0.20)倍.PB可以上调p21WAF1/CIP1启动子的转录活性,且呈剂量依赖关系.3 mmol/L PB处理48 h使转录活性增高(5.74±0.93)倍.PB上调p21WAF1/CIP1启动子转录活性主要是依赖于转录起始位点上游101 bp的序列.结论PB可以抑制白血病细胞系的细胞周期,这种作用可能是通过上调细胞周期相关基因p21WAF1/CIP1的表达实现的.     

ZSTK474对U937细胞抗白血病活性的研究

目的:探讨PI3K抑制剂ZSTK474对人白血病细胞U937抗白血病的活性.方法:采用MTT、软琼脂克隆形成、流式细胞术、Western blot检测ZSTK474对U937细胞增殖、致瘤性、周期分布、凋亡、PI3K/AKT信号通路中重要因子磷酸化水平的影响;采用Chou-Talalay法检测ZSTK474与Cytar...     

U937细胞与骨髓间充质干细胞黏附培养后凋亡基因表达谱的研究

目的比较 U937细胞与人骨髓间充质干细胞(MSC)黏附培养前后凋亡相关基因表达谱的变化,寻找白备病耐药与造血微环境的关系。方法 U937细胞分别悬浮培养和与 MSC 黏附培养48h,以流式细胞术测定细胞周期。采用基因表达谱芯片技术测定并分析黏附培养组与悬浮培养组间凋亡基因表达的差异。结果 U937细胞黏附培养与悬浮培养48h,G_0/G_1期细胞分别为(45.3±3.1)%和(32.6±2.1)%(P<0.05),G_2/M 期细胞分别占(2.7±0.3)%和(14.3±1.4)%(P<0.01),自然凋亡率分别为(18.4±1.5)%和(23.4±1.9)%(P<0.05)。在487个凋亡相关候选基因中,筛选出28个明显差异表达基因,上调基因27个,主要分类为凋亡抑制基因、促凋亡基因、细胞周期正调控基因及细胞周期负调控基因等,但以 Bcl-XL 上调最明显。1个下调基因是促凋亡基因。结论与MSC 黏附培养可导致 U937细胞生长抑制,自然凋亡率下降,其机制是多种基因作用的结果,但最主要的可能是 Bcl-XL 凋亡抑制基因上调。