TTV研究的新进展

1引言 1997年12月日本学者Nishizawa等[1]采用代表性差异分析法（representational difference analysis,RDA）从1例输血后非甲-庚型肝炎病人血清中获得一种新的DNA病毒克隆（N22）。他们将该病毒克隆DNA序列与基因库中已登记的序列比较,未发现相同或相似的基因序列,证明是一种新的病毒。近几年来,对于这种新病毒,医学学者和工作者在发现初期不甚了解,逐步在TTV的基因结构、与肝炎的关系、传播途径、致病性、对其进行尝试性治疗     

母体血循环中胎儿游离DNA的检测

目的寻找一种无创性产前基因检测孕妇血浆中胎儿游离DNA的新方法。方法提取32名健康孕妇血浆标本中胎儿游离DNA，经套式聚合酶链反应（PCR）扩增其性别决定基因（sex-determiningregion Y，SRY），并引入内参照基因序列ArrLl；并采用16个短串联重复序列（shorttandemrepeat，STR）多态性位点的多重荧光PCR方法对血浆标本中DNA进行STR等位基因扩增。同时，检测孕妇及其丈夫的外周血白细胞DNA，进行基因扫描及对照分析。结果经SRY-PCR检测发现，17名妊娠男胎孕妇血浆中均出现基因扩增带，其余15名妊娠女胎孕妇中有2名出现假阳性，性别总符合率为94％（30／32）。经STR-PCR检测发现，均从孕妇血浆中检测出父源性胎儿DNA的存在。结论应用孕妇血浆中胎儿DNA作产前诊断准确性较高，是一种无创性产前基因诊断方法，具有广泛的临床应用前景。     

杀菌蛋白rBPI23与haFGF融合基因及真核表达质粒的构建

目的利用克隆人杀菌／通透性增加蛋白（rBPI23）和人酸性成纤维细胞生长因子（haFGF）cDNA,构建BF融合基因和真核表达载体,为能制备既能杀菌又能促进创伤愈合的双功能多肽创造条件。方法从人中性粒细胞和人胎脑组织中提取mRNA,经逆转录聚合酶链式反应（RT—PCR）分别获得rBPI23和haFGF编码序列的eDNA,运用重组PCR技术将两段基因通过一疏水性多肽接头（Gly4Ser）3DNA序列进行体外基因重组,合成融合基因,并将其梅建于真核表达载体peDNA3．1（＋）中。结果所扩增的rBPI23和haFGFCDNA序列与Genebank中报道的rBPI23、haFGFCD-NA序列一致。构建的BF融合基因及真核表达质粒DNA序列,经测序分析,与设计序列符合率为100％。结论本研究结果为进一步探讨BF融合蛋白的表达、生物学活性和特性奠定了基础。     

心肌损伤修复实验指标：MyoD基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：MyoD基因是肌肉转录因子家族成员之一，转染MyoD基因可以启动肌分化过程，使非肌细胞转变为肌细胞。MyoD基因仅在骨骼肌表达，基于心肌细胞和骨骼肌细胞有相同的收缩装置，可以设想将外源MyoD基因诱导坏死心肌局部的成纤维细胞向具收缩功能的骨骼肌细胞转化，可能会成为临床治疗心衰的又一种方法。目的：构建和鉴定MyoD基因重组腺病毒载体，为研究MyoD对心肌损伤的修复作用提供试验基础。设计：单一样本实验。单位：南京医科大学第一附属医院心脏科。材料：实验于2004-09／2005-09在南京医科大学微生物学与免疫学实验室完成。以MyoD基因和非复制型腺病毒表达载体为研究对象。方法：从pEMSV—MyoD质粒上用聚合酶链反应法扩增出MyoD cDNA片段，再通过聚合酶链反应使MyoD基因加上CACC序列接头，经过定向拓扑克隆使目的基因连接到转移载体上，再通过LR酶促反应，将目的基因转移到腺病毒表达载体DNA上，获得MyoD基因重组的腺病毒DNA，用脂质体转染法转染HEK293A细胞，包装扩增出MyoD基因重组的腺病毒。主要观察指标：聚合酶链反应鉴定和DNA测序来证实MyoD cDNA片段大小和序列的正确性，并测定病毒滴度。结果：经聚合酶链反应鉴定和DNA测序证实MyoD基因重组腺病毒含大小正确的目的片段，其DNA序列正确。病毒滴度为1．3&;#215;10^11pfu／mL。结论：成功构建了MyoD基因重组腺病毒载体。     

糖尿病的基因治疗技术：大鼠胰岛素原基因真核细胞表达质粒构建与鉴定

目的：构建大鼠胰岛素原基因的真核细胞表达质粒pCMV／proinsulin并进行序列测定。方法：实验选用雄性SD大鼠1只，从大鼠胰腺组织中提取总RNA，通过RT-PCR法获得胰岛素原基因cDNA全长序列，并采用现代分子生物学技术，借助真核细胞表达质粒pCMV-Script vector具有多克隆酶切位点的特点，选择适当的限制性酶切位点(EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ)，并使大鼠胰岛素原基因cDNA两端带有相同的酶切位点，利用其黏性末端进行定向克隆，从而将大鼠胰岛素原基因准确地插入到表达质粒pCMV上。结果：经RT-PCR法扩增并通过DNA核酸序列测定获得大鼠胰岛素原基因。经PCR法及酶切法初步筛选阳性克隆重组子，并进一步进行DNA核酸序列测定(双脱氧末端终止法)，确定其序列与目的基因序列完全一致。结论：成功构建重组质粒pCMV／proinsulin，为进一步进行胰岛素原基因转染糖尿病大鼠和非胰岛β细胞，使之产生胰岛素、建立类胰岛β细胞系的研究奠定了扎实的基础。     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。目的：构建并鉴定脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体。方法：针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。结果与结论：PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景:慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率.目的:构建并鉴定脯氨酰羟化酶 RNA 干扰慢病毒载体.方法:针对脯氨酰羟化酶2 基因序列设计RNA 干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pGCSIL-GFP 连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA 干扰慢病毒表达载体,PCR 筛选阳性克隆,测序鉴定.结果与结论:PCR 和DNA 测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA 慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP 载体.说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA 干扰慢病毒载体.     

蛋白转导结构域-bcr/abl融合基因的构建和表达

目的 构建含蛋白转导结构域（PTD）与慢性粒细胞白血病（CML）bcr/abl融合基因片段的质粒，并在大肠杆菌中表达。方法 PCR扩增的CML bcr/abl基因片段，经DNA测序后，与合成编码PTD的DNA片段一起手稿质粒pET-16b，构建表达载体pEPb，转化大肠杆菌并进行了PTD－bcr/abl蛋白的诱导表达和纯化。结果 跨越bcr/abl断裂点的523bp的目的片段被有效地扩增，DNA序列分析表明所构建的含PTD－bcr/abl融合基因的质粒与设计相同。PTD－bcr/abl融合蛋白在转化大肠杆菌获得了高效表达并纯化。结论 成功地获得了PTD－bcr/abl融合蛋白片段的基因表达产物，为进一步研究CML的免疫治疗奠定了基础。     

乙型肝炎病毒基因分型的研究进展

乙型肝炎病毒（HBV）是嗜肝DNA病毒，HBV感染可引起严重肝脏疾病，HBV感染后细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞免疫反应导致受感染的肝细胞破坏，由于宿主免疫应答不同，因而临床上表现为不同的疾病谱。我国是HBV感染的高发区，慢性乙型肝炎是我国肝硬化、肝功能衰竭和原发性肝癌的主要危险因素。近来，人们逐渐认识到慢性乙型肝炎与病毒本身核酸序列密切相关。随着HBV全基因序列克隆成功，不同HBV基因结构必然影响病毒蛋白的表达，不同HBV基因亚型有不同的流行特征及致病性。因此，对HBV进行基因分型有利于对HBV感染的流行病学、病因学和临床诊治进行更加深入的研究。     

骨形成发生蛋白-7成熟肽基因克隆及序列测定

目的：克隆人骨形态发生蛋白-7成熟肽基因。方法：根据Genebank人骨形态发生蛋白-7基因序列合成两条引物，从培养的人胎儿软骨细胞中提取mRNA，利用bnestep RT—PCR技术扩增出人骨形态发生蛋白-7成熟肽的基因序列，将PCR扩增产物基因片段连接克隆载体质粒中转化大肠杆菌DH5a进行克隆筛选鉴定及测序。结果：琼脂糖凝胶电泳检测RT—PCR产物显示-长约456bp的条带，阳性克隆质粒经双酶切可切出约456bp的片段，DNA测序结果与Genebank中的序列相符。结论：利用RT—PCR技术可成功的从人胎儿软骨细胞中克隆出人BMP-7成熟肽基因。