旋毛虫肌幼虫体外生存状况实验研究

目的观察旋毛虫肌幼虫在干燥和生理盐水环境中的生存状况。方法90只昆明小鼠被随机分为正常对照组、生理盐水组和干燥组,生理盐水组和干燥组分别再分为4组,共9组,每组10只。正常对照组每鼠经口感染200条收集的肌幼虫。生理盐水组分为4组：①肌幼虫0℃放置10 d,②肌幼虫20℃放置10 d,③肌幼虫0℃放置20 d,④肌幼虫20℃放置20 d;干燥组分组与生理盐水组相同。然后将8组小鼠每鼠经口感染200条处理的肌幼虫。感染后30 d处死小鼠,取膈肌压片镜检,并将全部肌肉人工消化后计数幼虫数。结果在生理盐水和干燥环境中放置10 d的肌幼虫分别感染小鼠后,压片法和人工消化法镜检,感染小鼠的幼虫检出率均为100%;在生理盐水和干燥环境中放置20 d的肌幼虫分别感染小鼠后,两种方法镜检,感染小鼠均未检出幼虫。结论在生理盐水和干燥环境中,肌幼虫能生存较长时间,但不超过20 d。     

亚硝基铁氰化钠处理的弓形虫速殖子的超微结构特征

目的 观察一氧化氮（NO）供体亚硝基铁氰化钠（SNP）处理的弓形虫速殖子的超微结构特征。方法 应用透射电镜观察SNP处理的速殖子的超微结构。结果 发现SNP处理的速殖子大部分具有凋亡的典型形态学特征：核染色质凝集,核固缩,核碎裂,凋亡小体形成（个别速殖子形态表现为胀亡细胞、溶解性坏死细胞和坏死型凋亡细胞特征）。结论 从形态学上证明NO供体SNP可诱导弓形虫速殖子凋亡及坏死。     

旋毛虫成虫、新生幼虫和肌幼虫抗原的保护性免疫研究

目的：比较旋毛虫成虫抗原和肌幼虫抗原接种小鼠诱导产生的保护性免疫。方法:检查肠道成虫、肌幼虫和血液中嗜酸性细胞数;用ELISA测血清中抗旋毛虫肌幼虫IgG抗体滴度。结果：成虫、新生幼虫和肌幼虫抗 免疫组的成虫减虫率分别为82.19％、72.31％和42.88％;肌幼虫减虫率分别为68.83％、78.19％和51.96％。血清IgG抗体滴度明显升高,成虫、新生幼虫和肌幼虫抗原免疫组的GMRT分别为对照组的7.46倍、5.28倍和4.92倍。血液嗜酸性粒细胞明显增多。结论：旋毛虫成虫抗原、新生幼虫抗原均为激发特异性液免疫和细胞免疫,诱导小鼠对攻击感染产生保护性。其中,成虫抗原和新生幼虫抗原显示出更好的免疫原性,而成虫抗原有可能成为较理想的免疫疫苗来源。     

旋毛虫肌幼虫在实验感染兔横纹肌内的分布

观察了旋毛虫肌幼虫在实验感染兔横纹肌内的分布 ,在舌肌中荷虫密度最高 ,顺次是咬肌、膈肌、肱三头肌、肩胛肌、肱二头肌、腓肠肌、胸大肌、肋间肌、腰肌 ,心肌中未发现幼虫 ,提示检查兔的舌肌、咬肌或膈肌发现肌幼虫的阳性率高。     

白酒对鼠体旋毛虫幼虫的杀伤作用

目的观察白酒对鼠体旋毛虫幼虫的杀伤作用。方法80只昆明小鼠,各喂食含500条旋毛虫幼虫的肌肉后随机分成8组(10只/组),实验组分别灌饲0.2ml或0.4ml乙醇体积分数为0.62、0.54和0.46的白酒,对照组灌饲相同体积的生理盐水。7d与40d后各剖杀5只,检查肠道旋毛虫成虫和肌幼虫数。结果灌饲0.2ml乙醇体积分数为0.62、0.54和0.46的白酒的小鼠肠道成虫数分别为(80.00±11.25)条、(208.00±22.89)条及(256.00±69.37)条,肌幼虫数分别为(37993.60±296.50)条、(54166.60±2951.98)条和(63808.40±2442.81)条,灌饲0.4ml乙醇体积分数为0.62、0.54和0.46的白酒的小鼠肠道成虫数分别为(21.00±11.83)条、(87.00±27.66)条及(112.00±25.38)条,肌幼虫数分别为(24691.20±4628.14)条、(47266.60±1955.49)条及(50833.40±2211.50)条,生理盐水对照组分别为(312.00±76.93)条和(81050.00±13157.74)条,差异有统计学意义(P均0.05)。灌饲白酒的感染鼠肠道成虫与肌幼虫数均随乙醇灌胃量的增大而减少(P均0.05)。结论白酒对鼠体内旋毛虫的杀伤作用与乙醇含量有关,小鼠灌饲白酒可降低旋毛虫感染程度。     

旋毛虫肌幼虫在不同培养基中发育情况的观察

目的观察旋毛虫肌幼虫在不同培养基中的发育情况。方法将旋毛虫肌幼虫接种在不同培养基中于37℃5%CO2条件下培养18 d,观察幼虫开始蜕皮的时间和蜕皮率,并测量幼虫长度。结果肌幼虫在RPMI-1640、含5%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液、PBS和生理盐水中开始蜕皮的时间分别为15、23、19和37 h;肌幼虫在RP-MI-1640与5%FBS+RPMI-1640中分别蜕皮1~4层和1~2层,在PBS与生理盐水中仅蜕皮1层。培养5 d后,RP-MI-1640中培养幼虫的蜕皮率(77.94%)显著高于在其他3种培养液培养的幼虫蜕皮率(39.83%、44.64%和8.84%)(Z1640+5%FBS=-2.268,ZPBS=-2.641,Zsaline=-6.826,P0.05);培养18 d后,在RPMI-1640中蜕2~4层皮的幼虫蜕皮率(25.6%、1.32%及0.26%)显著高于在5%FBS+RPMI-1640中培养的幼虫蜕皮率(0.45%、0和0)(Z2=-16.111,Z3=-7.991,Z4=-3.885,P0.05);在2种培养液中培养1~18 d的幼虫长度差异无统计学意义(t=0.138,P0.05),幼虫长度均随培养时间的延长而减小(F1640=54.639,P0.05;F1640+5%FBS=26.928,P0.05)。结论绝大多数旋毛虫肌幼虫在RPMI-1640与5%FBS+RPMI-1640培养液中不能蜕下完整表皮,不能发育到成虫阶段。     

旋毛虫肌幼虫囊包标本的复染制作方法

本研究采用单染和复染两种方法对旋毛虫肌幼虫囊包标本进行染色。单染方法:制片经甲醛、乙醇和冰醋酸溶液固定,用乙醇硼砂卡红染色液(4%硼砂水溶液100 ml,卡红1 g,70%乙醇100 ml)染色。复染方法:制片经甲醛、乙醇和冰醋酸溶液固定,用乙醇硼砂卡红染色液和固绿染色液(固绿0.1 g,95%乙醇100 ml)染色。结果显示,单染标本,囊包与周围肌细胞着色无明显差别,结构不清晰,不易观察,囊内幼虫可辨认。复染标本,囊包结构清晰;囊内幼虫、囊包和肌细胞呈不同的颜色,囊包梭形显著,囊内幼虫特征典型。与单染标本相比,复染标本着色适度,染色效果好,易于观察。     

旋毛虫肌幼虫囊包不染色标本的制作

在医学寄生虫学实验教学中,制作旋毛虫肌幼虫囊包标本通常采用染色封制法,梭形囊包明显,但如果分色过程掌握不好,虫体轮廓不清。作者尝试制作旋毛虫肌幼虫囊包不染色封制标本,用于教学实践取得良好效果。介绍如下。 旋毛虫肌幼虫囊包取自感染旋毛虫幼虫的猪横纹肌。操作工具:眼科剪,眼科镊,载玻片,大瓶皿,显微镜,吸管,玻片标本盘等。试剂:甲醛,蒸馏水,乙醇,水杨酸甲酯,中性树胶。 将感染旋毛虫幼虫的肌肉剪成碎块,夹在两张载玻片之间,轻轻加压、捆扎,置于10％甲醛固定12～24 h。解开载玻片后再浸泡1～2h,充分固定。倾去甲醛,用蒸馏水洗3次,每     

旋毛虫肌幼虫在感染小鼠体内的分布

目的观察旋毛虫肌幼虫在感染小鼠体内不同部位横纹肌内的分布和密度。方法分别取感染旋毛虫小鼠的舌肌、咬肌、胸肌、腹肌、前肢肌、后肢肌、膈肌和背肌各50mg,肌肉压片镜检。结果膈肌幼虫密度最高,其次为舌肌、胸肌;前肢肌、后肢肌、咬肌、背肌幼虫密度无明显差异,均低于胸肌,腹肌幼虫密度最低。结论感染旋毛虫的小鼠从膈肌取材,检出肌幼虫的阳性率较其他部位高。     

酒精对旋毛虫感染性幼虫杀伤作用的实验研究

目的研究酒精对旋毛虫感染性幼虫的杀伤作用。方法在体外模拟胃内环境条件下,旋毛虫肌幼虫用不同浓度酒精处理不同时间后用美蓝-伊红-硼砂(M.E.B.)染液鉴定肌幼虫的死活;将酒精处理后的肌幼虫经口接种小鼠,观察幼虫在小肠中发育为成虫的数量及生殖力。结果肌幼虫在酒精中的存活时间随酒精浓度的升高而缩短,肌幼虫在45°酒精中30min的死亡率为100%(96/96),而肌幼虫在65°酒精中10min的死亡率为100%(90/90)。肌幼虫用30°、25°、20°酒精分别处理2h、4h、4h时,染色法表明幼虫的存活率分别为57.6%(76/132)、98.6%(70/71)及100%(136/136),但接种小鼠后未在小肠和肌肉中发现成虫和幼虫;含幼虫的小鼠肌肉经35°、30°、25°酒精处理0.5h、2h、4h后接种小鼠,从小肠和肌肉中亦未回收到虫体。结论20°以上酒精对旋毛虫肌幼虫有较强的杀伤作用,虽然酒精处理后的肌幼虫仍是活的,但已丧失了感染性。结果提示,生食或半生食肉类及肉制品时适量饮用白酒对预防旋毛虫感染有一定作用。     

外源性一氧化氮对旋毛虫感染小鼠抗氧化能力的影响

目的探讨外源性NO供体亚硝基铁氰化钠(SNP)对旋毛虫病小鼠肝脏、外周血中抗氧化酶活性及脂质氧化的影响。方法采用消化法分离旋毛虫肌幼虫,感染BALB/c小鼠,400条/只。42 d后,收集感染鼠及正常小鼠外周血、肝脏。设A组(感染鼠肝脏匀浆物+SNP)、B组(正常鼠肝脏匀浆物+SNP)、C组(感染鼠外周血+SNP)、D组(正常鼠外周血+SNP)。每组内设5个SNP反应终浓度,分别为0(空白对照)、2、5、10、30μmol/L,37℃反应30 min,测定各组超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及脂质氧化(MDA)含量。结果与正常鼠相比,旋毛虫感染鼠肝脏、外周血中SOD、CAT、GSH-Px活性上升,MDA含量增加,差异均有统计学意义(P均0.05);在A、B组中,10、30μmol/L SNP作用下SOD、CAT、GSH-Px活性较空白对照降低(P均0.05);与2~30μmol/L SNP反应后,MDA含量较空白对照明显升高(P均0.05)。在C、D组中,30μmol/LSNP作用下SOD、CAT、GSH-Px活性显著下降,MDA浓度升高,与空白对照比较差异均有统计学意义(P均0.01)。在2~30μmol/L浓度区间,SNP浓度与旋毛虫感染鼠肝脏、外周血中SOD、CAT、GSH-Px活性呈负相关(r肝SOD=-0.901,r肝CAT=-0.802,r肝GSH-Px=-0.847,r血SOD=-0.899,r血CAT=-0.685,r血GSH-Px=-0.635,P均0.05),与MDA含量呈正相关(r肝MDA=0.697,r血MDA=0.764,P均0.05)。结论旋毛虫感染可致小鼠肝脏、外周血中活性氧自由基产生增加,SOD、CAT、GSH-Px活性升高;外源性NO可降低旋毛虫感染小鼠SOD、CAT、GSH-Px活性,抑制小鼠的抗氧化能力。     

人工消化法检验旋毛虫效果及其对肌幼虫的影响

目的观察人工消化法检验旋毛虫的效果及对肌幼虫活性、感染性的影响。方法将小鼠感染100条肌幼虫后30 d剖杀,分别应用3组消化法检验,即：消化2 h组（磁力搅拌法）、消化12 h组、消化20 h组,每组取肉样10份,每份含300个囊包,消化后分别计数每份肉样的幼虫数;同时对幼虫活性进行观察。40只昆明小鼠随机分为对照组和3个消化组（消化2、12、20 h组）,共4组,每组10只。对照组：每鼠感染100个囊包;消化组：将3组方法收集的幼虫分别感染小鼠,每鼠经口感染100条幼虫。感染后30 d剖杀,取膈肌压片镜检,并用磁力搅拌法收集幼虫、计数。结果消化2、12、20 h组的幼虫检出率分别为78.47%、76.73%、68.63%,死亡率分别为0.59%、4.60%、7.43%。3组收集的幼虫分别感染小鼠,30 d后剖杀,与对照组相比,消化2、12、20 h组的减虫率分别为60.56%、61.94%、73.07%。结论磁力搅拌法（消化2 h）在幼虫检出率、幼虫活性、幼虫感染性等方面均优于消化12、20 h实验组,为进行旋毛虫检验和动物实验,优先选择的方法。     

旋毛虫肌幼虫囊包染色标本制作方法的改进

目的探讨旋毛虫肌幼虫囊包染色标本的制作方法。方法采用醋酸卡红染色法制作旋毛虫肌幼虫囊包标本。结果醋酸卡红染色的标本,囊包轮廓清晰,囊内幼虫透明度及清晰度高,体态自然,立体感较强。结论醋酸卡红染色可用于旋毛虫肌幼虫囊包永久标本的制作。     

旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期排泄分泌产物iTRAQ法蛋白质组学分析

目的探究旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期排泄分泌产物(ESP)中的差异蛋白,分析两者免疫抑制差异的原因和参与包囊形成的潜在功能蛋白。方法收集旋毛虫和伪旋毛虫ESP,采用二喹啉甲酸检测法测定旋毛虫、伪旋毛虫ESP蛋白浓度,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白质量,对经过超滤管酶解法酶解后的ESP多肽段采用同位素相对定量和绝对定量标记技术(iTRAQ)标记,混合标记后的样品进行液相分离高pH反相色谱和液相串联质谱检测。检测完成后,搜索UniProt数据库中的旋毛虫(Trichinella spiralis)和伪旋毛虫(Trichinella pseiudospiralis)数据库,在可信蛋白(得分80以上)的基础上筛选同源蛋白,比较同源蛋白的差异表达情况。利用QuickGO对差异蛋白进行标准化描述。选取9个差异明显的重要蛋白进行实时荧光定量PCR验证,采用△△Ct法验证基因表达水平。采用SPSS 19.0软件进行统计学分析结果经iTRAQ标记鉴定出旋毛虫可信蛋白492个,伪旋毛虫535个,可用于定量分析的旋毛虫蛋白193个,伪旋毛虫蛋白164个。旋毛虫/伪旋毛虫同源比对结果显示,表达蛋白上调162个,下调31个。GO分析结果显示,分子功能主要富集在离子结合功能、肽酶活性、氧化还原酶活性和核酸酶活性,分别为45、18、12和8个。在生物过程中,涉及最多的是小分子代谢过程(15个),碳水化合物代谢过程(12个),生物合成过程(12个),DNA代谢过程过程(8个)。差异蛋白涉及的细胞组成成分主要为细胞质和含蛋白质的复合物。KECG分析显示,与硫胺素代谢,鞘糖脂生物合成,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成相关的蛋白大部分上调。plancitoxin-1(E5SXW8)、胰蛋白酶(E5SPA7)、胱抑素(E5S387)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(E5SJH4)、5’-核苷酸酶(E5S554)、烯醇酶(E5SQX1)、L-天冬酰胺酶(E5SBA6)蛋白表达和基因转录水平在旋毛虫肌幼虫时期均高于伪旋毛虫(P<0.05);热休克蛋白β-1 (E5RZQ6)、组蛋白H2B (E5S7K8)蛋白表达和基因表达水平在旋毛虫肌幼虫时期低于伪旋毛虫(P<0.05)。结论旋毛虫和伪旋毛虫肌幼虫时期ESP差异蛋白生物信息学分析提示丝氨酸蛋白酶、胱抑素、plancitoxin-1和14-3-3蛋白等可食能与包嚢形成和免疫调节相关。     

The measurement of antigens released by radiation-attenuated Trichinella spiralis larvae

Summary A radioimmunoassay has been developed that uses antisera raised to different excretory-secretory antigens of infective larvae of Trichinella spiralis (LESA) to measure accurately the output of these antigens following gamma irradiation at doses from 10 to 120 Krads. In the lower range (up to 20 Krads) irradiation results in the increased export of antigens to the culture supernatant in a subsequent 3 h period, without obvious or gross damage to the worms. Higher doses (> 40 Krads) suppress antigen release over the same period compared with the activity of untreated (control) cultures. This work makes two contributions. It describes a sensitive assay system which detects and measures parasite antigens that may be important both in protection and in serodiagnosis, and it offers for the first time an explanation for the special properties of the lower dose range larval irradiation-attenuated vaccine in inducing a high degree of reinfection resistance, as reported in older literature and recently confirmed by us.