日本血吸虫脂肪酸结合蛋白DNA疫苗诱导小鼠保护性免疫力的研究

目的构建日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(Sj14FABP)重组质粒,并观察其在小鼠体内诱导的抗日本血吸虫感染保护作用。方法RT-PCR特异性扩增Sj14FABP基因,将其克隆入真核表达载体pVIVO2,通过PCR、双酶切及测序鉴定。获得的重组质粒pVIVO2-Sj14FABP转染HepG2细胞,间接免疫荧光(IFA)检测蛋白表达;并免疫BALB/c小鼠,30d后攻击感染,感染后45天剖杀,计数检获成虫数和肝脏虫卵数。结果RT-PCR扩增出大小为440bp的Sj14FABP片段,重组质粒经PCR和双酶切后均获得目的片段,转染细胞IFA结果显示有较强荧光。重组质粒免疫小鼠后分别获得24.1%减虫率和27.2%减卵率。结论成功构建和表达重组质粒pVIVO2-Sj14FABP,该核酸疫苗能够诱导小鼠产生部分抗血吸虫感染的保护力。     

日本血吸虫SjIM基因克隆表达及动物免疫保护评估

目的 克隆并表达日本血吸虫肌醇单磷酸酶(SjIM)编码基因cDNA,评估该重组抗原抗血吸虫感染的免疫保护效果.方法 以日本血吸虫42d虫体cDNA为模板,经PCR扩增编码SjIM蛋白的开放阅读框(ORF)基因片段.采用荧光实时定量PCR分析该基因在童虫和成虫的表达情况.以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,经异丙基- β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导,制备重组SjIM蛋白.Western blotting检测重组蛋白的抗原性与免疫原性,利用重组SjIM抗原免疫小鼠评估其免疫保护效果.结果 获得了编码SjIM基因ORF的cDNA片段,ORF长度为834 bp,编码278个氨基酸.荧光实时定量PCR显示该基因在35 d虫体中表达量最高.获得了SjIM重组蛋白,其具有良好的免疫原性.免疫组小鼠获得48.76％的减虫率和41.29％的肝脏减卵率.结论 获得了日本血吸虫SjIM基因ORF的cDNA序列,并制备了重组SjIM蛋白,该重组抗原在小鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果.     

日本血吸虫体表蛋白rSj29的保护性效果

目的 克隆表达日本血吸虫体表蛋白Sj29基因,分析其表达特性和免疫保护效果。 方法 根据日本血吸虫体表蛋白Sj29基因序列（GenBank登录号为AY814537）设计引物,PCR扩增目的基因,生物信息技术分析序列特性。将目的基因部分片段亚克隆到原核表达载体pET28c中,构建重组质粒pET28c-Sj29,将其转至大肠埃希菌后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,组氨酸（His）柱亲和层析法纯化重组蛋白;蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性。30只雌性BALB/c小鼠均分3组,实验组每鼠皮下多点注射重组蛋白rSj29共100 μl（0.1 mg/ml,用206佐剂配制）、佐剂对照组和空白（PBS）对照组,分别免疫3次,每次间隔2周。末次免疫后2周用血吸虫尾蚴攻击感染小鼠,每鼠40±2条,感染后第53天剖杀,收集虫体计算减虫率;取肝脏和粪便计算减卵率。ELISA法检测实验鼠血清特异性IgG抗体水平,免疫组织化学法检测rSj29蛋白在各期虫体的定位,荧光定量PCR法分析各期虫体及攻击感染后42 d虫体Sj29基因表达水平。 结果 获得576 bp的Sj29基因。重组蛋白的相对分子质量（Mr）为22 900,以包涵体形式存在。Western blotting表明,重组蛋白可被免疫小鼠血清和感染日本血吸虫的小鼠血清识别。攻击感染后42 d,小鼠体内Sj29基因转录水平分别为佐剂对照组和空白对照组虫体的9.1倍和51.8倍。实验组小鼠成虫数（15.4±5.9）、肝组织虫卵数（40 143.3±2 995.9）和粪便虫卵数（3 803.9±110.9）与空白对照组相比,差异均有统计学意义（P<0.05）。ELISA结果显示,免疫小鼠可产生高滴度（1 ∶ 32 000）特异性IgG抗体。免疫组织化学结果表明,重组蛋白rSj29可在7、14 d童虫,28、32 d成虫和42 d雄、雌虫的体表表达。荧光定量PCR结果表明,虫龄为32 d的日本血吸虫成虫Sj29基因转录水平最高。 结论 重组蛋白rSj29有一定的免疫保护效果。     

日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因功能的初步研究

目的探索日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(chymotrypsin-like protease)在终宿主体内的基因表达、定位和潜在功能,评估该蛋白在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护力。方法利用软件分析日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白(Sj CTRL)基因(Gen Bank登录号为FN317561.1)的理化特性,及与其他物种同源基因的种系发生关系。采用整体原位杂交法定位Sj CTRL基因转录本在d26成虫中的表达部位。利用实时定量荧光PCR方法监测感染后14、18、22和26 d等4个发育时期雌雄虫的Sj CTRL基因转录水平。制备Sj CTRL-ds RNA,采用体外浸泡法对d26合抱雌雄虫进行RNA干扰,并利用共聚焦显微镜观察被干扰虫体的形态学变化。设计特异性引物扩增去除跨膜结构的编码基因序列,并克隆至p ET-28a原核表达载体,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)后进行原核表达。将纯化重组蛋白免疫C57BL/6小鼠,用尾蚴(40±2条/鼠)攻击感染进行动物保护性实验。同时设对照组。感染后35 d收集虫体和肝脏,统计减虫率、每克肝组织减卵率。结果原位杂交定位结果显示,该基因转录本位于雌虫后段肠道。Sj CTRL基因仅在d26雌虫体内有较高的转录本丰度。Sj CTRL-ds RNA干扰后雌虫相应基因转录本的相对表达量降至25.7%(P0.05),但未有可观察到的形态学变化。构建了p ET-28a/Sj CTRL重组质粒,诱导表达获得不可溶重组蛋白。免疫保护试验结果显示,减虫率为25.4%,减卵率为80.5%。结论初步探明日本血吸虫胰凝乳蛋白酶样蛋白基因仅在d26雌虫的后段肠道高转录,体外干扰可降低Sj CTRL基因的转录本水平,该蛋白可一定程度上减少感染日本血吸虫的C57BL/6小鼠的成虫数和肝脏虫卵数。     

日本血吸虫凋亡诱导因子SjAIF功能区片段的克隆及表达分析

目的 克隆表达日本血吸虫凋亡诱导因子(SjAIF)功能区片段,并对其生物学特性进行初步分析。方法 应用PCR技术扩增日本血吸虫凋亡诱导因子的功能区片段,构建原核重组表达质粒并诱导其表达,实时定量PCR分析其在不同发育时期童虫和成虫的转录水平,通过Western-blot和间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性和免疫原性,应用免疫组化分析该蛋白在虫体内的分布情况。结果 克隆了SjAIF功能区片段,大小为831 bp。成功构建了原核重组表达质粒pET-28a(+)-SjAIF,并在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白分子量35 kD。实时定量PCR分析表明SjAIF基因在童虫和成虫的各个发育阶段均有转录,其中7 d~21 d虫体表达量较低,42 d和28 d虫体表达量较高,雌虫表达量高于雄虫。重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性,免疫小鼠后诱导产生了较高水平的特异性IgG抗体。该蛋白主要存在于日本血吸虫体被,少部分分布于实质组织中。结论 成功表达了SjAIF基因的功能区片段,对其生物学特性进行了初步分析,为进一步研究该基因生物学功能和作用提供了基础。     

日本血吸虫P14基因纳米微球-DNA疫苗的免疫保护作用

目的 探讨日本血吸虫碱性调宁蛋白样蛋白P14基因的重组真核表达载体(pcDNA3.1(+)-SjP14)对小鼠血吸虫感染的免疫保护作用.方法 制备无内毒素pcDNA3.1 (+)-SjP14及纳米微球DNA疫苗,将雌性BALB/c小鼠随机分为3组,每组10只,分别为生理盐水对照组、pcDNA3.1(+)-Sj P14组及纳米微球-DNA疫苗组.各组小鼠分别肌肉注射生理盐水和pcDNA3.1(+)-Sj P14、纳米微球DNA疫苗100μg/鼠·次,每2周免疫一次,共3次.末次免疫后2周,尾蚴攻击,6w后处死小鼠,收集成虫,计算减虫率;同时留取肝脏,部分消化后在显微镜下行虫卵计数,计算减卵率.结果 pcDNA3.1(+)-Sj P14p核酸疫苗能明显提高小鼠的抗血吸虫感染能力,减虫率和减卵率分别达到44.6％和61.6％;纳米微球-DNA疫苗免疫能进一步提高小鼠抗血吸虫感染作用,减虫率和减卵率分别提高至56.2％和73.5％.结论 pcDNA3.1(+)-Sj P14核酸疫苗有一定程度的抗血吸虫感染作用,pcDNA3.1(+)-SjP14-纳米微球复合物疫苗免疫能增强小鼠对血吸虫感染的免疫保护作用.     

日本血吸虫P14基因纳米微球-DNA疫苗的免疫保护作用

目的 探讨日本血吸虫碱性调宁蛋白样蛋白P14基因的重组真核表达载体(pcDNA3.1(+)-SjP14)对小鼠血吸虫感染的免疫保护作用.方法 制备无内毒素pcDNA3.1 (+)-SjP14及纳米微球DNA疫苗,将雌性BALB/c小鼠随机分为3组,每组10只,分别为生理盐水对照组、pcDNA3.1(+)-Sj P14组...     

日本血吸虫精氨酸酶新基因的鉴定及作为疫苗的保护性研究

目的 识别和鉴定日本血吸虫（Sj）精氨酸酶（ARG）新基因，并研究纯化的重组SjARG对Sj感染小鼠的保护性。　方法 通过巢式PCR，从日本血吸虫尾蚴cDNA文库特异扩增ARG基因cDNA序列的5′端，并用生物信息学进行鉴定；将ARG的完整编码序列（CDS）克隆到pET30a（+）载体，表达并纯化表达产物后，以鸟氨酸-茚三酮法鉴定酶活性；用蛋白质印迹法（Western blotting）比较重组ARG蛋白与Sj天然ARG蛋白的免疫学特性，间接免疫荧光法对ARG在Sj成虫中的分布进行组织定位；用纯化重组ARG蛋白免疫小鼠（PBS和SjGST作对照），Sj尾蚴攻击感染后，检测SjARG作为疫苗的免疫保护力。 结果 　扩增并鉴定SjARG基因的完整CDS长为1 095 bp；重组SjARG具有酶活性，并具有与Sj天然ARG蛋白相同的免疫学特性；ARG定位于Sj成虫的肠壁和生殖器官。重组SjARG蛋白免疫后的减虫率和减卵率分别为55.8%和48.8%。SjGST蛋白免疫后的减虫率和减卵率分别为28.6%和6.89%。 结论 获取并鉴定了SjARG新基因；SjARG比SjGST具有更高的疫苗保护性。     

日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因的原核表达

目的 进一步研究日本血吸虫（中国大陆株）Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识。方法 根据曼氏血吸虫Sm16基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中扩增Sj16基因,将Sj16基因定向克隆入pGEX-4T-1,转化感受态BL21/DE3菌;用酶切、PCR扩增鉴定筛选得到的重组阳性克隆,IPTG诱导pGEX-4T-1-Sj16转化的BL21/DE3菌,用SDS-PAGE和Wester-blot分析表达产物。结果 从日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库中获取Sj16基因,重组质粒中含有Sj16基因,成功构建日本血吸虫（中国大陆株）Sj16基因原核表达重组质粒pGEX-4T-1-Sj16,pGEX-4T-1-Sj16转化的BL21/DE3菌经IPTG诱导可表达与GST融合的蛋白（约40kDa）,抗GST抗体能特异性识别该蛋白。结论 成功原核表达了Sj16蛋白,为深入研究Sj16的免疫调节功能,丰富有关血吸虫免疫逃避知识打下了基础。     

日本血吸虫疫苗候选分子的基因克隆、表达及特性鉴定

本研究用日本血吸虫（Sj）成虫抗原免疫的免血清从日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA库筛选出Sj22．6基因克隆；用根据曼氏血吸虫23kDa膜抗原（Sm23）的编码基因设计的引物，以PCR法从日本血吸虫成虫CDNA库扩增出Sj23基因；用根据日本血吸虫菲律宾林的磷酸丙糖异构酶（SjTPI）基因设计的引物，以RT－PCR从日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA扩增出SjTPI基因；并测得了上述3个基因的核苷酸序列；通过与国外有关单位合作研究，获得日本血吸虫中国大陆株肌球蛋白的62kDa肽段（Sj62）的编码基因克隆．Sj22．6、SjTPI及Sj62的编码基因巴克隆入质粒pGEX并获得表达；Sj23基因克隆入杆状病毒，在家蚕幼虫体内获得表达．用Glutathione－Sepharose4B（GS4B）已纯化出重组的Sj22．6（rSj22．6）、Sj62（rSj62）及SjTPI。Sj22．6、Sj23、SjTPI和Sj62基因的表达产物均可被Sj重感染的兔血清识别；用rSj22．6免疫家兔和小鼠，均可诱生明显升高的IgG抗体，其可特异地识别rSj22．6，还可识别成虫抗原中天然的相应分子，但不识到虫卵抗原中任何成份．用rSj22．6对昆明鼠及BALB／C小鼠分别作免疫攻击实验，前者可产生38.93％的减虫率，后者可产生32．1％－35.27％的减虫率和28．4％的总体减卵率。Sj22．6／Sj26GST融合蛋白可诱导BALB     

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶重组质粒的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的 构建日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(Sj26GST)重组质粒pET32α-Sj26GST,观察该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj26GST抗原编码基因,克隆至原核表达载体pET32α(+),构建pET32α-Sj26GST,转化大肠埃希菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot 对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出676 bp的Sj26GST基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST基因成功插入pET32α(+)中,SDS-PAGE分析显示表达产物为相对分子质量约为49×103的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的24%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别.结论 成功构建了pET32α-Sj26GST,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有特异的抗原性.     

日本血吸虫新基因Sjnanos的克隆、表达及免疫保护效果评估

目的扩增、表达日本血吸虫Sjnanos编码基因并评估其重组蛋白诱导的免疫保护效果。方法从42d龄的日本血吸虫成虫中扩增了一个日本血吸虫性别差异表达的基因,GenBank登录号为AY814948,并对其进行生物信息学分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测其血清特异性抗体效价,蛋白印迹分析检测其抗原性,以看家基因NADH为内参,应用荧光定量PCR技术分析该基因在血吸虫各个阶段的表达状况。结果同源性分析表明,该基因为日本血吸虫的一个新基因,其编码序列的开放阅读框(ORF)为525bp,编码174个氨基酸,理论相对分子量为19.9,PI为8.2。荧光定量PCR技术分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d、42d虫体均有表达,但在18d和13d虫体的表达量明显高于其他天数的虫体,在雄虫的表达量高于雌虫。成功构建了该基因的重组表达质粒pET28a(+)-Sjnanos,并在大肠埃希菌中获得表达,Western-blot分析表明重组蛋白具有较好的免疫原性,动物免疫保护试验获得了31.4%的减虫率和53.8%的肝脏减卵率。结论获得日本血吸虫新的抗原基因Sjnanos,该基因的重组蛋白在小鼠中诱导了部分免疫保护作用。     

日本血吸虫肌钙蛋白T(SjTnT)基因克隆 表达及免疫保护效果评估

目的 目的 克隆、 表达日本血吸虫肌钙蛋白T （SjTnT） 编码cDNA, 评估重组抗原抗血吸虫感染的免疫保护效果。方 方 法 法 利用PCR技术扩增SjTnT基因, 构建重组表达质粒pET28a （+） ?SjTnT并诱导表达, 用重组蛋白rSjTnT免疫BALB/c小 鼠制备免疫血清。利用免疫印迹试验 （Western blotting） 和酶联免疫吸附试验 （ELISA） 检测rSjTnT诱导的免疫反应。采 用rSjTnT免疫小鼠, 评估其诱导的免疫保护效果。结果 结果 成功克隆、 表达了日本血吸虫SjTnT基因。Western blotting显 示rSjTnT能被该重组蛋白免疫小鼠血清识别, 具有良好的免疫原性。rSjTnT能诱导小鼠产生高水平的特异性IgG抗体。 动物免疫保护试验表明, rSjTnT能诱导小鼠产生33.89%的减虫率以及43.94%的肝脏减卵率。结论 结论 制备的rSjTnT在小 鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果, 为评估SjTnT的生物学功能奠定了基础。     

血吸虫多基因非融合性膜锚定表达疫苗的研究

目的 构建日本血吸虫多基因非融合性膜锚定表达疫苗pIRES-Sj97-Sj14-Sj26,并研究其免疫原性及免疫保护作用。 方法 构建日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（Sj14）、谷胱甘肽-S-转移酶（Sj26）和副肌球蛋白（Sj97）的跨膜共表达质粒pIRES?鄄Sj97-Sj14-Sj26,转染HeLa细胞。通过RT?鄄PCR法检测Sj14、Sj26和Sj97 mRNA的表达,免疫荧光（IFA）检测Sj14、Sj26和Sj97蛋白的表达。用纯化的该质粒免疫BALB／c小鼠（100 μg/只）,设生理盐水和空载体对照组,20只/组,每隔2周加强免疫1次,共免疫3次。末次免疫2周后,每组取10只小鼠,眼球取血并断颈处死,取脾淋巴细胞及腹腔巨噬细胞。分别检测免疫小鼠血清中总IgG抗体及脾淋巴细胞培养上清干扰素-γ（IFN-γ）水平,淋巴细胞刺激指数（SI）及 NO释放量,并分析脾淋巴细胞亚群。各组中余下小鼠每只经腹部感染40±1条尾蚴,45 d后剖杀,计数成虫数及肝卵数,计算减虫率和减卵率。结果 构建的质粒可在体外表达。疫苗组、生理盐水组和空白质粒组血清总IgG抗体含量分别为（5.62±0.64）、 （1.22±0.20）及（1.48±0.36） mg/ml,疫苗组与各对照组差异均具有统计学意义（P<0.01, P<0.05）。疫苗组、生理盐水组和空白质粒组小鼠腹腔巨噬细胞NO含量分别为（321.19±18.03）、 （184.12±11.05）及（213.51±15.93） nmol/ml,疫苗组与生理盐水组间差异有统计学意义（P<0.05）。疫苗组、生理盐水组、空白质粒组小鼠脾淋巴细胞刺激指数分别为（2.25±0.29）、（1.18±0.07）及（1.22±0.09）,疫苗组显著升高（P<0.01）。疫苗组INF-γ水平与各对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.01）;CD4+和CD8+T细胞百分比明显升高。疫苗组减虫率和肝减卵率分别为39.9％和43.94％。 结论 pIRES-Sj97-Sj14-Sj26疫苗具有较强的免疫原性,可对日本血吸虫感染的小鼠产生一定保护作用。     

日本血吸虫Sj14FABP与细胞因子IL-12重组质粒的构建和表达

目的　构建日本血吸虫 14kDa脂肪酸结合蛋白 (Sj14FABP)和细胞因子IL 12共表达质粒 ,并观察其能否在小鼠体内获得表达。方法　TRIzol试剂提取日本血吸虫成虫总RNA ,采用RT PCR方法逆转录Sj14FABP编码基因序列 ,经过双酶切后定向克隆到载体pVIVO2 IL12中 ,通过PCR、酶切及测序进行鉴定。大量制备重组质粒 pVIVO2 IL12 Sj14FABP并免疫BALB/c小鼠 ,取注射部位肌肉组织进行间接免疫荧光试验。结果　RT PCR扩增出一条大小为 4 4 0bp的片段 ;经PCR、酶切及测序鉴定表明所构建的重组质粒中含有Sj14FABP基因 ;间接免疫荧光试验结果为阳性。 结论　本试验成功构建重组质粒 pVIVO2 IL12 Sj14FABP ,并在小鼠体内获得表达。     

日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白 基因的克隆 表达及鉴定

目的克隆、表达日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白（SjTollip）基因,并研究该基因在日本血吸虫各虫期的转录表达情况。方法从日本血吸虫cDNA文库中挑出Toll样受体相互作用蛋白基因进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物。制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA和重组SjTollip蛋白免疫新西兰白兔的免疫兔血清,利用RT-PCR和蛋白质免疫印迹分析SjTollip基因在日本血吸虫各期转录表达的差异及重组SjTollip蛋白的免疫原性。结果构建了重组原核表达载体SjTollip/pET-28a,诱导获得以包涵体形式表达的不可溶重组蛋白,相对分子质量约为24000,与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白rSjTollip可被日本血吸虫感染兔血清识别。虫期转录特异性分析显示,该基因在尾蚴和雄虫中转录水平较低。免疫印迹分析结果显示,在虫卵、尾蚴、童虫、雄虫、雌虫各发育阶段都检测到该蛋白,但童虫和雌虫中表达水平明显升高。结论 SjTollip基因在日本血吸虫各发育阶段转录表达水平有较大差异,其有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。     

日本血吸虫溶血磷脂酶编码基因真核表达载体的构建和表达及鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出溶血磷脂酶编码基因(Si1539),并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),旨在提取重组抗原进行免疫原性分析,并用于免疫学诊断.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,反转录生成cDNA,PCR法扩增出Sj1539基因,通过克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),然后转染至人宫颈癌细胞株(HeLa细胞)中表达,表达产物用Western印迹法进行鉴定.结果 Sj1539基因PCR扩增产物片段长度为684 bp.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539经BamH I、Xho I双酶切和PCR扩增鉴定,证实Sj1539基因已成功插入.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539在HeLa细胞中的表达产物经Western印迹法鉴定能够与日本血吸虫感染的兔血清反应,其相对分子质量(Mr)约为25×103.结论 成功构建了日本血吸虫Si1539基因真核表达载体,并获得了表达产物.

Abstract：

Objective Schistasoma japonicum(S.japonicum)lysophospholipase gene(Sjl539)from cDNA of S japonicum adult worms was amplified and subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)for expression of recombinant antigen and immunogenicity analysis.Methods Total RNA of S.japonicum was extracted to generato cDNA by RT-PCR.The Sj1539 gent was amplified.The DNA fragment was subcloned into eukaryofic expression vector pcDNA3.1(+)following insertion and amplification in pGEM-T.The recombinant plasmid was transfected into human cervical carcinoma cell strain(Hela cells)and expression products were identified by Western blotting.Results The size of PCR product was approximately 684 bp.It was confirmed that Sj1539 gene had been inserted successfully by the recombinant plasmid digested with two enzymes and PCR.It was verified that the expression product could react with S.japonicum-infected rabbit serum by Western blotting and the molecular weight was approximately 25×103.Conclusions The eukaryotie expression vector carrying Sj1539 gene has been established and the expression product has been obtained.     

日本血吸虫23kD抗原表位及多价疫苗的初步研究

目的　研究日本血吸虫 2 3kD抗原表位及日本血吸虫 2 3kD抗原大亲水区多肽 (LHD -Sj2 3)与脂肪酸结合蛋白(SjFABP)两个基因重组抗原联合免疫小鼠的保护效果。 方法　人工合成血吸虫 2 3kD抗原中一段可诱导T细胞和B细胞免疫应答的抗原表位多肽p14 ,与鸡白蛋白偶联后免疫小鼠。用LHD -Sj2 3和SjFABP两个基因重组抗原联合免疫大鼠 ,观察诱导的免疫保护效果。结果与结论　人工合成肽 p14诱导了 2 2 2 2 %～ 30 18% (P <0 0 5～ 0 0 0 1)的减虫率。用LHD -Sj2 3和SjFABP两个基因重组抗原免疫大鼠时 ,分别获得 32 14 %和 31 85 %的减虫率 (P >0 0 5 ) ,当用这两种基因重组抗原联合免疫大鼠时 ,获得了 4 7 2 8%的减虫率。加强抗原表位及“鸡尾酒”疫苗研究 ,可为寻找更高保护作用的抗血吸虫病疫苗提供基础。     

日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白对小鼠免疫保护性的初步研究

目的 研究日本血吸虫（中国大陆株）线粒体相关蛋白（rSj338/26GST)对小鼠的免疫保护性，预测其作为血吸虫疫苗候选分子的潜能。方法 将编码日本血吸虫线粒体相关蛋白的cDNA经PCR扩增后亚克隆人载体质粒pGEX-6p-1进行表达，并用表达的重组抗原的融合蛋白免疫BABL／c小鼠。结果 与对照组相比，rSj338/26GST重组蛋白免疫小鼠获得了32．3％的减虫率及46．5％肝总减卵率；与Sj26GST免疫组相比，rSj338抗原可能使小鼠获得22．5％的减虫率及30．0％的肝总 减卵率。结论 证明重组的日本血吸虫线粒体相关蛋白(rSj338/26GST及rSj338)可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力，可望成为新的疫苗候选分子。     

日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32的构建及其在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达

目的构建日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法超声粉碎日本血吸虫成虫,提取总RNA,通过RT-PCR扩增获Sj26GST和Sj32抗原编码基因;采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Sj26GST和Sj32,得到Sj26GST-Sj32融合基因;将融合基因克隆至原核表达载体pQE30,构建重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32并转化大肠埃希菌BL21,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果基因拼接法扩增出约1 991 bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切和PCR鉴定证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入pQE30中,SDS-PAGE显示表达产物为分子质量单位约为61 ku的重组蛋白,与预期结果一致,表达的蛋白约占菌体总蛋白的18%;Western blot鉴定重组蛋白能被日本血吸虫感染的兔血清识别。结论成功构建了日本血吸虫重组质粒pQE30-Sj26GST-Sj32,该质粒在大肠埃希菌BL21中获得了高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。