人牙本质磷蛋白基因全序列的亚克隆及其5''''端序列的克隆和分析

目的:本研究旨在鉴定质粒pBlueBacHis2-DPP上所携带的外源基因序列;建立带有人DPP基因的稳定克隆株;构建人DPP基因5'端序列重组质粒,为表达纯化人DPP蛋白及其5'端序列提供可参考的数据.方法:用限制性内切酶分析并进行DNA序列测定质粒pBlueBacHis2-DPP上所携带的外源基因序列;以质粒pBlueBacHis2-DPP为模板,构建人DPP基因5'端序列重组质粒,并用蛋白序列分析软件包ANTHEPROT 4.5分析预测人DPP蛋白N端序列.结果和结论:质粒pBlueBacHis2-DPP上所携带的外源基因序列与基因文库上的人DPP基因序列相符合,建立带有人DPP基因的稳定克隆株pBV222-DPP;蛋白序列分析软件包分析预测人DPP蛋白N端序列氨基酸组成特点与人DPP全序列一致,体外即将表达的蛋白可能具有人DPP生物学功能的重组蛋白.     

人牙本质磷蛋白功能片段的真核表达

目的本研究旨在利用分子生物学技术真核表达包含功能区的人DPP片段。方法构建了人DPP蛋白5’端基因片段的杆状病毒表达质粒pFastBacHb—hDPP—N，经BH10BAC转座反应后感染昆虫细胞sf9，进行重组蛋白的表达。结果经2～3代后，重组病毒产生明显的CPE，人DSPP蛋白特异性多克隆抗体Western blot鉴定，结果显示重组病毒感染3代毒sf9细胞的裂解物中在约17KD位置上出现了特异性的反应条带。结论表明杆状病毒系统可表达人DPP基因片段。为进一步通过对人DPP功能片段的研究揭示DPP在牙齿发育和牙髓修复中的作用及其机制奠定基础。     

小鼠Notch1胞外段高抗原区编码基因的克隆与表达

目的 :克隆小鼠Notch1胞外段高抗原区编码基因 ,并进行原核表达及蛋白纯化 ,为制备mNotch1的单克隆抗体做准备。方法 :计算机分析小鼠Notch1全长 ,PCR扩增其胞外段高抗原区编码基因 ,克隆入载体T -vector进行序列测定 ,然后将测定正确的片段连入GST融合表达载体pGEX - 4T - 1,得到pG -NEF ,转化宿主菌DH5α ,经IPTG诱导 ,SDS -PAGE分析 ,以及新生条带表达形式分析以后 ,用GST亲和层析柱纯化。结果 :小鼠Notch1分子胞外段近膜处约 170个氨基酸区域抗原性较高 ,PCR扩增得到大小约 5 0 0bp的特异性片段 ,序列测定结果与文献报导的完全一致 ;原核表达产物大小约Mr 43× 10 3 ,以包涵体形式存在 ,约占总蛋白的2 5 % ,纯化后目的蛋白含量 >95 %。结论 :成功地进行了小鼠Notch1胞外段高抗原区编码基因的基因克隆、原核表达及蛋白纯化。     

Apidaecin型抗菌肽在毕赤酵母菌中的基因工程表达

目的;利用基因工程的方法,在毕赤酵母菌(Pichia patoris,P. pastoris)中成功表达Apidaecin型抗菌肽。方法:利用PCR技术在Apidaecin基因N端插入EcoR I 酶切位点、GST标签(并连接DDDDK肠激酶位点),且在C端插入终止密码子和Not I酶切位点,后将上述片段扩增后与表达载体pPICZαA连接,构建重组表达载体pPICZαA-GST-Apidaecin,并测序鉴定;将pPICZαA-GST-Apidaecin重组质粒电转至P. pastoris X33中并进行发酵表达;表达产物经GST亲和层析纯化后进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,EK肠激酶切除GST标签后进行抑菌实验。结果:SDS-PAGE凝胶电泳结果显示GST-Apidaecin融合蛋白表达的产物条带位于分子量约为28KD处,与理论分子量一致; 抑菌实验表明,用EK肠激酶切除GST融合标签后,Apidaecin型抗菌肽对大肠杆菌有明显的抑菌活性。结论:Apidaecin型抗菌肽在P. pastoris菌中得到成功表达并具有抑菌活性。     

ADAM28基因原核表达载体的构建和在大肠杆菌中的融合表达

目的:利用消减杂交技术克隆出牙齿发育相关基因ADAM28。方法:本研究为构建ADAM28基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导其表达并纯化出ADAM28蛋白;采用反转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增出ADAM28基因的蛋白编码序列,克隆到中间载体pMD18-TVector中产生pMD18-T-ADAM28,再经双酶切得到ADAM28片段定向克隆到pGEX-4T-1载体中,构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28;在大肠杆菌中利用IPTG进行诱导表达,得到GST-ADAM28融合蛋白,并经SDS-PAGE电泳初步纯化。结果:①成功构建融合表达载体pGEX-4T-ADAM28,并经酶切鉴定、PCR鉴定和测序验证显示插入的ADAM28序列正确,阅读框架完整,未发现突变。②得到初步纯化的GST-ADAM28融合蛋白。经IPTG诱导后出现一条约35.3×103的新蛋白带。结论:ADAM28基因编码蛋白质能够在原核细胞中表达并纯化,为进一步研究该蛋白质的功能打下基础。     

人成釉蛋白编码区cDNA的克隆和N端肽的融合表达

目的 :克隆人成釉蛋白 (Ameloblastin)编码区基因并原核表达其N端肽。方法 :抽提人牙胚总RNA ,用Oligo(dt)作引物逆转录合成人牙胚cDNAs,然后利用PCR方法 ,从cDNAs中扩增出人成釉蛋白编码区cDNA序列 ,将所得基因片段插入 pGEM -TEasy质粒载体 ,转化入大肠杆菌DH5α后挑选阳性克隆 ,提取重组质粒DNA ,通过限制性酶切和核苷酸序列测定鉴定阳性克隆。将所克隆序列的 5’端 5 5 8bp的片段连入原核表达载体 pGEX - 4T1并在大肠杆菌中诱导表达 ,SDS -PAGE分析。 结果 :克隆片段测序结果与GenBank数据库收录的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 4 6× 10 3 的融合蛋白。结论 :克隆到人成釉蛋白编码区cDNA ,并在大肠杆菌中表达了人成釉蛋白N端肽     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的：克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因（Glucan-binding protein C gene,gbpC）编码序列的特异片段,并在大肠杆菌中实现原核表达。方法：根据gbpC序列设计并合成一对寡核苷酸引物,PCR扩增位于gbpC编码序列1342bp～1794bp间的一段特异片段,扩增产物经回收、酶切后,定向插入克隆载体puc18中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定。将克隆获得的约0．45kb的gbpC基因特异片段经EcoRI／SalI双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1／gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达融合蛋白GST-GbpC^E,SDS-PAGE检测表达产物。结果：测序结果与Sato等报道的序列一致;原核表达后,在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白条带,其相对分子量约43000,与预计大小相符合。结论：成功克隆并表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpC^E,为制备GbpC抗体打下了基础。     

变异链球菌LuxS基因表达载体的构建

目的构建可用于变异链球菌表达系统的含LuxS基因的原核表达载体。方法应用聚合酶链反应(PCR)方法分别从变异链球菌的DNA、载体pEGFP-N1中扩增出LuxS基因的启动子(pLuxS)和绿色荧光蛋白(gfp)基因片段,经回收、纯化后,利用分子克隆技术分别克隆入载体pUC19中。结果通过对重组质粒pUC19-pLuxS-gfp的酶切图谱和DNA序列测定分析证实插入片段序列正确。结论成功构建出原核表达重组质粒pUC 19-pLuxS-gfp为下一步的功能研究奠定了基础。     

人釉原蛋白成熟肽基因的原核表达和纯化

目的 建立人釉原蛋白(amelogenin,AMG)成熟肽基因原核表达和纯化的技术路线,获得纯化的人AMG成熟肽蛋白,以期为牙周炎的基础治疗提供依据.方法 通过已构建并经鉴定的重组质粒pGEX-4T-1-AMG,转化BL21大肠杆菌,原核表达后利用谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白纯化系统(glutathione S-transferase fusion protein purification system,GSTrapFF)亲和层析柱进行重组人AMG的纯化.结果 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳图和蛋白质印迹法分析结果显示,获得纯化的相对分子质量为45 000大小GST-AMG融合蛋白和19 000大小的目的 蛋白AMG.结论 利用pGEX-4T-1-AMG-BL21体系成功获得了人AMG成熟肽基因在大肠杆菌中的原核表达和纯化.     

人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因的克隆、原核表达和纯化

目的：获得原核表达的人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性蛋白。方法：采用RT-PCR技术从人成牙本质样细胞系中获得cDNA,亚克隆至PUC18载体中,经测序确认后,将该基因插入原核表达载体pProEXHTb中,通过电穿孔技术转化E．coli表达菌DH5α,以IPTG诱导蛋白表达,并经Ni—NTA亲和柱层析纯化,SDS-PAGE鉴定。结果：获得的人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性cDNA序列与GenBank登录的cDNA序列一致。结论：成功克隆人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性基因,建立了原核表达、纯化体系,制备了纯化的人成牙本质细胞L型钙离子通道α1亚基D亚型特异性蛋白。     

牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 克隆牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域（RgpAcd）基因,并将其置于大肠杆菌中作融合表
达。方法 利用PCR技术和基因重组技术,克隆牙龈卟啉单胞菌RgpAcd,然后插入中介载体pMD18-T中并测序鉴定。将目的基因片段插入原核表达载体pET-15b来构建表达质粒pET-15b/RgpAcd。重组原核表达质粒经酶切鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白。结果 核酸序列测定与分析的结果表明,克隆的1 476 bp基因序列与GenBank数据库中的序列呈现100%同源性;IPTG诱导后的菌体经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后有一个相对分子质量为5×104的融合表达蛋白产生。结论 本实验成功克隆了牙龈卟啉单胞菌RgpAcd基因,并在大肠杆菌中表达了RgpAcd蛋白,为进一步研制重组活载体疫苗奠定了基础。     

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K催化结构域的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆牙龈卟啉菌蛋白酶K催化结构域 (kgpcd)基因 ,并使其在大肠杆菌中获得表达。方法 :利用PCR方法克隆kgpcd ,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果 :克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 5 6× 1 0 3 的融合蛋白。结论 :成功克隆了kgpcd的基因 ,并在大肠杆菌中表达了KGPcd蛋白 ,为后续研究奠定了基础     

靶向融合防龋DNA疫苗的构建与体外细胞表达研究

目的 构建以人细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen 4，CTLA4)为引导的抗变形链球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)葡糖基转移酶(glucosyltransferase，GTFs)I和表面蛋白PAc的靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P，检测其在真核细胞中的表达。方法 利用RT-PCR方法从外周淋巴细胞中获得CTLA4胞外区和Igγ1恒定区基因并进行T-A克隆，获得携带CTLA4-Ig融合基因的重组质粒pGJ，选择合适的酶切位点，再克隆人融合防龋DNA疫苗pCLUA-P中，构建靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P，并转染CHO细胞系，用蛋白质免疫印迹实验检测其表达。结果 重组质粒pGJ、pGJA-P分别含有cTLA4-Igγ1融合基因和cTLA4-、Igγ1、pac、glu基因序列。蛋白质免疫印迹结果显示，pGJA-P表达的抗原可以与特异性抗PAc抗体发生免疫反应。结论 成功构建了靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P，并可在真核细胞中正确表达。     

血管内皮生长因子-C表达载体的构建和原核表达

目的　探讨从人舌癌组织中克隆到的血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor,VEGF-C) 片段cDNA表达载体在原核细胞中的功能表达,为进一步研究VEGF-C在口腔鳞癌中表达的意义及与淋巴转移的关系打下基础。方法　以RT-PCR法从舌鳞癌组织中克隆的VEGF-C基因功能片段cDNA与表达载体pBK-CMV构建表达质粒,转化并诱导其在大肠杆菌中的表达,并通过SDS-PAGE及Western-blotting进行检测。结果　从人舌癌组织总RNA中克隆到约1·1 kb大小的VEGF-C基因cDNA,与Genbank公布的人VEGF-C基因cDNA序列有99·6% 同源性,以之构建出的重组质粒pBK-VEGF-C转染大肠杆菌经IPTG诱导后,检测到稳定表达的相对分子质量约 56 000的融合蛋白,该融合蛋白与VEGF-C多抗具有强阳性免疫印迹反应。结论　证实克隆得到VEGF-C基因功能片段cDNA可在原核细胞中成功表达,为进一步研究VEGF-C在口腔癌颈淋巴结转移中的功能效应提供了物质基础。     

细胞毒淋巴细胞相关抗原4靶向防龋DNA疫苗在细胞中的表达研究

目的采用绿色荧光蛋白标记技术,研究细胞毒淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）靶向DNA疫苗编码抗原在细胞中表达的一般形式,并探讨CTLA-4融合抗原片段大小对靶向DNA疫苗在细胞中表达水平的影响.方法从靶向融合防龋DNA疫苗pGJA-P中去掉A-P片段,构建出靶向防龋质粒pGJGLU;以pVAX1质粒骨架替代pGJA-P和pGJGLU质粒中的pCI载体骨架,构建出pGJA-P/VAX和pGJLU/VAX真核表达质粒;切下pGJGLU质粒的CTLA-4-Ig-GLU片段,克隆入pEGFP-N1中,获得pGJGLU/GFP质粒,转染CHO细胞,荧光显微镜下观察蛋白表达;将pGJA-P/VAX、pGJGLU/VAX和pGJGLU/GFP转染CHO细胞,以ELISA法检测培养上清液中融合蛋白的表达水平.结果pGJGLU/GFP转染细胞镜下表达特异性绿色荧光物质,呈颗粒状;pGJA-P/VAX、pGJGLU/VAX和pGJGLU/GFP 3种质粒可以表达融合蛋白并分泌到培养上清液中,且所表达的融合蛋白浓度不同,并以pGJGLU/VAX表达的水平最高.结论CTLA-4融合蛋白可以以分泌形式表达,CTLA-4靶向疫苗编码的融合抗原片段大小影响其在细胞中的表达分泌水平.     

mcpr1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :构建mcpr1基因原核表达载体 ,表达MCPR1蛋白。 方法 :采用多聚酶链式反应 (PCR)扩增出mcpr1基因的蛋白编码序列 ,克隆到中间载体中 ,再经双酶切 ,亚克隆到表达载体中 ,构建该基因的融合表达载体pGEX 4T mcpr1,在大肠杆菌中用IPTG诱导表达 ,SDS PAGE电泳。 结果 :酶切和测序鉴定 ,表明融合表达载体内插入片段正确 ,在大肠杆菌中诱导后 ,出现一条 3 60 0 0的新蛋白带 ,主要存在于细菌沉淀中 ,占总蛋白的3 9 %。结论 :研究表明mcpr1基因编码的蛋白质能够在原核细胞中表达 ,为进一步深入研究该蛋白质的结构与功能打下基础     

变形链球菌葡糖基转移酶催化活性区的分子克隆及表达

目的:克隆变形链球菌葡糖基转移酶中催化活性区(CAT)的基因片段,并在大肠杆菌中表达.方法:通过PCR技术克隆CAT的基因片段并通过蛋白重组融合表达技术使其在大肠杆菌中表达.结果:成功克隆了CAT的基因片段,并在大肠杆菌中得到其融合蛋白的表达.结论:成功克隆葡糖基转移酶CAT基因并获得其融合蛋白的表达,为后续研究奠定了基础.     

牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因在大肠杆菌的融合表达

目的：克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因,并使其在大肠杆菌中融合表达。方法：利用PCR方法克隆fimA,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果：克隆基因测序结果与GenBank数据库中的序列呈现99．9％同源性;经诱导表达后可观察到Mr38kDa的融合蛋白。结论：成功克隆了fimA基因,并在大肠杆菌中表达了FimA蛋白,为后续研究奠定了基础。