人牙龈上皮细胞的原代和传代培养

目的：研究人龈上皮细胞体外原代和传代培养，建立能够体外长期培养的人龈上皮细胞系。方法：取健康龈组织块，经0．25％分离酶作用后．将上皮组织与其下的结缔组织分离，0.125％胰酶消化上皮组织形成细胞悬液，接种培养。当细胞汇合达80％时，1：2传代培养。结果：获得的原代培养细胞表达细胞角蛋白，结合细胞形态。可初步认定为龈上皮细胞。原代培养的人龈上皮细胞部分可以传代培养到第3代。结论：建立能够长期体外培养的龈上皮细胞系具一定可行性。     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。     

牙龈素提取物对口腔鳞癌细胞HN6生物学特性的影响

目的·观察牙龈素提取物对口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）细胞HN6生物学特性的影响。方法·选取人OSCC细胞系HN6,加入牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P. gingivalis）牙龈素提取物进行培养。根据牙龈素提取物的蛋白浓度不同分为对照组（control组）,及牙龈素提取物蛋白浓度3.125μg/mL组、6.25μg/mL组、12.5μg/mL组、25μg/mL组、50μg/mL组和100μg/mL组,培养24、48 h后,采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测牙龈素提取物对HN6细胞增殖活性的影响。后续其他实验,分为control组、25μg/mL组和50μg/mL组进行。通过流式细胞术检测牙龈素提取物对细胞周期的影响,划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和Western blotting检测细胞E-cadherin和N-cadherin蛋白和基因的表达。结果·在牙龈素提取...     

牙龈上皮细胞与脱细胞真皮构建组织工程牙龈的初步研究

目的:体外培养人牙龈上皮细胞,并与脱细胞真皮构建组织工程牙龈.方法:将体外培养的人牙龈上皮细胞接种于无细胞真皮支架上,液面下培养7 d后,分别进行气-液界面培养7,14和21d,并在光镜下进行组织形态学观察.结果:牙龈上皮细胞在体外具备良好的生长增殖能力,且在无细胞真皮支架上形成了复层上皮样组织结构,表层上皮细胞出现部分角化.结论:利用体外培养的牙龈上皮细胞和脱细胞真皮,可以在体外联合构建具有复层上皮细胞结构的组织工程牙龈.     

唾液支原体诱导牙龈上皮细胞产生TNF-α和IL-6

目的了解唾液支原体能否诱导牙龈上皮细胞（HGEC）产生细胞因子TNF-α和IL-6。方法培养HGEC上皮细胞,用唾液支原体感染后,ELISA检测TNF-α和IL-6的产生情况,同时用核因子κB特异性抑制剂PDTC处理HGEC后,研究其在TNF-α和IL-6中产生的作用。结果唾液支原体能以时间依赖性方式诱导HGEC产生TNF-α和IL-6,并且PDTC能部分抑制其功能。结论唾液支原体诱导HGEC产生TNF-α和IL-6,这可能是其致病的机制之一,其机制可能与核因子κB激活有关。     

绿原酸对牙龈卟啉单胞菌诱导牙龈上皮细胞自噬的调控作用及机制

目的 探讨绿原酸(CGA)对牙龈卟啉单胞菌(P.g)诱导人牙龈上皮细胞(HGE)自噬的影响及作用机制。方法 将HGE细胞分为对照组(Control组,做任何处理)、P.g组(使用P.g诱导HGE细胞建立细胞模型)、CGA组(同P.g组处理细胞,再分别用10.0、20.0、40.0 mg/L CGA)、CGA+AMPK激活剂(AICAR)组(同P.g组处理细胞,再用40.0 mg/L CGA+1.0 nmol/L AICAR)。MTT法检测细胞增殖。分别检测HGE细胞凋亡及LC3Ⅱ、LC3I、Beclin-1、P62、p-ULK1、ULK1、p-AMPK、AMPK蛋白表达。结果 10～60 mg/L的CGA均可显著抑制P.g诱导的HGE细胞增殖,选择浓度为10.0、20.0、40.0 mg/L的CGA进行后续实验。与Control组比较,P.g组LC3Ⅱ/I、Beclin-1、p-ULK1、p-AMPK蛋白表达水平显著升高,P62表达水平显著降低(P<0.05);与P.g组比较,浓度为10.0、20.0、40.0 mg/L的CGA处理的HGE细胞凋亡率显著升高(P<0.05)...     

牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性。方法采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定。透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况。结果纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%。原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线。电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体。结论通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料。两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异。     

牛眼视网膜和虹膜色素上皮细胞体外培养的生物学特性比较

目的 分离、培养和纯化牛原代视网膜色素上皮细胞(RPE)和虹膜色素上皮细胞(IPE),比较体外培养的RPE与IPE的生物学特性.方法 采用酶辅助显微分离牛眼RPE和IPE,进行体外培养,密度梯度离心法纯化并采用免疫组化法进行鉴定.透射电镜观察体外培养RPE、IPE的超微结构,比较两种细胞体外培养下的生长状况.结果 纯化后体外培养牛RPE和IPE的角蛋白表达强阳性,细胞阳性率分别达到94%和88.7%.原代培养的牛RPE和IPE外形类似,为多角形,具有相似的生长曲线.电镜显示两种细胞都具有细胞极性,顶端有大量微绒毛,原代细胞内含有大量色素颗粒和内质网,RPE含有较多与其吞噬功能相适应的溶酶体.结论 通过酶辅助显微分离色素上皮细胞,结合密度梯度离心的方法可以获得较纯的牛RPE和IPE,该方法同样适用于周切虹膜材料.两种色素上皮细胞具有相似的形态和生物学性状,但仍然存在与功能相适应的超微结构差异.     

Toll样受体2/4在人牙龈上皮细胞的表达研究

目的:探讨Toll样受体2(toll-like receptor 2,TLR2)和Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)在人牙龈上皮细胞(human gingival epithelial cells,HGECs)的表达情况,以及上述受体在脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激下表达水平的改变?方法:采用逆转录PCR技术检测TLR2?TLR4 在HGECs的基因表达,采用real-time PCR技术和流式细胞技术检测1 μg/ml牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)?LPS或1 μg/ml大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli) LPS刺激后,该细胞TLR2?TLR4表达水平的改变?结果:来自不同个体的HGECs均表达TLR2,TLR4 mRNA?1 μg/ml P.gingivalis LPS刺激后,TLR2基因和蛋白表达水平均明显增高(P < 0.05);1 μg/ml E.coli LPS刺激后,TLR4基因和蛋白表达水平明显增高(P < 0.05)?结论:TLR2?TLR4在HGECs存在稳定表达,并能被LPS的刺激活化,提示上述两种受体可能参与了牙周组织的炎症和免疫反应?     

人羊膜上皮细胞的原代及传代培养

目的 建立体外培养人羊膜上皮细胞的方法,观察体外培养的羊膜上皮细胞的生物学特性.方法 取足月剖宫产术后羊膜,经胶原酶和胰蛋白酶消化后,获取的羊膜上皮细胞接种于含10%胎牛血清培养基中进行原代和传代培养,探索其合适的培养条件,用倒置显微镜观察培养的人羊膜上皮细胞体外生长的特征.用苏木精-伊红染色、扫描电镜和细胞角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定.结果 人羊膜上皮细胞可以在体外成功的培养传代,体外可连续传8～10代.体外培养细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有的铺路石样外观.扫描电镜观察细胞表面有丰富的微绒毛.细胞角蛋白keratin单克隆抗体染色阳性.结论 人羊膜上皮细胞在体外可成功进行原代和传代培养,体外培养的人羊膜上皮细胞在一定时间内可维持增殖能力.     

兔角膜缘和口腔粘膜上皮细胞羊膜种植及生物学特性研究

目的:研究兔角膜缘和口腔粘膜上皮细胞在羊膜上种植的方法及生物学特征.方法:将兔角膜缘上皮细胞分别种植于去上皮羊膜和完整羊膜、口腔粘膜上皮细胞种植于去上皮羊膜进行体外培养,对获得的复合组织进行组织学、超微结构观察和免疫组化检测.结果:两种上皮细胞在去上皮羊膜基底膜面都能黏附生长、增殖、汇合成片并分层,细胞表达角蛋白3.结论:兔角膜缘和口腔粘膜上皮细胞种植于去上皮羊膜获得的复合物具有分层的类角膜上皮结构,为解决眼表重建供体来源不足的矛盾带来了新的希望.     

有血清和无血清培养基联合法培养原代人牙龈上皮细胞

目的:探讨一种方便、快速、原代培养成功率高的人牙龈上皮细胞培养方法.方法:用含血清的DMEM培养基培养人牙龈组织上皮层7～10 d,然后换用无血清的EpiLife角化上皮细胞专用培养基加速已移出的上皮细胞分裂、增殖和游走.对培养出的上皮细胞进行组织学、形态学检测、单克隆角蛋白的鉴定和生长曲线测定.并比较联合培养方法和其他两种单独应用有血清DMEM培养基或无血清EpiLife培养基对上皮细胞生长的影响.结果:17～22 d内可获得供实验用上皮细胞,原代培养成功率为90.6%.倒置显微镜下见上皮细胞排列紧密,呈铺路石样生长.免疫组化染色角蛋白抗体阳性.同有血清培养基相比,无血清培养基能促进上皮细胞的迁移、游走,加速其分裂、增殖.结论:用有血清培养基和无血清培养基联合培养,可以方便、快速、成功地培养出人原代牙龈上皮细胞.     

胆盐诱导体外培养的食管黏膜上皮分化

目的探讨6种结合胆盐及其混合物是否抑制体外培养的正常食管黏膜细胞增殖、诱导其分化及其机制。方法应用20～50μmol/L 的6种结合胆盐[甘氨酸胆盐(GC),甘氨酸鹅脱氧胆盐(GCDC),甘氨酸脱氧胆盐(GDC),牛磺酸胆盐(TC),牛磺酸鹅脱氧胆盐(TCDC),牛磺酸脱氧胆盐(TDC)]及其混合物分别干预体外培养的正常食管黏膜细胞不同时间(1、3和5d);采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察细胞增殖;碘化丙啶染色流式细胞仪分析细胞周期变化;细胞免疫化学法检测细胞角蛋白(CK)14,CK13阳性细胞百分率观察细胞分化;激光共聚焦显微镜检测胆盐诱导后细胞内钙离子变化。结果 GC 对细胞的增殖无影响,而其余胆盐均抑制增殖;干预1和3d 时,除 GC 外,均引起细胞 G_0～G_1比率增加,而 S 期比率下降。干预1、3和5d 时,CK13阳性细胞百分率随干预时间增加而增加,而 CK14阳性细胞百分率则减少;其中以 TC 的作用为最强[第5天对照组 CK13阳性细胞百分率为22%±7%,而 TC 组达74%±8%(P<0.01)];TC 组和混合胆盐组细胞在加入胆盐的随后数分钟内即见到细胞内 Ca~(2+)增加,而 GC 组却未见此变化。结论 GDC、GCDC、TC、TDC、TCDC 和混合胆盐均能促进细胞分化,抑制细胞增殖,而 GC 却无此作用;TC 和混合胆盐可引起细胞内 Ca~(2+)的增加,即 Ca~(2+)参与了此诱导细胞分化的胞内信号途径。     

人胚胎干细胞分化为角质形成细胞过程中标志物的表达特点

目的：诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）定向分化为角质形成细胞K-hESCs（keratinocyte derived from human embryonic stem cells）, 并分析诱导过程中K-hESCs不同标志物的表达特点。方法：运用含骨形成蛋白4、维甲酸和N2添加剂的上皮分化培养基直接诱导hESCs分化为K- hESCs,通过染色体核型分析检测K-hESCs核型,通过实时定量PCR检测K-hESCs在分化的不同时期基因的表达及其与原代人牙龈上皮细胞（human gingival epithelial cells,HGECs）、人永生化口腔上皮细胞（human immortalized oral epithelial cells,HIOECs）、人永生化皮肤角质形成细胞HaCaT的基因表达差异;利用免疫组织化学检测不同标志物在K-hESCs的蛋白表达。结果：运用上皮分化培养基成功地诱导hESCs分化为上皮样细胞K-hESCs; K-hESCs核型具有正常46条染色体,无结构异常;K-hESCs中角质形成细胞标志物基因p63的表达明显低于HaCaT细胞（P<0.05）,而与HGECs和HIOECs中的表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论：运用上皮分化培养基可成功诱导hESCs分化为具有正常核型的K-hESCs;标志物的表达特点提示诱导hESCs分化为K-hESCs的过程是从hESCs向单层上皮干细胞分化继而转向复层上皮终末分化发展的趋势,最终得到的K-hESCs类似于单层鳞状上皮干细胞向终末分化初始阶段的角质形成细胞,该阶段的细胞由上皮干细胞静止状态被激活,处于分化初始高增殖活力阶段。     

人支气管上皮细胞体外不同培养基培养效果比较

目的：比较胎牛血清培养基,小牛血清培养基对经纤维支气管镜（纤支镜）刷检人支气管上皮细胞培养存活率的差异。方法：采用不同细胞培养液,对经纤支镜刷检获得的人支气管上皮细胞进行原代培养,并通过倒置相差显微镜观察原代培养细胞,比较细胞的存活率。结果：胎牛血清培养基细胞成活率比其他培养基高。结论：胎牛血清培养液可提供较为满意的生长条件。     

转移性乳腺癌上皮特异性细胞粘附分子(EpCAM)mRNA阳性循环肿瘤细胞检测及其临床价值

目的:以上皮特异性细胞粘附分子(epithelial cellular adhesion molecule,EpCAM)为标志,用实时定量PCR的方法检测转移性乳腺癌循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)。方法:以实时定量PCR的方法检测47例转移性乳腺癌患者及20例健康志愿者EpCAM mRNA的表达,并与原发灶病理特征、转移部位、疗效和疾病进展时间(time to progression,TTP)做相关分析。结果:化疗前和第1周期化疗后转移性乳腺癌患者的EpCAM mRNA阳性率分别37.8%和42.6%,20例健康志愿者均为阴性。转移性乳腺癌患者生存分析显示,第1周期化疗后,EpCAMmRNA阳性的患者与EpCAM mRNA阴性的患者相比,中位TTP明显缩短,分别为7.1个月和11.1个月(P=0.013)。亚组分析显示,一线和二线化疗的患者,TTP存在明显差别(P=0.018),而三线及三线以上化疗的患者TTP无明显差别(P=0.471)。结论:转移性乳腺癌中,EpCAM mRNA的阳性率约为40%。第1周期化疗后,EpCAMmRNA阳性的患者中位TTP明显缩短。     

人、兔、大鼠脂肪基质细胞的生物学性状对比

目的：探讨在同一质量控制条件下,人、兔、大鼠来源脂肪基质细胞(adipose tissue-derived stromal cells,ADSCs)的体外生物学性状的异同。方法：分离培养人吸脂来源ADSCs、兔及大鼠腹股沟皮下脂肪垫来源ADSCs,体外观察3种细胞原代和传代细胞的形态及生长情况,MTT法检测细胞增殖情况。以相同密度将第2代细胞接种于24孔板,并诱导其成骨及成脂向分化。成骨诱导培养基包含100 nmol/L地塞米松、50 μmol/L抗坏血酸二磷酸酯和10 mmol/L β-甘油磷酸钠,在成骨向诱导后的第3、7、14、21天行碱性磷酸酶染色,第14、28天行茜素红染色,定量分析3种细胞体外钙沉积能力。成脂向诱导培养基包含1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰岛素、200 μmol/L 吲哚美辛和0.5 mmol/L异丁基黄嘌呤,在成脂向诱导后的第7、14天行油红O染色检测细胞的成脂分化状况。结果：3种来源的脂肪均可分离培养出“成纤维细胞样”细胞,均能成脂向分化和成骨向分化,但兔ADSCs在成骨向分化时碱性磷酸酶染色呈弱阳性,无明显钙结节形成,与其他两种细胞比较,兔ADSCs的成骨向分化能力较差。结论：与人来源和大鼠来源ADSCs比较,兔皮下脂肪来源ADSCs的体外成骨能力较差,将其用于体内成骨研究时需慎重。     

体外培养口腔粘膜白斑上皮细胞

目的：建立稳定的人口腔粘膜白宽上皮细胞体外培养体系。方法：用离解蛋白酶（DispaseⅡ）分离上皮及皮下组织。采用改良的无血清及无3T3细胞的培养体系培养口腔粘膜白斑上皮细胞。结果：用DispaseⅡ可成功分离上皮和皮下组织。细胞生长曲线显示改良无血清角化细胞培养液（Defined K-SFM）可明显促进口腔粘膜白斑上皮细胞的分裂增殖。此实验上皮细胞可传6～7代。结论：Defined K-SFM可显著促进口腔粘膜白斑上皮细胞的分裂和成熟,为癌前病变研究提供足够寿命的体外细胞。