p53C—末端356—393氨基酸对人肺癌细胞恶性表型的影响

目的：根据p53蛋白中心区与特殊DNA序列结合活性，受到C－末端氨基酸负面影响，研究去掉C－末端氨基酸残基外源p53，是否增加对人肺癌细胞恶性生长的抑制。方法；利用DNA重组技术，构建去掉C－末端356－393区37个氨基酸p53和全工p53的真核细胞表达质粒，（PEGFP－p53(del),PEGFP-p53)。经lipofectin介导转染有p53缺失和突变的人肺癌细胞801D，G418筛选，建立单克隆转染细胞系，PCR检测外源基因，镜检细胞绿色荧光（GFP）蛋白表达，细胞集落形成试验检测细胞体外恶性增殖能力。FAX检测细胞周期，行裸鼠移植瘤试验检测细胞体内恶性增殖能力。结果：获转染细胞克隆系PEGFP－p53(del)-801D、PEGFP－p53-801D。PEGFP－801D．PCR证明外源基因在细胞中存在，镜检证明绿荧光蛋白在细胞中表达。体外集落形成实验证明PEGFP-p53(del)-801D集落形成抑制率为99．6％，PEGFP－p53-801D为81％。PEGFP-p53(del)-801D细胞恶性增殖能力明显低于PEGFP-p53-801D。P＜0．01。裸鼠移植瘤实验证明PEGFP-p53(del)-801D和PEGFP-p53-801D恶性增殖增殖能力明显降低。PEGFP-p53(del)-801D移植瘤细胞中可检测出绿荧光蛋白表达，证明外源p53(del)基因在肿瘤中存在和表达，也显示出PEGFP-p53(del)-801D和PEGFP-p53-801D仍有活的癌细胞存在。结论：去掉C－末端356－393氨基酸残基外源p53明显增加对801D细胞体外恶性增殖抑制。801D细胞对外源p53抑癌作用存在“异质性”。     

p53缺失和突变对人肺癌细胞系恶性表型影响的比较

目的 比较研究外源正义和反义p53对所转染细胞系恶性表型的影响。方法 构建正义和反义p53C—DNA真核细胞表达载体pEGFP—p53(RS)，pEGFP—p53(AS)，载体有绿荧光蛋白基因监测基因转染和表达。经酶切图证明p53正向或反向联结。Liipofectin介导转染801D细胞(801D细胞有p53缺失和突变，蛋白表达阳性)，G418筛选，建立单克隆细胞系。PCR检测外源p53和neo基因。荧光显微镜检查转染细胞绿荧光蛋白表达。免疫组化染色证明突变蛋白表达。比较了pEGFP—p53(AS)和pEGFP—p53(RS)集落形成试验，裸鼠移植试验。FCM分析细胞周期。结果 酶切图证明pEGFP—p53(RS)和pEGFP—p53(AS)的p53c—DNA(RS)分别正向和反向联结质粒pEGFP。Lipofectin介导转染细胞801D细胞，G418筛选，获耐受集落，建立单细胞克隆转染细胞系pEGFP—p53(RS)—801D，pEGFP—p53(AS)801D和pEGFP—801D。PCR检测外源p53和neo基因存在于细胞，细胞可见绿色荧光，证明外源基因存在并稳定表达。免疫组化检测pEGFP—p53(AS)—801D，突变蛋白呈阴性，母系为阳性，显示反义p53封闭突变蛋白表达。pEGFP—p53(RS)—801D和pEGFP—p53(AS)801D细胞集落形成率和裸鼠移植成瘤率均降低，pEGFP—p53(RS)-801D更低。FCM分析细胞周期延滞。结论 有p53缺失和突变的人肺癌细胞系801D体内外恶性增殖明显，在同一细胞背景下，p53缺失比p53突变对恶性增殖起更重要作用。外源野生型p53在肿瘤细胞中可重建抑癌功能，外源反义p53可封闭突变蛋白表达，阻止细胞停留于G1期。     

p53基因增强非小细胞肺癌细胞对顺铂化学敏感性的研究

我们以具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的p53基因加入肺癌细胞培养板上,观察它对DNA损伤药顺铂（cisplatin,CDDP）抑癌作用的影响,从分子水平上为提高肺癌疗效拓展新的途径。材料与方法（1）材料：非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系LTEP-a-2购自中国科学院上海细胞生物研究所。表达型p53质粒：由美国华盛顿大学吴坡博士赠送。SA阳离子脂质体：购自中国科学院上海生物化学研究所。CDDP：锦州制药厂产,批号961201－4。(2)基因转染：收获对数生长期的LTEP-a-2细胞,继续培养24小时,取所需量的p53cDNA质粒,以每μg质粒50μl的不含小…     

顺铂诱导的人NCI-H460细胞获得性耐药与p53基因突变的关系

目的　探讨p53基因突变与肺癌化疗后获得性耐药的关系。方法　采用顺铂(DDP)大剂量(50μmol/L)间歇诱导法,体外诱导具有野生型p53基因的人大细胞肺癌NCIH460细胞株,建立多药耐药细胞系H460/DDP;用免疫细胞化学法检测P糖蛋白(Pgp)、多药耐药相关蛋白(MRP1)、肺相关蛋白(LRP)、拓扑异构酶Ⅱ(TOPOⅡ)、谷胱甘肽转移酶π(GSTπ)及P53蛋白的表达状况;用荧光免疫法测定P53蛋白磷酸化状态;对p53cDNA全长进行扩增及测序,用含野生型p53基因的质粒pShuttleCMVwtp53cDNA转染耐药细胞,测定转染细胞的药物敏感性。结果　新建立的人大细胞肺癌多药耐药株H460/DDP,对DDP及卡铂的耐药指数分别为1021和998,对氟尿嘧啶、多柔比星、表柔比星、甲氨蝶呤、依托泊苷及异长春新碱等有不同程度的交叉耐药。多药耐药株H460/DDP细胞的P53蛋白滞留于细胞浆,在DDP刺激下不能发生磷酸化;LRP表达明显增加(P<005);但其他耐药相关蛋白水平与DDP诱导前相比差异无统计学意义(P>005);耐药株细胞p53基因第277位点后插入一个“t”;耐药株转染pShuttleCMVwtp53cDNA后,其耐药性可发生部分(532%)逆转。结论　铂类化疗药物诱导的NCIH460细胞p53基因突变与其对化疗药物耐药性的产生有密切关系,p53基因替代疗法可能是克服这类获得性耐药的一个有效方     

重组人p53腺病毒联合顺铂治疗NSCLC合并胸腔积液临床研究

目的本研究评价重组人p53腺病毒注射液（rAd-p53）联合顺铂治疗肺癌所致胸腔积液的临床疗效和毒副反应。方法将38例非小细胞肺癌（NSCLC）合并胸腔积液患者随机分为治疗组和对照组两组。所有患者均在第1、8 d应用吉西他滨1.0 g/m2静脉点滴,每3周重复1次。在上述治疗基础上,治疗组胸腔内注入rAd-p53 1×10^12 VP和顺铂30 mg/m2每次;对照组仅胸腔内注入顺铂30 mg/m2每次,两组均每周重复1次,连用4次后观察疗效。结果治疗组和对照组的有效率分别为80.95%和47.06%（P〈0.05）;治疗组和对照组的一般状况改善率分别为66.67%和29.41%（P〈0.05）;两组患者主要不良反应均为发热、胸痛、消化道反应及白细胞减少,治疗组发热的发生率高于对照组（P〈0.05）,主要为自限性,36 h后一般都能自行恢复。结论重组人p53腺病毒注射液联合顺铂治疗肺癌所致胸腔积液疗效确切,安全,值得临床推广使用。     

靶向表皮生长因子受体的RNA干扰技术对非小细胞肺癌细胞株A549细胞抑制及顺铂敏感性的研究

目的 利用RNA干扰(RNAi)技术,将携带表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)同源基因的重组质粒稳定转染非小细胞肺癌细胞株A549细胞,观察其对A549细胞生长抑制作用及对顺铂敏感性的变化.方法 根据RNAi原理,体外设计并合成靶向EGFR特异性干扰片段,即h-EGFR,以pGensil-1为载体,构建重组质粒pGensil-1-EGFR,以Lipofectamine 2000介导转染肺腺癌细胞株A549细胞,经G418筛选后挑选出稳定转染的单克隆细胞.将所挑选出的单克隆细胞大量培养后加入不同浓度顺铂(40 mg/L、10 mg/L、2.5 mg/L),采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞活力,绘制生长曲线,流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡的变化,观察RNAi对A549细胞抑制作用及是否与顺铂有协同作用.结果 与对照组、阴性对照组相比,从第2天起实验组生长缓慢,吸光度有统计学差异(P＜0.05);顺铂或联合dsRNA-EGFR对A549细胞有抑制作用,且随着浓度的增加和时间的延长抑制作用增强,dsRNA-EGFR联合顺铂与等浓度顺铂吸光度有统计学差异(P＜0.05),顺铂作用24 h后40 mg/L、10 mg/L、2.5 mg/L顺铂抑制率分别提高了7.8%、30.70%、34.42%.实验组G0/G1细胞百分比较对照组增加了13.84%,较阴性对照组增加了14.65%,进入S期的细胞百分比较对照组减少了19.10%,较阴性对照组减少了18.68%;40 mg/L、10 mg/L、2.5 mg/L顺铂处理细胞24 h后,与对照组相比,凋亡率明显增高(P＜0.05),且浓度越高,凋亡率越高;同一浓度顺铂作用下转染pGensil-1-EGFR的A549细胞凋亡率较A549细胞增高(P＜0.05).结论 dsRNA-EGFR可有效抑制A549细胞生长,使细胞阻滞在G0-G1期,顺铂可有效诱导细胞凋亡,RNAi与顺铂具有协同效应,提高细胞对顺铂的敏感性,RNAi技术为非小细胞肺癌基因治疗提供了新策略.     

转染p53基因对培养的人动脉平滑肌细胞的影响

目的:探讨转染野生型p53(wtp53)基因对培养的人动脉平滑肌细胞(HASMCs)的影响,为冠状动脉支架内再狭窄的治疗提供新的思路。方法:以Lipofectamine 2000脂质体介导wtp53基因转染HASMCs株后,用免疫组化染色法检测转染wtp53基因后,其编码蛋白在HASMCs中的表达。绘制wtp53基因转染后HASMCs的增殖曲线。用WST-1法测定A值,并计算细胞生长的抑制率。用流式细胞仪检测wtp53基因转染对HASMCs凋亡的影响。结果:免疫组化染色法显示,wtp53基因转染后,在HASMCs的细胞核内高表达;wtp53基因的表达可抑制HASMCs的体外生长。HASMC/wtp53细胞的生长曲线较对照组明显降低;WST-1法显示,HASMC/wtp53的细胞活力与对照组相比有显著性差异(P0.05)。流式细胞仪检测显示,转染wtp53基因的HASMCs的凋亡率达40%以上,显著高于对照组。结论:转染wtp53基因对HASMCs具有明显的抑制和凋亡作用,提示wtp53基因转染HASMCs技术有可能为人冠状动脉支架内再狭窄的治疗提供一种新的防治策略与手段。     

p38MAPK抑制剂增强人宫颈癌细胞对顺铂的敏感性

目的 探讨p38 MAPK抑制剂通过蛋白激酶B(Akt)有关的信号途径对人宫颈癌细胞顺铂(CDDP)化疗敏感性的影响.方法 应用CDDP和p38MAPK特异性抑制剂SB203580及两者联合应用处理人宫颈癌Hela细胞株.采用MTT法检测化疗药物对肿瘤细胞的生存抑制率,Western印迹技术检测化疗药物处理后Akt和磷酸化Akt的表达水平.结果 MTT显示CDDP和SB203580对人宫颈癌细胞均有抑制作用(24.34％,36.58％),两者相同用量联合后癌细胞抑制率更明显(58.76％).Western印迹结果说明CDDP处理组与联合处理组Akt表达水平无明显差异,而pAkt水平较SB203580组和联合组显著升高.结论 p38 MAPK抑制剂SB203580可能通过阻断PI3K/Akt途径或其他有关Akt的通路提高人剧颈癌细胞CDDP化疗的敏感性.     

Survivin反义寡核苷酸联合顺铂诱导肺癌细胞凋亡的研究

Survivin属于凋亡抑制蛋白（IAP）基因家族中的新成员，在多数肿瘤组织中高表达，但不表达于终末分化组织。该基因在肺癌组织的表达率达72％，且具有抗细胞凋亡和促进细胞增殖的双重作用。我们前期的研究已证实：Survivin反义寡核苷酸（ASODN）能有效抑制肺癌细胞株NCI-H446 Survivin mRNA和蛋白的表达，并诱导凋亡，抑制细胞生长。顺铂是目前治疗肺癌最常用的一线化疗药，但因严重毒副作用和耐药性的产生限制了它的应用。如何提高顺铂抗癌效果、减少耐药和毒副作用是改善肺癌预后的关键之一。本研究合成Survivin ASODN，转染人肺癌细胞株NCI-H446，并与顺铂联用，观察其抗癌效果，为肺癌治疗提供新的理论基础和实验依据。     

野生型p53对肝癌细胞POLD1基因表达及细胞恶性表型的影响

目的:探讨野生型p53对人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖和细胞恶性表型影响的一种可能机制,方法:设计并构建p53特异性小干扰shRNA绿色荧光真核表达质粒(p53-siRNA)和表达EGFP-p53融合蛋白的p53绿色荧光真核增强表达质粒(pEGFP-p53),通过脂质体Lipofection-2000介导转染,将...     

RNAi技术对A549细胞survivin基因表达及顺铂敏感性的影响

目的 利用RNA干扰(RNAi)技术沉默抗凋亡基因survivin,观察其对人肺腺癌细胞A549增殖以及顺铂药物敏感性的影响.方法 将靶向survivin的基因片段插入到载体后构建重组质粒,将其导入A549细胞,RT-PCR及免疫荧光法分析转染前后A549细胞survivin mRNA及蛋白的表达情况,MTT法检测转染后A549细胞对顺铂的敏感性变化.结果 成功构建pGenesil1.1-survivin重组质粒.转染重组质粒后,A549细胞survivin mRNA和蛋白的表达明显降低;转染前顺铂对A549细胞的IC50明显高于转染后(P＜0.05).结论 靶向survivin的RNAi表达载体能下调survivin基因表达,增强顺铂对A549细胞的药物敏感性.     

重组人p53腺病毒注射液联合顺铂治疗恶性腹水的疗效和安全性

目的探讨重组人p53腺病毒注射液联合顺铂治疗恶性腹水的疗效和安全性。方法回顾性分析23例采用重组人p53腺病毒注射液联合顺铂治疗恶性腹水患者的临床资料。结果 23例患者中,完全缓解8例,部分缓解11例,稳定2例,进展2例,有效率82.6%,疾病控制率91.3%,中位无进展生存时间4.1个月,中位生存总时间8.6个月,1年生存率为21.7%。主要不良反应为发热、寒战、腹痛等,均为1～2级;经对症、支持治疗后,均恢复。结论重组人p53腺病毒注射液联合顺铂治疗恶性腹水的近期疗效显著、安全性好,不良反应轻,是可供选择的治疗方案。     

外源野生型p53基因表达对人肺癌细胞药物敏感性影响及其机制研究

目的 了解外源野生型ｐ５３（ｗｔｐ５３）基因表达对人大细胞肺癌８０１－Ｄ细胞对化疗药物敏感性的影响。方法 脂质体地构建的含ｗｔｐ５３基因载体转染８０１－Ｄ细胞，经ＰＣＲ检测外源ｗｔｐ５３在宿主细胞存在情况，流式细胞术（ＦＡＣＳ）确认其功能活性。＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法测定８０１－Ｄ细胞转染ｗｔｐ５３后药物敏感性变化；ＤＮＡ断裂和形态学方法分析药物作用后细胞死亡方式。结果 脂质体介异转染ｗｔｐ５３的８０     

恩度联合紫杉醇和顺铂治疗晚期非小细胞肺癌的疗效及心血管毒性

目的 观察抗肿瘤新药重组人血管内皮抑素注射液恩度联合紫杉醇、顺铂治疗晚期非小细胞肺癌的疗效及心血管毒性.方法 43例晚期非小细胞肺癌患者接受恩度联合紫杉醇和顺铂方案治疗,每3周为1个周期.用药1周期后评价毒性,2周期后评价疗效.结果 总共完成的治疗周期数为166个,平均3.86个周期,完全缓解为4.6%(2/43),部分缓解为44.19%(19/43),总有效率为48.79%,疾病控制率为81.4%(35/43),一年生存率为51.2%;中位总生存期12.2月.有67.44%的患者(29/43)生活质量改善,仅14.0%(6/43)的患者出现生活质量下降.G3/4级的毒性有19例次,主要是血液学毒性,有5例在治疗后出现了心电图变化,表现为T波和ST-T段改变及一过性室上性心动过速;停药后自动恢复正常,行心脏彩超及心肌酶谱、肌钙蛋白等检查均无异常.6例出现了轻至中度血压升高,主要为既往有高血压的患者在用药期问出现的血压波动,1例出现重度高血压,多可以通过降压药物控制,未见长期血压升高者.结论 恩度联合紫杉醇和顺铂方案一线治疗晚期非小细胞肺癌疗效可靠,对心血管的毒性可以耐受,该方案毒性低、安全性好.     

非小细胞肺癌组织中HOX转录反义RNA的表达变化及意义

目的 观察HOX转录反义RNA(HOTAIR)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达变化,并探讨其临床意义。方法 收集125例NSCLC患者的肿瘤组织及其瘤旁正常肺组织,采用实时RT-PCR法检测HOTAIR的表达。检索高通量基因表达数据库(GEO)、Array Express数据库中NSCLC组织与HOTAIR表达相关的芯片数据。结果125例患者中,HOTAIR在NSCLC组织中的表达高于癌旁正常肺组织(P<0.05)。HOTAIR表达水平与NSCLC患者年龄、肿瘤直径、淋巴结转移、TNM分期有关(P均<0.05)。从数据库检索出的基因芯片显示HOTAIR表达水平与肿瘤病理类型不相关(P>0.05)。结论 HOTAIR在NSCLC组织中呈现高表达,可能参与NSCLC的发生发展。     

转化生长因子β1及p53基因蛋白在非小细胞肺癌中的表达

转化生长因子β１（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒβ１,ＴＧＦβ１）是一种多功能细胞生长调控因子。ｐ５３基因是一种重要的抑癌基因。对象与方法　我们应用免疫组化ＬＳＡＢ法检测了我院１９８９～１９９１年手术切除的１２１例非小细胞肺癌中ＴＧＦβ１和Ｐ５３蛋白的表达并探讨两者间的相互关系。术后均随访５年以上（表１）。结果　ＴＧＦβ１在非小细胞肺癌中阳性表达可分为：①间质型：阳性显色位于癌巢周围纤维结缔组织及癌旁纤维间质内;②胞浆型：阳性显色位于癌细胞胞浆内。总阳性表达率为７７－７％（９４…