弓形虫可溶性抗原联合γ干扰素鼻内免疫小鼠的抗弓形虫感染作用

目的探讨弓形虫可溶性抗原(STAg)和γ干扰素(IFN-γ)联合鼻内免疫对小鼠的保护作用及IFN-γ作为佐剂鼻内免疫抗弓形虫感染的最佳剂量。方法将5~6周龄BALB/c小鼠70只随机分为5组,每组14只,分别用20μgSTAg、20μgSTAg 250UIFNγ-、20μgSTAg 500UIFNγ-、20μgSTAg 1000UIFN-γ和20μgSTAg 2000UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次,间隔14d,末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击,逐日观察小鼠健康存活情况。攻击后第29天处死全部小鼠,分离计数脑、肝组织速殖子;计数肠系膜淋巴结(MLN)和脾T淋巴细胞。结果随着佐剂IFN-γ剂量的增加,小鼠存活率有升高趋势,1000UIFN-γ剂量组小鼠存活率最高达93%;肝、脑速殖子数呈下降的趋势,其中STAg 1000UIFN-γ、STAg 2000UIFN-γ组显著低于STAg组;MLN和脾T淋巴细胞发生了增殖性应答,其中STAg 1000UIFNγ-、STAg 2000UIFN-γ组MLN细胞显著高于STAg组。结论STAg 1000UIFNγ-、STAg 2000UIFN-γ鼻内免疫明显优于其它小剂量佐剂及单独抗原免疫,能有效诱导黏膜免疫应答。     

弓形虫复合粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的Peyer''''s patches持续性细胞免疫应答

目的以可溶性速殖子抗原（soluble tachyzoite antigen，STAg）和霍乱毒素（choleratoxin，CT）佐剂制备的弓形虫复合粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠，观察肠粘膜诱导部位Peyer’s patches（PP）的细胞免疫应答及持续时间，探讨其免疫机制。方法BALB／c小鼠96只，随机分为实验组和对照组，实验组以STAg（20μg／只）为抗原，CT（1／μg／只）为佐剂滴鼻免疫，对照组PBS滴鼻。滴鼻2次（间隔2周）后，每组6只小鼠分别于第1、2、3、4、6、8、10、12周处死。计数PP个数，制备PP淋巴细胞悬液，计数并涂片；免疫细胞化学法检测CD4^＋、CD8^＋T细胞亚群。结果实验期间两组小鼠PP数目均无明显变化；实验组免疫后PP淋巴细胞数量明显增生，第2周达高峰，第1、2、3周显著高于对照组（P〈0.05），其中以CD4^＋T细胞增生为主，第1周～第8周高于对照组（P〈0.01），CD8^＋T细胞第1周～第4周显著增高（P〈0.01），CD4^＋／CD8^＋比值无显著变化（P〉0．05）。结论弓形虫复合粘膜疫苗滴鼻免疫BALB／c小鼠可有效诱导肠PP部位持续性的免疫应答，从而激活肠粘膜效应部位淋巴细胞的抗弓形虫感染作用。     

弓形虫复合粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠诱导的Peyer’s patches持续性细胞免疫应答

目的以可溶性速殖子抗原（soluble tachyzoite antigen，STAg）和霍乱毒素（choleratoxin，CT）佐剂制备的弓形虫复合粘膜疫苗滴鼻免疫小鼠，观察肠粘膜诱导部位Peyer’s patches（PP）的细胞免疫应答及持续时间，探讨其免疫机制。方法BALB／c小鼠96只，随机分为实验组和对照组，实验组以STAg（20μg／只）为抗原，CT（1／μg／只）为佐剂滴鼻免疫，对照组PBS滴鼻。滴鼻2次（间隔2周）后，每组6只小鼠分别于第1、2、3、4、6、8、10、12周处死。计数PP个数，制备PP淋巴细胞悬液，计数并涂片；免疫细胞化学法检测CD4^＋、CD8^＋T细胞亚群。结果实验期间两组小鼠PP数目均无明显变化；实验组免疫后PP淋巴细胞数量明显增生，第2周达高峰，第1、2、3周显著高于对照组（P〈0.05），其中以CD4^＋T细胞增生为主，第1周～第8周高于对照组（P〈0.01），CD8^＋T细胞第1周～第4周显著增高（P〈0.01），CD4^＋／CD8^＋比值无显著变化（P〉0．05）。结论弓形虫复合粘膜疫苗滴鼻免疫BALB／c小鼠可有效诱导肠PP部位持续性的免疫应答，从而激活肠粘膜效应部位淋巴细胞的抗弓形虫感染作用。     

重组人IL-2联合STAg鼻内免疫BALB/c小鼠诱导的免疫应答

目的观察重组人白细胞介素-2（rhuIL-2）联合弓形虫可溶性速殖子抗原（STAg）滴鼻免疫小鼠诱导的免疫应答,探讨rhuIL-2的佐剂效应及适宜剂量。方法5～6周龄BALB/c小鼠60只,随机分为6组,每组10只。实验组以STAg20μg或分别加rhuIL-2250、500、1000、2000 IU滴鼻免疫,抗原与佐剂溶于20μlPBS中,对照组以PBS滴鼻,免疫2次,间隔2周。末次免疫后30d,颈椎脱臼处死全部小鼠,ELISA法检测血清IgG和粪便sIgA水平;分离脾淋巴细胞、肠上皮内淋巴细胞（iIEL）,并计数。结果与PBS组相比,各佐剂组血清IgG水平都有增高,其中STAg＋500 IU IL-2组IgG水平增高最显著（P〈0.01）;STAg＋500 IU IL-2组和STAg＋1000 IU IL-2组粪便sIgA抗体水平显著高于PBS组和STAg组（P〈0.05）。联合IL-2佐剂免疫小鼠脾淋巴细胞和产生了增殖性应答,其中STAg＋500 IU IL-2组和STAg＋1000 IU IL-2组脾淋巴细胞数显著高于PBS组和STAg组（P〈0.05）;TAg＋500 IU IL-2组iIEL高于PBS组（P〈0.05）。结论rhuIL-2作为佐剂联合STAg鼻内免疫小鼠可有效诱导粘膜免疫、系统的细胞免疫和体液免疫应答;500 IU IL-2为鼻内免疫小鼠的适宜剂量。     

霍乱毒素联合弓形虫排泄-分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的GALT和NALT黏膜免疫应答

目的观察霍乱毒素(CT)联合弓形虫排泄-分泌抗原(ESA)鼻内免疫小鼠诱导的肠相关淋巴组织(GALT)和鼻相关淋巴组织(NALT)黏膜部位的免疫应答。方法将48只5~6周龄BABL/c小鼠随机均分为3组,分别用PBS、ESA和CT+ESA滴鼻免疫小鼠2次,间隔2周。末次免疫后14 d,处死小鼠,ELISA测定小鼠粪便和鼻咽冲洗液sIgA抗体水平;计数派伊尔淋巴集结(PP)、肠上皮淋巴细胞(IEL)、NALT和鼻通道(NC)淋巴细胞数,免疫细胞化学法检测CD4+、CD8+T细胞亚群水平。结果免疫后14 d,CT+ESA组小鼠鼻咽冲洗液和粪便sIgA水平显著高于ESA组和PBS组(P<0.01);CT+ESA和ESA组小鼠GALT部位的PP淋巴细胞显著增生,主要以CD4+T细胞为主;而IEL以CD8+T细胞增生为主,CD4+/CD8+比值降低(P<0.05)。CT+ESA NALT内淋巴细胞明显增生。CT+ESA组NC淋巴细胞显著升高(P<0.01),以CD4+T细胞增生为主。结论 CT佐剂联合ESA滴鼻免疫BALB/c小鼠可诱导GALT和NALT黏膜部位免疫应答。     

不同剂量STAg滴鼻免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染作用

目的观察不同剂量可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)滴鼻免疫小鼠诱导抗弓形虫感染作用,确定STAg滴鼻免疫最佳剂量。方法BALB/c小鼠50只随机分为5组,实验组分别用5μg、10μg、20μg、30μg STAg/只滴鼻免疫小鼠2次,间隔2周,对照组用PBS滴鼻。末次免疫后第14d,用4×104个速殖子/只灌胃攻击全部小鼠,观察小鼠健康和死亡情况,记录体重。攻击后第30d检测粪便IgA和血清IgG,计数脾、脑组织内弓形虫速殖子,分离并计数小肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)。结果20μg和30μg组小鼠存活率高于5μg、10μg及对照组。攻虫后对照组小鼠体重逐渐降低,而5μg组,10μg组(P<0.05),20μg组(P<0.05)和30μg组(P<0.05)小鼠体重仍呈增高趋势。20μg和30μg组脾、脑组织内虫荷(速殖子数)显著低于5μg、10μg组和对照组(P<0.05),实验组粪便IgA,血清IgG及IEL数量高于对照组。结论不同剂量STAg滴鼻免疫小鼠均可诱导抗弓形虫感染,20μg或30μgSTAg滴鼻免疫可诱导更有效的抗弓形虫感染保护作用     

TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫脾淋巴细胞免疫应答

目的研究速殖子超声裂解物(TSo)和IFN-γ鼻内免疫小鼠经口感染弓形虫速殖子后,脾T细胞亚群的动态变化。方法将6~7周龄BALB/c小鼠100只随机分为4组,每组25只。分别用10μlPBS、20μgTSo、500UIFN-γ和20μgTSo 500UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次,间隔2周。末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击。分别于攻击后第7、10、13、16、19天处死小鼠,制备脾淋巴细胞悬液并涂片,免疫细胞化学法检测脾CD4 、CD8 T细胞亚群。结果攻击后第16、19天TSo IFN-γ组脾CD4 T细胞比率较第10天升高(P<0.05);脾CD8 T细胞第10、13、16、19天呈现较高水平;CD4 /CD8 比值第10、13天出现倒置。结论TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠可激发系统免疫反应,提高其细胞免疫应答水平,增强脾CD8 T细胞的细胞毒作用,抵抗弓形虫感染。鼻黏膜免疫是一种安全有效的免疫接种途径。     

弓形虫亲环蛋白亚单位疫苗的免疫保护性研究

目的研究弓形虫亲环蛋白(Cyclophilin,CyP)亚单位疫苗的免疫保护性。方法 30只BALB/c小鼠随机分为3组:实验组、佐剂组和PBS对照组,分别肌注pET-28a-TgCyP重组蛋白100μg/只、佐剂100 ul/只和PBS 100 ul/只,共免疫3次,每次间隔2周。末次免疫后2周,各组分别取4只小鼠处死,取脾脏,检测CD4+、CD8+及细胞因子。同时,采用阿尔玛蓝细胞增殖与细胞毒性检测试剂测定小鼠脾淋巴细胞的增殖应答。其余小鼠腹腔攻击感染Rh株弓形虫速殖子500个,观察其存活情况。结果 pET-28a-TgCyP重组蛋白亚单位疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,小鼠的CD4+T细胞(62.59±4.17)%、CD8+T细胞(8.53±0.46)%与PBS及佐剂对照组比较显著增殖(P<0.01),其脾细胞培养液白细胞介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)显著升高,小鼠脾淋巴细胞增殖应答显著增强(P<0.01)。弓形虫攻击感染216 h后,实验组小鼠免疫保护率为33.3%,佐剂对照组及PBS对照组小鼠均全部死亡。结论 pET-28a-TgCyP重组蛋白亚单位疫苗具有较强的免疫原性,能...     

TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠的抗弓形虫感染保护作用

目的研究速殖子超声裂解物(TSo)联合IFN-γ鼻内免疫小鼠抗弓形虫感染的保护作用。方法将6~7周龄BALB/c小鼠100只随机分为4组,每组25只。分别用PBS 10μl、20μg TSo、500 U IFN-γ和20μg TSo+500 UIFN-γ鼻内免疫小鼠2次,间隔2周。末次免疫后第10 d,用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击。分别于攻击后第7、10、13、161、9 d处死小鼠,计数脑、肺、肝组织内弓形虫速殖子,观察其动态变化。结果TSo+IFN-γ鼻内免疫组可使受攻击小鼠脑、肺、肝组织内弓形虫速殖子数减少,攻击后第13和19 d TSo+IFN-γ组小鼠脑内速殖子数比PBS组分别减少63.92%和58.39%(P均<0.05)。结论TSo+IFN-γ鼻内免疫小鼠可产生有效的保护性免疫,可减少脑、肺、肝组织内弓形虫速殖子数。组织内速殖子计数可以作为抗弓形虫感染保护力的重要评价指标。     

阿奇霉素和IFN-γ联用治疗小鼠弓形虫病效果

目的 观察阿奇霉素和IFN-γ联用治疗小鼠弓形虫病的效果及小鼠体内细胞免疫功能的变化.方法 将100只BALB/c小鼠随机分为感染对照组(A组)、阿奇霉素治疗组(B组)、阿奇霉素和IFN-γ治疗组(C组)、IFN-γr治疗组(D组)及空白对照组(E组)5组.A、B、C、D组均用弓形虫速殖子腹腔感染小鼠.B、C、D组于感染后24 h给药,连续5 d,观察10 d内小鼠的平均存活时间.同时在感染后第2、3、5天取小鼠尾静脉血测其CD4~+、CD8~+T细胞水平.结果 C组小鼠存活时间明显延长,各时段CD4~+T细胞水平均显著升高,CD8~+T细胞水平显著降低,CD4~+与CD8~+T细胞比值明显升高.结论 阿奇霉素和IFN-γ联用可提高小鼠弓形虫病的治疗效果,改善弓形虫感染后小鼠体内的细胞免疫功能.     

小鼠腹水中弓形虫排泄分泌抗原鼻内免疫小鼠诱导的免疫应答

目的观察弓形虫感染小鼠腹水中分离的排泄-分泌抗原（excreted/secreted antigens,ESA）鼻内免疫小鼠对不同粘膜部位和系统的免疫效应。方法将5～6周龄BALB/c小鼠随机分为4组,每组10只,实验组分别用从感染弓形虫后24、48、72 h小鼠腹水中提取的ESA 20μg/只鼻内免疫小鼠2次,间隔2周;对照组用20μl/只PBS滴鼻。观察小鼠健康和死亡情况,记录体重。末次免疫后第3周处死小鼠,计数PP（Peyer’s patches）个数;分离PP淋巴细胞、脾淋巴细胞、小肠上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocyte,IEL）及肠系膜淋巴结细胞（mesenteric lymph node lympho-cyte,MLNL）并计数。眼眶采血和收集直肠内粪便,ELISA检测血清特异性IgG水平及粪便sIgA。结果72 h ESA组小鼠免疫后健康状况较差,体重逐渐降低,死亡4只;其他组小鼠体重仍呈增高趋势。各实验组小鼠IEL、MLNL、脾淋巴细胞以及PP淋巴细胞的增殖活性均高于对照组（P〈0.05）,72 h和48 h ESA组高于24 h ESA组（P〈0.01）。免疫后第3周,各实验组小鼠血清IgG、粪便sIgA水平均高于对照组（P〈0.05）,72 h和48 h ESA组高于24 h ESA组（P〈0.01）。结论感染后不同时间提取的腹水弓形虫ESA鼻内免疫小鼠均可诱导不同粘膜部位及系统特异性的免疫应答,48 h ESA的免疫效果最好。     

结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧基酶诱导小鼠细胞和体液免疫应答

目的检测结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法选清洁级BALB/c小鼠60只,随机分为两组,实验组和对照组。实验组每只小鼠用表达的PEPCK融合蛋白10μg加弗氏不完全佐剂进行腹腔免疫注射,对照组小鼠仅用弗氏不完全佐剂注射。每隔2w免疫1次,共免疫3次。末次免疫2w后,分别取小鼠脾脏、血清,流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞,MTT法检测淋巴细胞对刺激的应答水平,ELISA检测血清各种细胞因子及抗PEPCK抗体。结果实验组小鼠的脾脏明显大于对照组小鼠的脾脏,且粘连严重,CD4+T细胞增殖明显(73.5±3.69),CD4+/CD8+比值显著升高(5.1±0.98)(P<0.01);且淋巴细胞的应答能力明显强于对照组小鼠;实验组小鼠血清中IFN-γ、IL-12和TNF-α明显高于对照组,血清抗体滴度随免疫次数逐步增高。结论结核杆菌PEPCK能够有效的刺激机体产生细胞免疫反应和体液免疫反应,尤以细胞免疫反应为主,是很好的抗结核候选疫苗分子之一。     

弓形虫STAg不同途径免疫小鼠诱导的黏膜免疫和系统免疫应答动态变化

目的动态观察弓形虫可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)滴鼻和皮下免疫小鼠诱导的黏膜免疫和系统免疫应答。方法6周龄BALB/c小鼠90只随机分为3组,分别以20μg STAg滴鼻或皮下注射免疫小鼠2次,间隔2周,对照组不做处理。末次免疫后1、2、3、4和5周,每组随机处死6只小鼠。ELISA法测定小肠冲洗液sI-gA和血清IgG,分离并计数小肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)和脾淋巴细胞。结果对照组小鼠小肠冲洗液sIgA水平和IEL数及血清IgG水平和脾淋巴细胞数均维持在较低水平。滴鼻免疫组小鼠小肠冲洗液sIgA水平升高,与对照组比较差异有统计学意义(FsIgA=10.074,FIEL=14.747,P0.01),其中第5周sIgA水平、第2~5周IEL数量与皮下免疫组比较差异有统计学意义(FsIgA=7.862,FIEL=9.807,P0.05)。皮下免疫组小鼠血清IgG水平和脾淋巴细胞数均升高,与对照组比较差异有统计学意义(FIgG=8.207,F脾细胞=11.209,P0.05),第5周脾淋巴细胞数与滴鼻组比较差异有统计学意义(F=6.826,P0.05)。结论20μg STAg滴鼻免疫小鼠诱导的黏膜免疫应答水平优于同剂量的皮下免疫,同时也诱导了较高水平的系统免疫应答。皮下免疫可诱导较高水平的系统免疫应答,但其诱导的黏膜免疫应答较弱。     

弓形虫STAg联合IFN-γ佐剂滴鼻免疫小鼠诱导不同黏膜部位抗体水平动态观察

目的观察弓形虫可溶性速殖子抗原（soluble tachyzoite antigen,STAg）联合IFN-γ佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠后不同黏膜部位抗体水平及其持续时间,为黏膜疫苗研制提供实验依据。方法 84只5~6周龄BALB/c小鼠随机分为免疫组和对照组,每组42只。免疫组以STAg（20μg/只）为抗原加IFN-γ（1 000 U/只）为佐剂滴鼻免疫,对照组以PBS 20μl滴鼻。共滴鼻2次,间隔2周。首次免疫后第0、2、4、6、8、10、12周每组处死6只小鼠,ELISA法测定鼻咽、肺和小肠冲洗液sIgA、IgG水平。结果小鼠用弓形虫STAg联合IFN-γ首次免疫后鼻咽冲洗液sIgA和IgG水平均增高,其中第2、4、6、8周sIgA水平显著高于对照组（P〈0.05）,第2、4、6周IgG水平高于对照组（P〈0.05）;首次免疫后第6、8周小鼠肺冲洗液sIgA水平显著高于对照组（P〈0.05）,第4、6、8周IgG水平高于对照组（P〈0.05）;首次免疫后第2、4、6周小肠冲洗液sIgA水平高于对照组（P〈0.05）,第2、4、6、8周IgG水平高于对照组（P〈0.05）。免疫后不同黏膜部位抗体均以sIgA为主,且以肠道冲洗液最高。结论 STAg联合IFN-γ佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠可诱导鼻咽、肺和小肠黏膜部位产生高水平sIgA和IgG抗体应答,并可持续6~8周。表明滴鼻免疫是弓形虫疫苗的适宜接种途径。     

致敏IEL过继转移诱导抗弓形虫感染的机制

目的分离供体鼠感染弓形虫后不同时间点的小肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)并过继转移,研究其诱导受体鼠抗弓形虫感染作用及其机制。方法BALB/c小鼠经口感染弓形虫速殖子5×104个/只,对照组未感染,作为供体提供IEL。同品系小鼠36只为受体鼠,分为6组,每组6只,经尾静脉分别接受分离自供体鼠感染弓形虫后第7(IEL7组)、9(IEL9组)、11(IEL11组)、13(IEL13组)、15d(IEL15组)的致敏IEL或未致敏(IEL0组,即对照组)的IEL3×105/0.2ml·只。各组小鼠过继转移后第4d,用弓形虫速殖子灌胃攻击,攻击后第13d分离纯化脑、肺、脾组织内速殖子并计数,测定小肠Peyer′s Patch(PP)CD4+、CD8+T细胞亚群水平。结果致敏IEL过继免疫可使受体鼠脑、肺、脾组织内速殖子数显著减少,接受致敏后第13d IEL的小鼠组织内速殖子数减少最为显著(Ρ<0.01),与IEL0组相比,脑、肺和脾组织内速殖子数分别减少81.13%、58.43%和70.97%;同时,小肠PP结CD4+T细胞增多,CD4+/CD8+比值增高(Ρ<0.01)。结论过继转移致敏IEL能显著提高受体鼠的抗弓形虫感染能力,且保护作用同致敏时间关系密切,以感染后13d分离的致敏IEL保护性最强。     

重组弓形虫Peroxiredoxin蛋白联合佐剂皮下免疫小鼠诱导的免疫应答动态变化

目的观察120μg重组peroxiredoxin蛋白(rTgPrx)联合弗氏佐剂皮下免疫小鼠诱导的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。方法 105只6周龄BALB/c小鼠随机分为3组,分别用100μl PBS(PBS组)、120μg rTgPrx(120P组)或120μg rTgPrx+50μl佐剂(120PA组)皮下免疫3次,间隔2周。rTgPrx溶于50μl PBS,首次免疫和加强免疫分别加入弗氏完全佐剂和不完全佐剂。分别在末次免疫后第1、2、3、4、5、6、7周,每组处死5只小鼠,ELISA法检测血清IgG和小肠冲洗液sIgA;分离并计数小肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes,IEL)和脾淋巴细胞。结果 120PA组小鼠免疫后第2~5周血清IgG水平显著高于120P组(F=16.875,P0.05),120P组免疫后第2、3周显著高于PBS组(F=19.417,P0.05);120PA组免疫后第4周小肠冲洗液sIgA水平显著高于120P组(F=14.638,P0.05),于第5周有所下降并保持平稳,但仍显著高于120P组(F=15.316,P0.05);120PA组免疫后第1~4周IEL计数显著高于120P组(F=23.634,P0.05),第2~6周脾淋巴细胞数显著高于120P组(F=15.279,P0.05)。结论 120μg rTgPrx联合弗氏佐剂皮下免疫小鼠可诱导高水平的体液免疫应答及细胞免疫应答。     

TgAMA1和TgRON2抗原表位合成肽鼻内免疫抗小鼠弓形虫病的作用

目的观察含弓形虫顶膜抗原1(TgAMA1)和棒状体颈部蛋白2(TgRON2)T、B细胞抗原表位的多肽鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫病免疫保护作用。方法化学方法合成含有经生物信息学预测的TgAMA1和TgRON2T细胞和B细胞表位多肽。5周龄BALB/c小鼠48只随机分为AMA1组、RON2组、A1+R2组和对照组(n=12),分别用AMA1 30μg、RON2 30μg或(A1+R2)各15μg鼻内免疫,对照组用20μl生理盐水滴鼻,共免疫3次,间隔2周。末次免疫后2周,采用ELISA法检测血清抗体水平;处死小鼠,取鼻、膀胱和肠道洗液,ELISA法检测SIgA水平;无菌取脾,制备脾细胞悬液,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖反应,ELISA法检测淋巴细胞培养上清细胞因子水平;取肝、脑组织,计数速殖子虫荷,以评价免疫诱导的黏膜及系统免疫应答和抗弓形虫感染保护作用。结果用AMA1和RON2多肽免疫小鼠可诱导产生高水平的特异性抗体反应和淋巴增殖反应。肽免疫小鼠血清特异性IgA、总IgG、IgG1和IgG2a水平均高于对照组(P0.05或P0.01),其中A1+R2组最高。小鼠脾淋巴细胞刺激指数(SI)显示,AMA1组(1.171±0.116)、RON2组(1.362±0.110)和A1+R2组(1.941±0.162)高于PBS组(0.743±0.081)(P0.05或P0.01),A1+R2组亦高于单肽组(P0.05)。肽免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ、IL-2和IL-4水平显著高于对照组(P0.05或P0.01)。肽免疫诱导了小鼠高水平的黏膜免疫应答,肽免疫小鼠鼻腔、膀胱和小肠冲洗液SIgA水平均显著高于对照组(P0.05或P0.01)。肽免疫小鼠获得部分抗弓形虫感染保护作用,与对照组比较,肽免疫小鼠肝和脑中速殖子负荷显著降低,减虫率分别为A1+R2组55.79%和55.68%、AMA1组52.36%和46.46%、RON2组40.02%和47.33%(P0.05或P0.01)。结论含有T和B细胞表位的AMA1和RON2肽是一种有效的抗弓形虫病候选抗原,鼻内免疫小鼠可诱导强烈的黏膜和系统免疫应答,两种抗原表位肽联合使用的免疫效应比单用AMA1或RON2更强,抗弓形虫病作用更显著。     

弓形虫复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠抵抗弓形虫感染作用的观察

目的 观察弓形虫复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠诱导的肠黏膜和系统免疫应答及其抗弓形虫感染作用。方法 BALB/c小鼠52只随机分为两组（每组26只），免疫组小鼠用弓形虫复合黏膜疫苗（每毫升含可溶性速殖子抗原1 mg， 霍乱毒素50 μg） 20 μl/只滴鼻免疫2次，间隔2周；对照组用等剂量PBS滴鼻。末次免疫后14 d，各组处死6只，摘眼球取血（0.5～1 ml）；取直肠内粪便（4～5粒），ELISA测定血清IgG和粪IgA抗体；分别计数脾组织、派伊尔集合淋巴结（PP）和肠上皮淋巴细胞（IEL），免疫细胞化学法检测各组织中CD4⁺、CD8⁺ T细胞亚群水平。用RH株弓形虫速殖子（4×10⁴个/只）灌胃攻击感染各组其余小鼠，30 d后颈椎脱位处死，计数肝、脑组织速殖子虫荷。 结果 免疫后14 d，免疫组小鼠血清IgG和粪IgA抗体水平（分别为0.224和0.371），显著高于对照组（分别为0.041和0.037）（P<0.05），脾、PP和IEL中T淋巴细胞与对照组相比明显增生（P<0.01），其中脾、PP中CD4⁺、CD8⁺ T淋巴细胞增殖显著（P<0.05），IEL中以CD8⁺ T细胞为主，增殖显著（P<0.01），CD4⁺/CD8⁺ 比值降低（P<0.05）。攻击后30 d，免疫组小鼠存活率（85.0%）显著高于对照组（45.0%）（P<0.05）。免疫组肝、脑组织速殖子数比对照组分别减少86.3%、86.7%，两组差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 弓形虫复合黏膜疫苗鼻内免疫小鼠，能有效诱导黏膜和系统免疫应答，小鼠存活率显著提高，肝、脑组织虫荷显著降低。     

细粒棘球绦虫重组亲肌肉抗原ZW-15免疫小鼠LncRNA 031520表达的研究

目的探讨长链非编码RNA031520(LncRNA 031520)分子在细粒棘球绦虫重组亲肌肉抗原ZW-15诱导小鼠免疫保护的表达分析。方法 36只雌性BALB/c小鼠分为PBS对照组、弗氏佐剂组和ZW-15免疫组,12只/组。PBS对照组、弗氏佐剂组分别皮下多点注射PBS溶液和完全/不完全弗氏佐剂100μl/只,ZW-15免疫组注射重组抗原100μl/只(10μg/只)。弗氏佐剂组和ZW-15免疫组初次免疫使用完全弗氏佐剂,加强免疫使用不完全弗氏佐剂。共免疫3次,初次免疫后的2次加强免疫间隔时间为两周。免疫小鼠经麻醉取血,分离血清。采用ELISA法检测特异IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b抗体水平。无菌取脾脏,分离淋巴细胞采用流式细胞术分选CD4~+T淋巴细胞、CD8~+T淋巴细胞及B淋巴细胞群;利用qRT-PCR检测CD4~+T淋巴细胞、CD8~+T淋巴细胞、B淋巴细胞及总淋巴细胞中LncRNA 031520及内参GAPDH的表达;利用流式细胞术检测脾脏CD4~+T淋巴细胞中IFN-γ、IL-4的表达。使用SPSS 17.0统计软件和Graphpad Prism 8.0绘图软件对实验数据进行统计分析。结果小鼠经亲肌肉重组抗原ZW-15免疫后血清特异IgG、IgG1、IgG2a及IgG2b抗体水平均升高,且均显著高于PBS组、弗氏佐剂对照组,差异均有统计学意义(P0.001)。LncRNA 031520在ZW-15免疫组CD4~+T淋巴细胞、总淋巴细胞中相对表达量显著高于PBS对照组和弗氏佐剂对照组(P0.01),在ZW-15免疫组B淋巴细胞及CD8~+T淋巴细胞中相对表达量与PBS对照组及弗氏佐剂对照组相比差异均无统计学意义(均P0.05)。免疫组小鼠脾脏淋巴细胞Th1亚群标志分子IFN-γ表达量为(19.07±3.44)%,显著高于PBS对照组(8.03±2.67)%和弗氏佐剂对照组(9.37±1.25)%(P0.05),Th2亚群标志分子IL-4表达量为(0.79±0.02)%,显著高于PBS对照组(0.44±0.13)%和弗氏佐剂对照组(0.50±0.15)%(P0.05)。结论 LncRNA 031520在细粒棘球绦虫重组亲肌肉抗原ZW-15免疫小鼠淋巴细胞中表达上调,可能在亲肌肉抗原抵御细粒棘球蚴感染中发挥免疫保护作用。     

STAg联合CpG ODN和CT鼻内免疫小鼠诱导的特异性抗体应答和脾淋巴细胞的特异性增殖反应

目的 观察可溶性速殖子抗原(STAg)联合CpG寡核苷酸(CpG ODN)和/或霍乱毒素(CT)鼻内免疫BALB/c小鼠后血清IgG、肠冲洗液IgA抗体水平及脾淋巴细胞体外特异性增殖反应,探讨CpG ODN和CT的佐剂效应. 方法 6周龄BALB/c小鼠60只,随机分为5组,分别用20 μl PBS(PBS组)、20 μg STAg(抗原组)、20 μg STAg 10 μg CpG ODN(CpG佐剂组)、20 μg STAg 1 μg CT(CT佐剂组)、20 μg STAg 1 μg CT 10 μg CpG ODN(联合佐剂组)滴鼻,间隔2周,免疫2次.末次免疫后第20 d颈椎脱臼处死小鼠,收集血清和肠冲洗液,ELISA法检测血清弓形虫特异性IgG和肠冲洗液IgA.分离脾淋巴细胞,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测致敏脾淋巴细胞体外增殖活性. 结果 ELISA法测定PBS组、抗原组、CpG佐剂组、CT佐剂组及联合佐剂组小鼠血清IgG A值分别为0.025 6±0.012 1、0.054 2±0.024 4、0.109 4±0.007 5、0.110 1±0.009 1和0.124 6±0.013 7,肠冲洗液IgA A值分别为0.141 8±0.030 2、0.415 2±0.080 7、0.526 9±0.075 4、0.846 5±0.115 5和1.128 9±0.100 3,脾淋巴细胞刺激指数SI分别为1.159 0±0.275 5、1.364 0±0.349 8、1.582 0±0.375 3、1.928 0±0.278 9和2.371 0±0.646 9,差异均有统计学意义(P＜0.01);联合佐剂组肠冲洗液IgA水平和脾淋巴细胞的SI值与CpG佐剂组比较差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 STAg联合CpG ODN和/或CT鼻内免疫小鼠可有效诱导机体免疫反应,两种佐剂联合免疫的效果优于单一抗原或抗原联合单一佐剂.