关于ECV304细胞使用的启示

近期参加了由世界培养物保藏联盟(WFCC)举办由德国培养物保藏中心(DSMZ)承办的第11届国际培养物保藏会议(ICCC)。会议的大部分内容与微生物有关:如不同微生物的分类、信息数据管理的网络化、生物资源中心(biological resourcecenter,BRC)管理规范的推行。有关人类和动物细胞系的内容主要包括:特色细胞(神经内分泌肿瘤细胞)的收集建立,来自ATCC的教授报告近年来文献中大量错误细胞的使用。布告中有韩国细胞库的介绍及近年来他们建立的胃癌及大肠癌的细胞系。DSMZ细胞部门的主任Hans Drexlar教授给我们小组介绍了其细胞质量控制指标…     

反式脂肪酸对ECV304细胞HNP-1mRNA表达和氧自由基的作用

目的:探讨反式脂肪酸(TFAs)对ECV304细胞氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的作用及其机制。方法:按常规方法传代培养ECV304细胞,用实时荧光定量PCR检测不同浓度TEAs刺激(TFA处理组)后ECV304细胞中HNP-1的表达;采用流式细胞仪检测ECV304细胞中氧自由基(ROS)的生成;用脂质氧化产物丙二醛(MDA)生成量描述ECV304细胞LDL氧化能力的变化。并与未行TFAs处理的ECV304细胞对照组比较其组间差异。结果:与对照组比较,TFAS处理组HNP-1mRNA表达水平显著升高(0.220±0.030vs 0.429±0.090,P0.05);与对照组比较,1mmol/L TFAS刺激ECV304细胞12h其ROS水平显著升高(11.30±1.67vs 66.70±6.53,P0.05),在加入不同钙离子拮抗剂后ROS水平明显下降(P0.05);与LDL处理组比较,1mmol/L TFAS+LDL处理组MDA水平也显著升高(0.134±0.027vs 0.155±0.025,P0.05)。结论:反式脂肪酸能促进HNP-1的表达,提高钙离子依赖的自由基水平,从而提高ECV304细胞氧化LDL的能力。     

ECV304细胞可作为一般模型、工具或靶用于生物医学和药学研究

ECV304 was reported first in 1990 as a spontaneously - transformed and immortalized cell line derived from a Japanese HUVEC. Subsequently, many studies validated that the ECV304 is a permanent endothelial cell line. It has been used widely as an endothelial cell model and an useful research tool in biomedicine and pharmacology. However, several distinct differences exist between ECV304 and HUVEC.Some studies even pointed out that ECV304 is not of HUVEC origin. According to the research data including ours, this reportedly endothelial- derived permanent human cell line ECV304 may be dedifferentiated towards an epithehal phenotype. It is therefore not an appropriate cell line to study endothelial cell biology. But cultured ECV304 cells can still be used as a model, tool or target in the pathophysiological and pharmacological studies, depending on whether or not their functional expression or markers are suitable for the research work.     

尿酸对ECV304细胞的NO-NOS通路及ADMA-DDAH系统的影响

目的：观察尿酸（uric acid，UA）对ECV304细胞的NO-NOS通路及ADMA-DDAH系统的影响。 方法： ①浓度依赖性分组：对照组、UA 200 μmol/L（UA2）组、UA 400 μmol/L（UA4）组、UA 600 μmol/L（UA6）组与ECV304细胞共同孵育24 h。②时间依赖性：UA6组分别观察1、3、5、7 d。检测培养液NO2-/NO3-浓度、NOS活性、非对称二甲基精氨酸（ADMA）浓度、二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）活性以及SOD活性和Ang Ⅱ浓度，细胞裂解液DDAH表达。 结果： ① 3种浓度UA组NO2-/NO3-明显高于对照组，NOS、DDAH、SOD活性则在UA4、UA6两组明显高于对照组，而ADMA浓度在UA4、UA6两组降低，Ang Ⅱ浓度和DDAH表达则无显著差异。② UA6组各时段NO2-/NO3-浓度和NOS、DDAH、SOD活性均高于相应对照组，而ADMA浓度低于对照组；Ang Ⅱ浓度、DDAH表达则无明显差异。除NOS活性在第7 d明显下降外，其余指标在不同时段组没有明显的差异。 结论： ① 短期UA刺激使ECV304细胞分泌NO2-/NO3-增多，且呈浓度依赖，无时间依赖。② UA通过增加DDAH活性、加速ADMA的降解,使NOS活性增加而致NO2-/NO3-生成增多。③尿酸使SOD活性增加而不增加AngⅡ浓度。     

接触抑制下调CD112和CD155在ECV304细胞上的表达伴有对NK细胞杀伤的抵抗

目的：研究细胞培养接触抑制条件下，ECV304细胞表面CD112和CD155表达的变化及其对NK细胞杀伤敏感性的变化。方法：以ECV304细胞接触抑制为模型，应用免疫荧光染色和流式细胞术分析，观察CD112和CD155分子在对数生长状态和发生接触抑制状态ECV304细胞上表达情况的变化；采用51Cr-4h释放试验，观察NK细胞对2种状态ECV304细胞杀伤活性的改变。结果：CD112和CD155分子在ECV304细胞发生接触抑制时表达水平明显低于对数生长期细胞。NK细胞对发生接触抑制的ECV304细胞的杀伤率比对数生长期的细胞有所下降。结论：接触抑制会使ECV304细胞对NK细胞杀伤有一定抵抗，同时伴有CD112和CD155分子表达的下调，两者间是否存在因果关系值得进一步深入探讨。     

活性氧对ECV304细胞生长和凋亡的相关基因表达谱研究

目的： 探讨活性氧（ROS）对ECV304细胞生长和凋亡作用的相关基因表达谱。 方法： 采用MTT法分别观察不同浓度AngⅡ在4 h、12 h和24 h时对ECV304细胞生长率和ROS生成量的影响。应用基因芯片技术和光镜分别检测0.0625和1 μmol/L AngⅡ作用12 h时ECV304细胞生长作用的相关基因表达谱和细胞形态学变化。 结果： 一定浓度的AngⅡ作用12 h时ECV304细胞生长率明显增加（P<0.05）；基因芯片技术分析显示，在0.0625 μmol/L AngⅡ作用ECV304细胞12 h时，与细胞生长相关的ERK、CDK、CCN、PCNA等25个基因普遍上调，而与细胞凋亡相关的DR6、caspase-6、BAK1、PDCD8等12个基因普遍下调，在1 μmol/L AngⅡ作用12 h时，呈相反结果。 结论： AngⅡ是ECV304细胞产生ROS(·OH)的诱导剂，可引起多种与ECV304细胞生长和凋亡的靶基因表达；N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）可以明显抑制AngⅡ对ECV304细胞的生长作用；ROS(·OH)可能是AngⅡ诱导ECV304细胞生长和凋亡的主要信号转导分子和基因表达调节分子。     

血小板对ECV304细胞PTA1表达和PDGF释放的影响

目的:探讨血小板对妊高征患者血清刺激下的ECV304细胞(ECV304)表达人血小板/T细胞活化抗原1(PTA1)和释放血小板衍生生长因子(PDGF)的影响。方法①用间接免疫荧光染色结合流式细胞仪分析观察血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PTA1的表达②用ELISA方法检测血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育前后PDGF的量。结果:①血小板与妊高征患者血清刺激(24h、48h)的ECV304细胞孵育后PTA1表达的百分率(6.32%、4.13%)明显低于对照组(15.51%、5.64%)(P<0.05)。②妊高征患者血清刺激ECV304细胞8h、24h、48h释放PDGF的量(1593、2625、2175ng/L)明显高于正常孕妇组(235、405、133.5ng/L)差异显著(P<0.01)。③血小板与妊高征患者血清刺激的ECV304细胞孵育后,24h、48h细胞培养上清液中PDGF-B的量又进一步增加(3266、2360ng/L),与对照组比差异显著(P<0.05)。结论:ECV304细胞与血小板之间的黏附可能是通过PTA1分子发挥作用的,同时导致了PDGF的进一步释放。     

杭白菊总黄酮对ECV304细胞内钙信号的影响

目的 :杭白菊是我国传统的栽培药用植物。药物分析表明 ,杭白菊内含黄酮类、菊甙及多种维生素和微量元素。我们的前期研究表明 ,杭白菊总黄酮 (FDM)可以增加大鼠心脏的收缩力和冠脉流量 ,并且能对抗由缺血 /复灌引起的心脏收缩力下降和冠脉流量的下降。血管环实验证明FDM具有舒张大鼠胸主动脉环的作用 ,但是尚无直接证据表明FDM可直接影响细胞内钙水平。本实验观察了FDM对人脐静脉内皮细胞株ECV30 4细胞内钙的影响。方法 :将人脐静脉内皮细胞株ECV30 4细胞接种于含有 1mLDMEM培养基的培养板内的盖玻片上。用Fura - 2 /AM(1μmol/…     

血清硫酸脱氢表雄酮RIA在产科临床的应用

本文测定了临产妇女血清硫酸脱氢表雄酮 (ＤＨＥＡＳ)水平的变化 ,以探讨母体内源性血清ＤＨＥＡＳ含量与产程的关系 ,现将结果报告如下。资料和方法一、临床资料 :(一 )产程≤ 13小时组 :选自本院自然临产的初产妇 37例 ,年龄 2 2～ 2 9岁 ,孕周 38～ 42周 ,无任何合并症及头盆不称 ,无皮质醇用药史。(二 )产程 >13小时组 :自然临产的初产妇 31例 ,年龄 2 1～ 30岁 ,孕周 38～ 42周 ,无任何合并症及头盆不称 ,无皮质醇用药史。二、方法 :初产妇自然临产后 ,在宫口开大 2ｃｍ左右时取静脉血 2ｍｌ,分离血清 ,- 2 0℃保存待测。ＤＨＥＡＳ试…     

碱性成纤维细胞成长因子对ECV304细胞迁移的影响

目的：观察不同浓度的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外培养中划痕损伤后ECV304细胞迁移的影响。方法： 在体外细胞划痕损伤模型中应用显微电视电脑图像处理系统定量测定不同浓度(0、5、10、15 μg/L)bFGF引起的ECV304细胞迁移的变化，用光镜与扫描电镜观察bFGF引起的迁移细胞的形态变化。结果： 与不加bFGF的对照组比较，低浓度(5 μg/L)时bFGF对ECV304细胞的迁移呈促进作用；高浓度时(15 μg/L)呈抑制作用。迁移细胞表面有众多丝状伪足。结论： bFGF对体外培养的ECV304细胞的迁移有双相调节作用，低浓度时(5 μg/L)促进细胞迁移，高浓度时(15 μg/L)抑制细胞迁移。迁移细胞表面伪足丰富，以丝状伪足为主。     

人体内皮细胞系细胞株ECV304细胞低氧模型的制备

目的 研究人体内皮细胞系细胞株(ECV304)细胞低氧模型的建立条件及其形态学特点.方法 培养ECV304细胞,将培养箱内通入5%CO:-95%N2混合气体(氧分压为18.3 mmHg)并培养ECV304细胞12h、24h,使用MTT法、酸脱氢酶试剂盒(LDH)活力测定及细胞骨架染色对低氧细胞模型鉴定.结果 与正常对照...     

抑制ECV304细胞内EOLA1基因表达后效应观察

目的观察抑制人脐静脉内皮细胞系ECV304细胞内内皮高表达脂多糖相关因子1（endothe-lial-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor 1,EOLA1）基因表达后细胞生长的变化。方法构建EGFP-EOLA1融合蛋白表达载体pEGFP-N2/EOLA1,转染ECV304细胞,G418压力筛选获得稳定表达株;设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ和HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上。转染重组质粒到稳定表达EGFP-EOLA1融合蛋白的ECV304细胞,检测靶基因的抑制情况,观察EOLA1表达被抑制后细胞生长的改变。结果抑制EOLA1表达后ECV304细胞生长明显减慢。结论EOLA1基因在细胞内参与了细胞生长的调控。     

nanoLC-ESI/MS/MS在ECV304细胞蛋白质组学研究中的应用

目的：应用纳升液联用技术(nanoLC-ESI/MS/MS)对ECV304细胞蛋白质组学进行初步分析。方法：提取ECV304细胞总蛋白,经变性、还原、烷基化和酶解,nanoLC-ESI/MS/MS对酶解后的肽段进行分析,数据库（Swissprot）检索鉴定蛋白质,生物信息学工具对所鉴定的蛋白质进行细胞定位和功能分类。结果：从8 μg细胞总蛋白中鉴定了120种蛋白质,所鉴定蛋白质的分子质量（MW）范围从6 648 D至280 739 D, MW<20 kD的蛋白质占24.2%,MW>100 kD的蛋白质占5.0%;主要位于细胞质、细胞骨架、细胞核和细胞膜,分别为27.8%、19.0%、15.2%和10.1%;大多为结构蛋白质和催化活性的蛋白质,分别为36.4%和34.1%,具有信号转导活性的占11.4%;其中角蛋白8、18和vimentin等为内皮细胞特异表达的蛋白质。结论：本研究建立了nanoLC-ESI/MS/MS分析ECV304细胞的蛋白质组学方法,为内皮细胞及内皮细胞损伤机制的蛋白质组学研究奠定了实验基础。     

血管内皮细胞(ECV304)表达的HLA-G1对NK细胞杀伤活性的抑制作用

目的:证实HLA-G1分子能够抑制NK细胞对同种血管内皮细胞系的杀伤作用。方法:采用脂质体介导的DNA转染技术,以构建的真核表达质粒pcDNA3-HLA-G1转染人脐静脉内皮细胞系ECV304,再用免疫荧光法检测表达的HLA-G1分子。并用MTT比色法检测HLA-G1对NK细胞杀伤活性的影响。结果:ECV304细胞上可稳定表达HLA-G1。NK细胞对空质粒pcDNA3转染的ECV304细胞的杀伤率为(50.6±18.1)%;而对pcDNA3-HLA-G1转染的ECV304细胞的杀伤率为(29.7±11.4)%,两者差异具有显著意义(P<0.01)。结论:HLA-G1分子可明显抑制NK细胞对同种血管内皮细胞的杀伤效应。     

基于水凝胶的内皮细胞三维培养

目的研究可注射温度敏感性水凝胶的生物相容性,探讨其做为三维培养材料的可行性。方法将人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞接种于水凝胶,体外共同培养后进行形态结构观察,用MTT法检测ECV304细胞增殖活性,AO／EB试剂盒观察细胞凋亡,NO试剂盒测量细胞分泌NO等功能。结果ECV304细胞在水凝胶中生长及功能均比较理想。AO／EB双重染色有少量黄色荧光,显示仅有少量细胞凋亡。细胞在水凝胶中培养后上清液体中分泌的NO浓度与二维培养组之间差异显著性无统计学意义（P=0．948）。结论可注射温度敏感性水凝胶生物相容性好,是一种良好的三维培养材料,可作为种子细胞的载体应用于组织工程中。     

弱氧化修饰低密度脂蛋白诱导ECV304组织因子基因表达及银杏内酯B的抑制作用

为研究弱氧化修饰低密度脂蛋白（mmLDL)对ECV304组织因子（TF）蛋白含量和mRNA水平的影响、对胞浆游离钙离子[Ca^2 ]i的影响，以及银杏内酯B等的干预作用。采用ELISA法检测细胞内TF蛋白含量，用RT－PCR法检测细胞内TF mRNA水平，用激光共聚焦显微镜观察[Ca^2 ]i的变化。结果显示，40mg/L mmLDL作用ECV304 4h，能使TF蛋白含量及mRNA水平显著增加，并迅速升高[Ca^2 ]i。抗氧化剂银杏内酯B及PKC抑制剂Staurosporine可拮抗mmLDL的上述诱导反应。以上结果提示，mmLDL可诱导ECV304 TF表达，Ca^2 与PKC参与mmLDL诱导ECV304 TF基因表达过程，并且银杏内酯B可抑制mmLDL的此种效应。