肝再生增强因子重组质粒在大鼠肝组织中的表达

肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是一种具有热稳定性的肝细胞增殖刺激因子,无论内源性还是外源性的ALR都对肝细胞增殖有促进作用[1].     

肝细胞移植联合肝再生增强因子治疗大鼠急性肝功能衰竭的研究

目的 探讨同种异体肝细胞腹腔移植联合肝再生增强因子(augmenter of liver regenration, ALR)对D-氨基半乳糖(D-gal)诱导的急性肝功能衰竭大鼠的治疗作用.方法 采用D-gal诱导大鼠急性肝功能衰竭,诱导后24 h,59只大鼠随机数字表法分成4组.Ⅰ组15只:腹腔注射生理盐水;Ⅱ组15只:经腹腔移植2×107肝细胞, 以后腹腔注射生理盐水;Ⅲ组15只:经腹腔移植2×107肝细胞,同时腹腔注射ALR 50 μg·kg-1·d-1;Ⅳ组14只:腹腔注射ALR50 μg·kg-1·d-1.观察大鼠的存活率、肝脏功能、移植肝细胞存活情况、病理变化.结果 Ⅱ组、Ⅲ组大鼠存活率(46.7%、66.7%)显著高于Ⅰ组(0.0%)(P=0.006;P=0.0002),Ⅲ组(66.7%)与Ⅳ组(14.3%)有显著差异(P=0.008),其他组间无明显差异(P＞0.05).移植后第1、2天Ⅱ组腹水AST高于Ⅲ组(P=0.001), Ⅱ组第1、2天腹水ALT高于Ⅳ组,Ⅱ组、Ⅲ组第1、2天腹水TBil高于Ⅰ组(P＜0.05).Ⅲ组肝脏病理改变轻于其他组.Ⅲ组大鼠腹腔移植的肝细胞存活数多于Ⅱ组.结论 同种异体肝细胞经腹腔移植联合ALR可明显改善D-gal诱导的肝衰竭大鼠的存活率,促进移植肝细胞存活和增殖,促进肝组织及功能恢复.     

肝再生增强因子研究进展

本文对有关肝再生增强因子的研究进行综述,为今后进一步将肝再生增强因子研制成为一种治疗肝病有效的靶点药物提供理论依据.     

肝再生增强因子的研究进展

肝再生增强因子是近年来发现的一种能够通过免疫调控、信号转导及影响线粒体功能等方式特异性刺激肝细胞增殖、促进肝脏再生的细胞因子,且其基因家族成员广泛存在于从低级到高级的真核细胞中。最近研究发现,其具有保护肝细胞、减轻毒物引起的肝脏损伤的作用。其机制可能与保护线粒体、抑制线粒体膜通透性转换孔开放有关。目前对其生物学性状、功能以及相关作用机制都有较深入的认识。     

大鼠肝再生增强因子的基因克隆

目的 克隆大鼠肝再生增强因子基因编码序列,并在原核细胞表达。方法 按文献报道大鼠肝再生增强因子核苷酸序列合成引物,从2周龄大鼠肝组织提取RNA,利用RT－PCR扩增大鼠肝再生增强因子基因编码区;将PCR扩增片段亚克隆到pBV221质粒,构建原核表达重组载体,导入到大肠杆菌后热诱导表达目的蛋白。结果 从大鼠肝脏的RNA中扩增到长约400bp的肝再生增强因子cDNA编码区基因,序列分析表明与文献报道一致;重组克隆经热诱导表达出分子量约15kD大小的蛋白质,与预期值一致。结论 从2周龄大鼠肝组织中成功克隆肝再生增强因子基因,并获得了原核细胞高效表达。     

重组人肝再生增强因子对大鼠实验性肝纤维化的保护作用

初步研究表明，从哺乳动物幼仔肝、胚胎肝组织提取的肝细胞生长因子（ＨＧＦ）、肝刺激物（ＨＳＳ）有抗慢性肝损伤的作用。我们以四氯化碳（ＣＣｌ４）中毒性大鼠肝纤维化为模型，研究了重组人肝再生增强因子（ｈＡＬＲ）的抗慢性肝损伤作用，结果表明，重组ｈＡＬＲ有明...     

人肝再生增强因子融合蛋白表达载体的构建

目的 :克隆人肝再生增强因子的cDNA并构建谷胱甘肽巯基转移酶 -人肝再生增强因子 (GST -hALR)融合蛋白表达载体。方法 :根据人肝再生增强因子核苷酸序列 ,从人胎肝cDNA文库中扩增到hALRcDNA ,亚克隆于pUC18载体 ,核苷酸序列测定证实为hALR ;将hALRcDNA亚克隆于 pGEX - 4T质粒 ,转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性克隆酶切鉴定。结果 :重组阳性克隆经酶切鉴定证实重组片段已正确插入相应酶切位点 ,片段与PCR扩增片段大小相同 ,碱基序列正确。结论 :GST -hALR融合蛋白表达载体的成功构建 ,为获得较大量基因工程hALR产品用于重症肝炎治疗打下基础     

大鼠肝再生增强因子编码区的cDNA克隆和原核表达

目的：克隆大鼠肝再生增强因子（ＡＬＲ）编码区ｃＤＮＡ并进行原核表达。方法：提取新生大鼠肝脏总ＲＮＡ为模板，以寡聚ｄＴ为引物逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，再以我们设计的ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增获取大鼠肝再生增强因子编码区双链ｃＤＮＡ；以基因重组技术构建大鼠ＡＬＲ的原核表达质粒，然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌内以ＩＰＴＧ诱导表达。结果：成功克隆出大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ，其序列与以前报道的完全一致；构建的大鼠ＡＬＲ原核表达重组质粒在大肠杆菌内高效表达ｒＡＬＲ融合蛋白，其表达量占菌体蛋白３０％。结论：大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ的克隆及其在大肠杆菌的高效表达为ＡＬＲ的深入研究奠定了基础。     

肝再生增强因子在缺血再灌注肾损伤中的表达及其对p38信号通路的影响

目的:观察缺氧及缺氧复氧状态下大鼠肾小管上皮细胞中肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration,ALR)的表达变化,以及对细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kincses,MAPK)信号通路的影响,探讨ALR对肾脏保护的作用机理.方法:将...     

重组人肝再生增强因子对肝纤维化大鼠金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达的影响

目的　了解重组人肝再生增强因子 (hALR)对实验性肝纤维化大鼠肝组织金属蛋白酶组织抑制因子 1(TIMP1)基因表达的影响。方法　我们建立了四氯化碳中毒性及人血白蛋白免疫损伤性两种大鼠肝纤维化模型 ,在造模的同时给予不同剂量的hALR。在不同的时间点留取大鼠肝组织标本 ,提取总RNA ,用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)测定TIMP1的基因表达水平。结果　在两种模型中大鼠肝组织TIMP1的基因表达水平在模型形成过程中逐渐升高 ;低剂量hALR组大鼠肝组织TIMP1的基因表达水平与模型组及阴性对照组差异无显著意义 ;高剂量hALR组大鼠肝组织TIMP1的基因表达水平 (四氯化碳模型第 2、4、6、8周分别为 0 6 3± 0 10、1 18± 0 2 0、1 89± 0 30、2 6 3± 0 33;人血白蛋白模型尾静脉攻击中、攻击后分别为 2 33± 0 36、4 0 2± 0 5 3)均明显低于模型组 (四氯化碳模型第 2、4、6、8周分别为 0 99± 0 14、2 0 3± 0 30、2 99± 0 4 3、4 13± 0 4 4 ;人血白蛋白模型尾静脉攻击中、攻击后分别为 4 13± 0 6 0、5 99± 0 83)及阴性对照组。结论　大剂量hALR可能有抑制实验性肝纤维化大鼠肝组织TIMP1基因表达的作用     

人肝再生增强因子DNA免疫的实验研究

目的:构建人肝再生增强因子()真核表达质粒,免疫家兔,获得抗多抗血清。hALRhALR方法:将已构建的人肝再生增强因子()重组质粒,经扩增,亚克隆入真核表达质粒,构建重hALR PET11-hALRPCR pcDNA3.1 pcDNA3.1-hALR组质粒。中量制备重组质粒及对照质粒,以只免疫家兔,取血并分离血清,进行蛋白质pcDNA3.1-hALR pcDNA3.11.08mg/印迹分析。Western blot结果:构建了真核表达质粒,此重组质粒诱发了家兔抗抗体的产生。pcDNA3.1-hALRhALR结论:说明构建的重组质粒在体内有表达能力,为进一步研究的生物学活性及某些疾病的治疗奠定了基础。 hALR     

庆大霉素致急性肾功能衰竭的临床分析

庆大霉素具有潜在的肾毒，对己有脱水或老年患者，即使正常剂量，短疗程，甚至小剂量也可致肾衰。因此，庆大霉素对老年人或婴幼儿是危险的。应用时要遵循几个原则，忌与其它肾毒药联合应用，疗程要短，剂量不能过大，避免脱水和血量不足。     

ALR基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中对ALR表达的抑制

目的：构建肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒载体,并检测其对人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因表达的干扰效率。方法：针对ALR基因RNAi的有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切线性化的GV118慢病毒载体连接产生LV-ALR-shRNA重组慢病毒载体,经转化感受态细胞后筛选出阳性克隆,并进行测序鉴定。用293T细胞包装产生慢病毒,逐孔稀释法测定病毒滴度。再将包装浓缩后的慢病毒转染人肝癌细胞株HepG2和QGY,应用Real-time PCR和Western blot方法检测HepG2和QGY细胞中ALR基因mRNA和蛋白的表达情况。结果：酶切鉴定证实成功构建了针对人ALR基因的RNAi慢病毒载体,包装并浓缩慢病毒,病毒滴度为 8E+8TU/ml。将病毒感染人肝癌细胞株HepG2和QGY后,2种细胞的干扰组ALR的mRNA表达水平较阴性对照组及空白对照组均明显下降（HepG2细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.004,P干扰组vs. 空白对照组=0.001;QGY细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.005,P干扰组vs. 空白对照组=0.001）,同样,干扰组ALR在蛋白水平的表达也明显减降低。结论：成功构建ALR基因RNAi慢病毒载体,该载体能有效干扰人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因的表达。     

人肝再生增强因子基因序列的优化、重组表达及功能研究

目的:体外重组表达人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)并进行功能研究.方法:全基因合成ALR序列并插入原核表达载体pET28a ,转化入BL21菌内进行诱导表达,表达产物经过纯化后利用MTT法观察表达产物对人肝细胞的刺激增殖活性;利用小鼠急性四氯化碳损伤模型观察表达产物的肝功能保护作用.结果:酶切鉴定及测序结果提示表达产物正确;纯化后表达产物具有明确的促进肝细胞增殖作用,并在中、低剂量具有降低小鼠急性化学性损伤后转氨酶水平的作用.结论:重组表达的ALR结构正确,具有促进肝细胞再生的作用.     

脐血干细胞移植与肝再生增强因子联合治疗急性肝衰竭的实验研究

目的：观察脐血干细胞移植与肝再生增强因子联合治疗急性肝衰竭大鼠的疗效,以期为肝脏组织工程修复提供依据。方法建立肝衰竭大鼠模型40只,按照随机数表法将大鼠随机分为对照组(采用腹腔注射生理盐水)、脐血干细胞移植组(移植组,采用腹腔移植2×107脐血干细胞)、脐血干细胞移植联合肝再生增强因子组(联合组,采用腹腔移植2×107脐血干细胞联合注射肝再生增强因子50μg·kg-1·d-1)和肝再生增强因子组(增强因子组,采用腹腔注射肝再生增强因子50μg·kg-1·d-1),每组各10只。用DAPI标记肝细胞。大鼠肝衰竭造模成功后,经治疗一个月后分别取四组大鼠的肝组织制作冰冻切片,并于荧光显微镜下观察肝组织中DAPI标记的细胞计数。结果移植组肝脏归巢及定植的干细胞为(12.6±2.0)个细胞/100倍视野,多于增强因子组的(8.1±3.4)个细胞/100倍视野,差异有统计学意义(P<0.05),增强因子组到肝脏归巢及定植的干细胞又多于对照组的(3.1±3.4)个细胞/100倍视野,差异有统计学意义(P<0.05),而联合组肝脏归巢及定植的干细胞为(18.1±3.4)个细胞/100倍视野,多于以上各组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论不同干预手段对脐血干细胞归巢、定植于肝脏有一定影响,联合组的干细胞归巢率优于单行移植组和增强因子组。因此脐血干细胞移植联合肝再生增强因子是一种较为理想的急性肝衰竭治疗手段。     

抗人肝再生增强因子单克隆抗体对人肝癌细胞株HepG2增殖活性的影响

目的:检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达,利用hALR特异性的单克隆抗体(anti-hALR McAb)结合hALR,观察其阻断hALR的作用后,对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖活性的影响.方法:用免疫细胞化学以及RT-PCR的方法检测HepG2细胞hALR蛋白及mRNA的表达;用3H-TdR掺入法检测hALR特异性单克隆抗体中和hALR后HepG2细胞的增殖情况.结果:①HepG2细胞有hALR的表达.②抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后可部分抑制肿瘤细胞自主性生长.结论:抗hALR单克隆抗体能部分抑制肿瘤细胞自主性生长;hALR通过自分泌方式参与了肝癌细胞的自主性生长.     

IL-18和caspase-1在大鼠急性肝衰竭模型中表达及其意义

目的 了解IL-18与caspase1在大鼠急性肝功能衰竭的可能作用和机制.方法 模型组(n=50)D-氨基半乳糖(D-GalN)/脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肝衰竭模型.对照组(n=10)以生理盐水代替药物.于不同时间点对大鼠血清和肝脏组织进行HE和TUNEL染色观察,并对血清ALT、AST和TBIL,IL-18 ...