乙型肝炎病毒表面抗原突变体稳定表达细胞系的建立和抗原性鉴定

目的 探讨乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)阴性HBV感染的分子机制。方法 在对46例HBsAg阴性但血清HBVDNA阳性感染者的S基因序列进行分析的基础上，构建了6株新的HBsAg变异株(4株联合点突变株，2株插入变异株)的EBO-plpp真核表达载体，并转染了COS7细胞，建立了这6株HBsAg变异株的稳定表达细胞系。分别用酶联免疫法(ELISA)和放射免疫法(RIA)对细胞表达的HBsAg抗原性进行检测。结果 除1例插入变异株可检测到较弱的阳性外，其余5株均检测不到HBsAg的存在。结论 新发现的HBsAg联合点突变和氨基酸插入变异，均对HBsAg的抗原性有负面的影响，是造成HBsAg阴性HBV感染的直接原因。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因点突变对HBsAg抗原性的影响

目的 研究乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)常见基因点突变对HBsAg抗原性的影响,了解我国目前常用的HBsAg检测试剂对HBV S基因突变株的检测灵敏性,减少漏检,有效控制乙肝病毒(HBV)感染的传播.方法 构建HBsAg重组野毒株和重组变异株表达质粒,分别将重组野毒株HBsAg表达质粒pSS1adw2及pSS1adr和重组变异株HBsAg表达质粒pSS1adw2-145Arg、pSS1adr-126 Ser和pSS1adr-126 Asn转染COS-7细胞,进行瞬时转染.采用市售HBsAg ELISA检测试剂盒对细胞上清进行抗原性检测.结果 野毒株HBsAg和两种126位变异株HBsAg具有较好的抗原性;145位点突变后、导致HBsAg的抗原性下降.结论 推测是由于145位点变异影响了"a"抗原决定簇的空间结构,从而降低了其与抗-HBs的结合能力.     

用反向被动血凝抑制试验进行乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的位阻分析

本文报告获得28株分泌抗HBsAg单克隆抗体的杂交瘤细胞系,均为抗HBsAg“a”决定簇抗体。产生鼠IgM抗体的有一个细胞系;IgG1 18个系;IgG 2a 1个系;IgG 2b 6个系;IgG 3两个系。采用反向被动血凝抑制法测定了其中24种McAb的交互抑制现象。24种McAb可分为10个不同的抑制群。并对这种简单易行的位阻分析方法在实用中的价值做了讨论。     

乙型肝炎病毒新的免疫逃避株的S基因序列分析

目的分析乙型肝炎患者体内ＨＢＶＳ基因的变异情况及对乙型肝炎的免疫预防的现实意义。方法采用巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）、Ｍ１３噬菌体克隆和核苷酸序列分析方法对一例乙型肝炎免疫失败儿童患者体内ＨＢＶＳ基因序列进行分析。结果发现该患儿所感染ＨＢＶ的Ｓ基因上有一个重要的点突变,即第５５１位碱基由野生型的Ａ变为Ｇ。该突变使乙型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）１３３位氨基酸由甲硫（ＡＴＧ）变为缬（ＧＴＧ）。这一氨基酸替换恰恰发生在ＨＢｓＡｇ中和性α抗原决定簇区段（ａａ１２４～ａａ１４７）内。结论鉴于该患者接种乙型肝炎疫苗,其血清呈抗－ＨＢｓ阳性和ＨＢｓＡｇ阴性,推测其体内的ＨＢＶ为一个新的疫苗诱导的免疫逃避株     

重组HBsAg免疫逃逸突变体的表达及其抗原性分析

为了深入研究乙型肝炎病毒S基因变异所致的包膜抗原抗原性的改变，从含ＨＢＶＤＮＡ双拷贝的质粒载体ｐＥｃｏｂ６，获得一个８３７ｂｐ的ＨＢＶ－Ｓ基因片段，将其插入至载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ~＋的ＳｍａⅠ位点，通过体外寡核苷酸介导的人工定点突变分别获得第１４５位、１２６位和第１４５位＋１２６位氨基酸三种Ｓ基因变异型。然后将这些Ｓ基因变异片段克隆到真核表达载体ｐＭＥｐ４上，从而构建了含ＨＢＶ－Ｓ基因及其突变型的表达载体ＰＭＥｐ４ＨＢＶＳＭ。用其转染人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２，获得稳定分泌ＨＢｓＡｇ及其变异体的抗性细胞系。经体外初步研究表明，ＨＢｓＡｇ １４５位氨基酸变异体可影响ＨＢｓＡｇ的“ａ”抗原决定簇的结构。     

乙型肝炎病毒表面抗原定量检测及临床意义分析

乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）定量检测是临床治疗乙型肝炎的一个非常重要的指标,它不仅能区分乙型肝炎病程的各种分期,而且对药物治疗效果及预后有良好的预测作用.本文从乙型肝炎病毒表面抗原的结构、定量检测的方法学以及在临床中的应用等方面做一综述分析.     

乙型肝炎病毒表面抗原定量检测临床意义的探讨

为探讨乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）定量检测作为反映乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）复制情况的临床意义,本文对２００例ＨＢｓＡｇ阳性标本分别做ＨＢｓＡｇ定量检测和ＨＮＢ－ＤＮＡ检测,血清学标志物检测,并对１０例患者地行随访检测以上项目。根据测得的ＨＢｓＡｇ含量将２００例标本分为五组,计算出各组ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率,发现随ＨＢｓＡｇ含量增高,ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率也显著增高（Ｐ〈０．０１）。根据ＨＢＶｅ系统不同模式分组显示,随ＨＢＶ感染好转,ＨＢｓＡｇ含量也随之降低（Ｐ〈０．０５）。对６例ＨＢＶ－ＤＮＡ转阴患者ＨＢＶ－ＤＮＡ转阴前后的ＨＢｓＡｇ含量比较,发现随ＨＢＶ－ＤＮＡ转阴,ＨＢｓＡｇ量也显著降低（Ｐ〈０．０１）。综合以上结果,可以说明血清中ＨＢｓＡｇ含量,可以间接反映体内ＨＢＶ的情况,ＨＢｓＡｇ定量检测可作为间接反     

检测乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白的临床意义

目的检测乙肝患者血清中乙肝两对半（HBVM）、乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白（HBV—LP）以及HBVDNA，比较在不同乙肝两对半模式的患者中HBV．LP与HBVDNA的检出率，探讨乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白（HBV—LP）用于乙肝患者临床诊断的意义。方法采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测HBV．LP和乙肝两对半，采用荧光定量PCR方法对患者HBVDNA进行检测。结果（1）相同乙肝模式患者血清中HBV．LP与HBVDNA检出率差异无统计学意义；（2）143例小三阳乙肝患者血清中HBV．LP与HBVDNA阳性率差异无统计学意义，二者的检出一致率为82．52％[（65＋53）／143]；（3）HBV—LP吸光度（A值）与HBVDNA呈正相关关系（r=0．983）。结论乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白与HBVDNA有良好的正相关关系，在HBeAg阴性的乙肝患者中乙肝病毒表面抗原大蛋白（HBV—LP）与HBVDNA有较高检出一致率，HBV—LP用于临床反映乙肝病毒复制水平，特别是HBeAg阴性乙肝患者体内病毒复制情况有重要的意义。     

乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）地衣红染色法

本文介绍了特异性较强，方法比较简单，不需要特殊仪器，基层容易推广应用的地农红染色法。以显示肝组织切片中的乙型肝炎病毒的表面抗原，用以鉴别活检和尸检病例是否为乙型肝炎，效果较好。     

乙型肝炎病毒基因型研究进展

乙型肝炎是世界上危害极大的传染性疾病,有关乙型肝炎病毒基因型的研究近年来得到充足的发展,其对乙型肝炎的转归、对药物治疗的敏感性、预后等均有一定的影响.     

2001年中国新分离维多利亚系乙型流感病毒的抗原性及基因特性分析

目的：研究2001年中国新分离维多利亚（Victoria)系乙型流感病毒的抗原性及基因特性。方法：鸡胚传代流感病毒，从尿囊液中提取流感病毒的RNA，进行逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR），扩增产物用纯化试剂盒纯化后测序，然后用MegAlign软件进行基因种系发生树分析。结果：B／Sichuan/63/2001和B／Zhejiang/2/2001毒株的抗原性与B／Shandong/7/97毒株间存在有差异，编码血凝素重链区基因已发生了突变并导致了HA1蛋白抗原性表位两个位点（197和199）氨基酸不同于B／Shandong/7/97毒株，基因种系发生树分析同样也证明了它们的HA1基因不同于B／Shandong/7/97病毒。然而，B／Sichuan/63/2001与B／Zhejiang/2/2001毒株间无论抗原性还是HA1基因特性均很相似。结论：2001年我国人群中流行的乙型流感病毒维多利亚毒株系的抗原性已发生进一步的漂移。     

肾小球肾炎肾组织中HBV感染的标志

为了解肾组织中ＨＢＶＤＮＡ与ＨＢＶ抗原存在的关系，探讨肾组织中ＨＢＶ抗原的来源及其与病理变化的关系，我们检测２４６例肾炎肾组织中三种ＨＢＶ抗原。发现除肾小球沉积外，肾小管常有阳性表达。肾小管ＨＢｃＡｇ阳性率达２１．５４％，高于肾小球（１０．９８％）。有１８例肾组织经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交检测ＨＢＶＤＮＡ，１５例阳性者中１４例肾组织ＨＢＶ抗原同时阳性，１２例血清感染标志亦阳性。结果提示某些肾炎可能与肾组织感染ＨＢＶ相关，肾组织中出现的ＨＢＶ抗原抗体免疫复合物除来自血循环外，有肾源性──原位形成的可能。     

携带HSP70-HBsAg嵌合基因复制缺陷型重组腺病毒的制备

目的 构建表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和热休克蛋白70(HSPT0)嵌合基因的复制缺陷型重组腺病毒载体.方法扩增结核分枝杆菌HSP70基因片段,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBsAg上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共同电转化到大肠埃希菌BJ5183内进行同源重组,经卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定筛选出携带HBsAg-HSP70嵌合基因的重组腺病毒载体,用脂质体包裹Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒,转染到293细胞内进行重组腺病毒的包装.体外转染真核细胞,通过示踪基因绿色荧光蛋白表达的观察、RT-PCR和ELISA检测目的基因的表达.结果成功获得重组腺病毒质粒pAd-HBsAg-HSP70.重组质粒pAd-HBsAg-HSP70导入293细胞,经包装和二次扩大培养获得了具有感染能力的重组腺病毒颗粒Ad-HBsAg-HSP70,其病毒滴度达2×1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论成功构建表达HBsAg-HSP70复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.     

Hepatitis B Viral Surface Mutations in Patients with Adefovir Resistant Chronic Hepatitis B with A181T/V Polymerase Mutations

The hepatitis B virus (HBV) polymerase gene has overlapping reading frames with surface genes, which allows to alter the amino acid codon of the surface genes. In adefovir (ADV) treated chronic hepatitis B patients carrying rtA181T/rtA181V mutations, overlap with surface gene mutations such as sW172stop/sL173F has been reported. However, the clinical consequences of such surface mutations have not been determined. The aim of this study was to determine the surface gene sequence in ADV-resistant patients carrying the A181T/V mutation and to describe the clinical significance. Of the 22 patients included in this study, 13 were ADV-resistant with rtA181T/V mutations (polymerase mutation group, Group P) and nine were antiviral treatment-naïve (control group, Group C). The Pre-S1 gene mutation, V60A, was detected in 11 patients (Group P=8, Group C=3). A start codon mutation in the Pre-S2 gene was found in five patients (Group P=3, Group C=2). An S gene mutation, sA184V, was found in nine patients, all of whom were in group P. Although sW172stop and sL173F mutations were detected, reduced HBsAg titer was not observed. Further study of these mutations and their clinical implications are needed.     

慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV抗原表达特征及其临床意义

目的探讨慢性乙型病毒性肝炎肝活检组织中检测乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝核心抗原(HBcAg)表达强度及表达方式的必要性。方法采用EnVision免疫组织化学法检测196例慢性乙型肝炎患者肝穿组织中HBsAg和HBcAg的表达水平,并用荧光定量PCR检测其血清中的HBV DNA的含量。对肝组织进行炎症活动度分级和纤维化分期。结果肝组织中的HBsAg表达强度和表达方式与炎症分级、纤维化分期和血清乙肝病毒载量均无相关性(P>0.05)。HBcAg表达强度与炎症分级无相关性(r=-0.02,P>0.05);与纤维化分期呈负相关(r=-0.28,P<0.01);与血清乙肝病毒载量呈正相关(r=0.53,P<0.01)。HBcAg表达方式与炎症分级为负相关(r=-0.27,P<0.01),其中浆型组炎症活动度分级高于核型组和混合型组(P<0.01),混合型组高于核型组(P<0.01)。HBcAg表达方式与纤维化分期亦呈较弱的负相关(r=-0.23,P<0.01),其中浆型组纤维化分期高于核型组和混合型组(P<0.05)。HBcAg表达方式与血清乙肝病毒载量呈正相关(r=0.22,P<0.01)。结论区分肝组织中的HBsAg表达强度和表达方式无益于了解慢性乙型肝炎患者肝损害的程度,而检测肝组织中的HBcAg则有助于临床抗病毒治疗。     

乙型肝炎病毒表面大蛋白检测用于筛查隐匿性HBV感染

目的 用血清学方法检测乙型肝炎病毒表面大蛋白(HBLP)来筛查隐匿性HBV感染,探讨临床隐匿性HBV感染的血清学检测策略.方法 在日常工作中从临床榆测备份管随机收集2000份用国产ELISA试剂检测HBsAg阴性结果的血清标本,双份分装-20℃冻存,单份标本实施HBLP检测,HBLP阳性标本增加另外两种共三种国产ELISA试剂双份复查HBsAg;HBLP阳性标本再经美国超灵敏MONOLISA HBsAg ULTRA试剂双份检测HBsAg,并行双份DNA定量分析、结果取均值.结果 2000份HBsAg阴性标本共检出15例HBLP阳性:HBLP阳性标本用三种国产ELISA试剂双份复查HBsAg结果一致阴性;通过美国超灵敏MONOLISA HBsAS ULTRA试剂复查HBsAg结果全部阳性;前述15份标本HBV DNA定量分析结果显示均小于500拷贝/ml,其中400～500拷贝/ml 1例,300～400拷贝/ml 3例,200～300拷贝/ml 5例,100～200拷贝/ml 4例,小于100拷贝/ml 2例.结论 用国产常规ELISA试剂检测HBsAg普遍存在漏检,漏检标本HBLP结果可能阳性,检测HBLP有利于筛查出隐匿性H BV感染,为积极寻找临床隐匿性HBV感染的检测策略提供了血清学参考.     

汉逊酵母表达乙肝表面抗原的结构研究

目的解析汉逊酵母表达重组乙肝表面抗原（HBsAg）的空间结构,给出其颗粒大小、结构对称性方面的信息。方法整合adr亚型HBsAg的基因到汉逊酵母染色体上,建立重组汉逊酵母菌。经过发酵扩菌、诱导表达、精制纯化等步骤得到纯化的HBsAg。滴加5μl浓度为80μg／ml HBsAg溶液到亲水处理的纯碳膜铜网上,用2％醋酸铀染色,放置24h后,通过透射电镜得到汉逊酵母表达HBsAg颗粒的二维电镜图像。运用EMAN软件包完成图像选择、颗粒框取、颗粒全同性处理、初始模型构建和结构精修等HBsAg重构步骤,获得HBsAg颗粒的三维结构。结果汉逊酵母表达HBsAg颗粒大小服从高斯分布（P=0．45）,均值为（28．4±2．6）nm;汉逊酵母表达HBsAg是～中空的“鱼笼”状结构,蛋白亚基分布在球状结构的表面;蛋白的表面分布大小为1～2nm的孔状结构和围绕孔状结构的突起;不具备八面体对称性。结论汉逊酵母表达的HBsAg与血源性的HBsAg在大小和结构对称性方面都有显著差异。     

2006年中国流感病毒抗原性及基因特性研究

目的分析2006年中国季节性流感的流行状况，以及病毒的抗原性和基因变异情况。方法对来自流感监测网络的毒株进行单向血凝抑制试验，在此基础上选择不同时间、地点分离的毒株进行血凝素基因的序列测定，然后分析其基因特性。结果2006年我国同时流行A型（H1N1亚型、H3N2亚型）和B型流感病毒。H1N1亚型毒株和B型Victoria系流感病毒为优势毒株。对H1N1亚型毒株的HA1区序列比较发现，2006年分离的毒株与A，湖北洪山／53／2005（H1N1）比较，在192、193、196、198位发生氨基酸替换的毒株．这些位点位于抗原决定簇的B区。H3N2亚型毒株与A，云南，1145／2005（H3N2）比较，在142、144位发生氨基酸替换。我国流行的B型流感毒株无论是Victoria系和Yamagata系毒株的抗原性均没有发生变异，与2005--2006年我国的流行株B／shenzhen／155／2005、B／tianjin／144／2005类似。结论2006年中国流行的H1N1亚型和H3N2亚型流感病毒的抗原性及基因特性已经发生改变；B型流感病毒的抗原性和基因特性没有改变。     

丁型肝炎病毒内蒙古株的原核表达及抗原性分析

目的获得表达量高、抗原性强的基因工程重组抗原。检测不同地区的丁肝患者血清,初步验证其抗原性及在检测不同地区丁肝血清方面的差异。方法从内蒙古某丁肝患者血清中提取丁肝病毒,经RT-PCR与PCR,使用PET43a表达质粒及HDVL-Ag5′和3′端引入His标签获得丁型肝炎病毒L-Ag重组表达质粒,转化BL21(Rosetta)宿主菌,IPTG诱导表达。表达产物经饱和硫酸胺沉淀与亲和层析柱纯化后,采用EIA竞争法分析其抗原性。结果经与ABBOTT Murex anti-Delta(total)试剂盒同步检测15份阳性和10份阴性血清,一致率100%。结论EIA检测,证明具有良好的抗原性,基因工程表达的抗原蛋白在检测不同地区丁肝血清方面未见差异,故可用于丁肝的诊断及相关研究。     

甲型肝炎病毒P1B、P2A、P3AB和P3D蛋白在原核系统中的表达和抗原活性分析

目的研究甲型肝炎病毒P1B、P2A、P3AB和P3D在原核系统中的表达,并探讨这些蛋白的抗原活性和作为诊断抗原的应用价值。方法采用PCR方法,从克隆有HAV HM175株全长cDNA基因的克隆载体pHAV16H1上扩增出目的基因,以M47作为表达载体,构建N端带硫氧还蛋白的重组表达质粒。重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达。采用DEAE阴离子交换和镍离子柱螯和亲和层析纯化的方法对重组蛋白进行纯化。以Western Blot和间接ELISA的方法检测重组蛋白的抗原活性。结果四个重组质粒经测序证明构建正确无误,在大肠埃希菌中表达四个蛋白的相对分子质量也正确无误。Western Blot分析和间接ELISA方法证实四个蛋白中只有p2a有抗原活性。结论原核表达的P2a蛋白,具有较好的抗原活性,在间接ELISA方法中检测出了所有的24份阳性血清和24份阴性血清,非常有希望做成诊断抗原用于诊断急性甲肝患者和区分甲型肝炎自然感染与注射疫苗所产生的不同免疫。