周期性牵张应力对人退变髓核细胞增殖的影响

目的:观察周期性牵张应力对体外培养的人退变髓核细胞增殖的影响,为椎间盘退变的预防与治疗提供新的理论依据。方法:对体外培养的人退变髓核细胞利用甲苯胺蓝、番红O和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定,并将P3代细胞接种于弹性膜片上,待贴壁后移入ElectroForce 3200力学试验仪搭载的BioDynamic生物反应舱内对其施加0、5%、10%和15%的应变作用3h,受力完成后继续培养24h,用流式细胞仪测定细胞周期,计算S期百分数及增殖指数。结果:应力刺激后各组细胞贴壁及形态良好;应变作用3h后,0、5%、10%及15%应变组的S期百分数分别为1.86±1.22、2.07±0.09、7.56±1.40及7.55±3.25,增殖指数分别为3.47±2.52、7.88±2.45、16.05±1.51及14.7±0.61。5%应变组的增殖指数较0应变组明显增加(P<0.05);10%和15%应变组较0和5%应变组的S期百分数及增殖指数明显增加(P<0.05);10%和15%应变组间比较差异无显著性(P>0.05)。结论:在一定周期性应力范围内,髓核细胞的增殖能力增强。     

羧甲基壳聚糖对体外培养髓核细胞增殖及硝普钠诱导凋亡的影响

[目的]研究不同浓度羧甲基壳聚糖对体外培养椎间盘髓核细胞增殖及硝普钠诱导细胞凋亡的保护作用.[方法]体外培养大鼠椎间盘髓核细胞,Ⅱ型胶原免疫组化染色鉴定;分别加入不同浓度羧甲基壳聚糖培养24h,通过CCK-8细胞计数法检测髓核细胞的增殖情况;采用不同浓度硝普钠诱导髓核细胞凋亡,通过流式细胞仪检测早期凋亡细胞比例,并通过Hoechst 33342荧光染色检测髓核细胞凋亡核的形态学变化.[结果]CCK-8检测结果表明10～500μg/ml羧甲基壳聚糖作用髓核细胞24 h对髓核细胞增殖无明显作用(P＞0.05);流式细胞检测结果表明1～3mmol/L的硝普钠可诱导髓核细胞发生早期凋亡,加入50～200μg/ml羧甲基壳聚糖后硝普钠诱导的髓核细胞凋亡有不同程度的降低(P＜0.05).Hoechst 33342染色结果表明羧甲基壳聚糖可降低硝普钠诱导髓核细胞凋亡.[结论]一定浓度的羧甲基壳聚糖对髓核细胞增殖无明显影响,羧甲基壳聚糖对硝普钠诱导下髓核细胞凋亡有保护作用.     

Hepatocyte growth factor/c‐met promotes proliferation,suppresses apoptosis,and improves matrix metabolism in rabbit nucleus pulposus cells in vitro

The etiology of intervertebral disc (IVD) degeneration is closely related to apoptosis and extracellular matrix degradation in nucleus pulposus (NP) cells. These defects in NP cells are induced by excessive external stressors such as reactive oxygen species (ROS) and inflammatory cytokines. Recently, hepatocyte growth factor (HGF) has been shown to repair damage in various diseases through anti‐apoptotic and anti‐inflammatory activity. In this study, we investigated the effects of HGF on NP cell abnormality caused by ROS and inflammatory cytokines by using primary NP cells isolated from rabbit IVD. HGF significantly enhanced the proliferation of NP cells. Apoptosis of NP cells induced by H₂O₂ or TNF‐α was significantly inhibited by HGF. Induction of mRNA expression of the inflammation mediators cyclooxygenase‐2 and matrix metalloproteinase‐3 and ‐9 by TNF‐α was significantly suppressed by HGF treatment. Expression of c‐Met, a specific receptor for HGF, was confirmed in NP cells and was increased by TNF‐α, suggesting that inflammatory cytokines increase sensitivity to HGF. These findings demonstrate that activation of HGF/c‐Met signaling suppresses damage caused by ROS and inflammation in NP cells through multiple pathways. We further suggest the clinical potential of HGF for counteracting IVD degradation involved in NP cell abnormalities. © 2015 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 34:709–716, 2016.     

两种同源间充质干细胞在接触式共培养体系下对退变髓核细胞生物学影响的比较

【摘要】 目的：比较两种人间充质干细胞在接触式共培养体系下对退变髓核细胞生物学功能的影响。方法：取同一例腰椎间盘突出症患者的退变髓核组织、脂肪组织和骨髓组织,分别分离培养退变髓核细胞（NPCs）、脂肪间充质干细胞（ADSCs）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）。取3种细胞传代至第3代的细胞进行接触式共培养。共培养前,利用PKH26对第3代退变NPCs进行染色标记,然后按1∶1的细胞比例,将NPCs分别与ADSCs和BMSCs在普通6孔板内进行接触式共培养。实验分为3组,A组为单独培养的NPCs,为对照组;B组为与ADSCs共培养的NPCs;C组为与BMSCs共培养的NPCs。共培养第7天时,利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养的细胞进行分选,获取各组NPCs。然后提取各组NPCs的总RNA,进行反转录后,再利用Real-Time PCR技术检测各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量。将Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因的相对表达量按分组进行组间t检验,P＜0.05为有统计学差异。结果：从退变髓核组织、骨髓组织和脂肪组织中,均成功分离培养出NPCs、BMSCs和ADSCs。待各细胞传至第3代时,成功利用PKH26对NPCs进行染色标记。按实验分组将各细胞进行接触式共培养后第7天,成功利用MoFlo高速流式细胞分选仪将共培养细胞进行分选,获取各组NPCs。经提取各组NPCs的总RNA,反转录并进行Real-time PCR后,获取各组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量,A组分别为1.03±0.04,1.05±0.07,1.04±0.17;B组分别为5.26±0.24,7.71±0.21,3.84±0.25;C组分别为9.33±0.39,11.07±0.34,5.64±0.26;B、C组NPCs的Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX-9基因相对表达量与A组比较显著性增加（P<0.05）;C组与B组比较,各指标基因相对表达量显著性增加（P<0.05）。结论：在接触式共培养条件下,BMSCs和ADSCs对退变NPCs均具有营养激活效应;BMSCs对退变NPCs的激活效应比ADSCs更好,对于椎间盘退行性疾病的生物学治疗可能更具优势。     

人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养的形态学及活性观察

[目的]观察平面培养体系内人退变椎间盘髓核细胞的形态及活性变化.[方法]收集20例人退变椎间盘髓核,分离髓核细胞行平面培养,倒置相差显微镜和HE染色观察髓核细胞的生长过程与形态变化,流式细胞仪量化细胞周期分布和凋亡率,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色髓核细胞聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的表达,观察平面培养传代对髓核细胞活性和基质合成能力的影响.[结果]原代髓核细胞呈类圆形或多角形,平均7d贴壁,31 d融合至95％,P1代髓核细胞呈长梭形或多角形,平均12h贴壁,6.6d融合至95％,两代细胞增殖能力的差异有统计学意义(P＜0.01).原代与P1代髓核细胞的细胞浆阳性染色聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原,生长融合至95％后约90％的细胞分布于G1期,约16％的细胞凋亡,两代细胞的细胞活性和基质合成能力无统计学差异(P＞0.05).[结论]人退变椎间盘髓核细胞体外平面培养将经历显著的形态学变化.传一代后髓核细胞增殖能力提高,但能维持细胞活性以及蛋白聚糖和Ⅱ型胶原的合成能力.