人抗肌萎缩蛋白Dp71 shRNA载体构建与检测

目的:构建有效针对人Dystrophin Dp71基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,并验证其干扰效果。方法:设计合成3对针对人Dystrophin Dp71基因的和1对无同源性的siRNA片段,在两端和中间加上酶切位点和Loop环。将合成的DNA片段插入到干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中,经过酶切和测序验证,成功构建人Dp71基因的shRNA和空白对照载体。将各干扰载体和空白载体转染人正常胃黏膜上皮细胞(gastric epithelial cells,GES-1)和人支气管上皮细胞(human bronchial epithelium,HBE),Western印迹检测Dp71 shRNA真核表达载体的干扰效率。结果:酶切和测序验证均表明各Dp71-shRNA载体构建成功。将空载体及各Dp71 shRNA载体分别转染GES-1和HBEC,和空白细胞对照及shRNA空白载体组相比,3组Dp71-shRNA能够明显抑制Dp71蛋白表达,但是3组质粒的抑制效率有一定的差异,以Dp71 shRNA2对Dp71表达的干扰效率最强。结论:成功构建了3个有效针对人Dystrophin Dp71基因的shRNA干扰载体,3组质粒都能有效地抑制Dp71在GES-1和HBEC中的表达,其中以Dp71-shRNA2的抑制效率最高。     

人FoxA1 shRNA载体构建与检测

目的构建有效的针对人FoxA1基因的shRNA干扰载体,并验证其干扰效果。方法设计合成3对针对人FoxA1基因的和1对无同源性的shRNA片段,将合成的shRNA片段插入到干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中,经过酶切和测序验证,成功构建人FoxA1基因的shRNA和空白对照载体。将各干扰载体和空白载体转染人正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)和胃癌细胞(SGC-7901),Realtime RT-PCR和Western-blotting检测干扰载体的干扰效率。结果①酶切和测序验证均表明各shRNA载体构建成功。将空载体及各干扰载体分别转染人正常胃黏膜细胞(GES-1)和胃癌细胞(SGC-7901)发现,和空白对照组相比,3组干扰载体能够从mRNA和蛋白表达水平明显抑制FoxA1的表达,但是3组质粒的抑制效率有一定的差异,以3号质粒对Foxa1的干扰效率最强。结论成功构建了三个有效的针对人FoxA1基因的shRNA干扰载体,三组质粒都能有效地抑制FoxA1在GES-1细胞和SGC-7901细胞中的表达。     

凋亡抑制蛋白Livin shRNA真核表达载体的构建

目的设计构建Livin的shRNA真核表达载体，并转染宫颈癌HeLa细胞，进一步研究该表达载体对目的基因Livin的沉默效果，为宫颈癌基因治疗探索新方法。方法以Livin为靶基因，以Pgenesil-1质粒为载体，构建重组体，根据Livin基因cDNA序列，设计shRNA寡核苷酸序列，退火后克隆到空载体Pgenesil-1中，转化DH5α菌株，提取质粒，进行酶切鉴定和测序分析。将构建好的真核表达载体转染宫颈癌HeLa细胞。结果经酶切鉴定出的重组体测序结果与目的序列相同，重组载体构建成功，并被成功转入宫颈癌HeLa细胞，可见绿色荧光蛋白表达，48 h转染效率最高。结论利用RNA干扰技术可成功构建小干扰RNA重组体，为进一步研究宫颈癌基因治疗奠定基础。     

人β-COP-shRNA慢病毒载体构建及干扰效应检测

目的采用常规转染试剂难以将人β-COP-shRNA转染至THP-1细胞。构建人β-COP特异性的shRNA慢病毒载体,并测定其对靶基因β-COP的抑制效应。方法设计合成针对人β-COP基因靶点特异的4对shRNA寡聚单链DNA,插入p GMLV-SC1载体中,构建慢病毒重组载体。将重组载体和包装质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒并测定滴度。用慢病毒感染THP-1细胞,定量PCR和Western blot检测干扰载体对β-COP基因的干扰效果。结果测序证实,β-COP基因的shRNA寡聚核苷酸序列已插入慢病毒载体,转染HEK 293T细胞,经包装得到4种慢病毒,病毒滴度为1×109TU/m L。定量PCR分析显示,4种β-COP-shRNA慢病毒感染的THP-1细胞中β-COP基因mRNA表达量分别为0.831±0.065、0.675±0.079、0.260±0.050、0.497±0.067,较对照(1.000±0.000)明显升高(P<0.01);其抑制率分别为16.9%、32.5%、74.0%和50.3%。Western blot结果表明,4种干扰载体均可抑制β-COP蛋白表达,其中β-COP-shRNA 3的沉默效率为76.4%。结论成功构建了人β-COP-shRNA干扰载体,证实了干扰载体对靶基因有较好的沉默效果。     

细胞周期相关因子CDCA3基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,构建能有效下调CDCA3蛋白表达的shRNA真核表达载体,研究其对CDCA3表达的影响,以便进一步研究CDCA3的功能。方法根据文献获得CDCA3的siRNA靶序列,依据RNA干扰机制和shRNA靶序列的设计原则,以CDCA3基因为靶基因,合成一对编码shRNA的两条DNA序列,经退火后合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pSIREN-DNRDsRed质粒中,连接产物转化E.coilJM109感受态细胞,然后挑取克隆提质粒,进行酶切鉴定和DNA序列测定。将构建成功的载体通过脂质体介导转染导入人胚肾HEK293细胞,采用Western blot法和Realtime RT-PCR,检测特异性shRNA对CDCA3蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果。结果成功构建靶向CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体;转染HEK293细胞后,可显著下调CDCA3在细胞内的mRNA水平及蛋白表达水平。结论 CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体能显著下调HEK293细胞内的CDCA3蛋白表达。成功构建CDCA3 shRNA表达载体,为进一步研究CDCA3基因的功能提供了实验基础。     

靶向小鼠整合素β_1的shRNA表达载体构建及鉴定

目的构建小鼠整合素β1的shRNA表达载体,用RNA干扰下调整合素β1基因在小鼠支气管平滑肌细胞中的表达。方法设计并合成靶向小鼠整合素β1基因的shRNA表达载体,转染入哮喘小鼠的支气管平滑肌细胞,检测shRNA表达载体对靶基因的抑制效果。结果 shRNA表达载体能稳定转染小鼠支气管平滑肌细胞,转染后的整合素β1mRNA及蛋白质水平均显著下调。结论成功构建了靶向小鼠整合素β1高效、持久的shRNA表达载体,转染细胞后可下调整合素β1表达,为进一步研究整合素β1在哮喘气道重塑中的作用及其基因治疗奠定了基础。     

靶向mdr1基因shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒.方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM 3.1-H1 neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体.采用酶切法和测序法鉴定.结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66 bp模板寡核苷酸片段和4.3 kbp的线性化的pSilencerTM 3.1-H1 neo载体片段.重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符.结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础.     

适用于shRNA表达研究的克隆载体构建

目的:建立一种适用于shRNA表达研究的克隆载体。方法:通过PCR扩增一段含有自杀基因ccdB和卡那霉素抗性基因的DNA序列,将其双酶切后克隆至shRNA表达载体pSilencer3.1-H1neo中,得到重组体pSilencer3.1-ccdB。运用此重组体构建荧光素酶的shRNA表达载体并设立对照进行非重组背景的结果比较。结果:成功建立了pSilencer3.1-ccdB克隆载体。应用此载体构建荧光素酶的shRNA的表达载体,结果显示完全消除了非重组背景。结论:建立了适用于shRNA表达研究的克隆载体,为进一步研究siRNA的基因功能奠定了基础。     

靶向骨桥蛋白shRNA表达载体的构建与鉴定

目的通过构建骨桥蛋白（osteopontin,OPN）shRNA表达载体,探索卵巢癌基因治疗新途径。方法根据基因库上的OPN—mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的64个碱基的寡核苷酸链。寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接到线性化的pSilence质粒中,并对重组质粒进行酶切及序列鉴定。结果OPNsiRNA表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA结果一致。结论靶向OPNshRNA表达载体的构建成功为研究降低卵巢癌OPN表达的抗肿瘤效应,及与放化疗的协同效应打下了基础。     

Prohibitin基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体．方法：根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序．结果：酶切结果表明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计一致．结论：成功构建两个靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体,为下一步研究prohibitin基因在肿瘤细胞中的作用和后续的的体内外实验奠定了基础．     

人EFNB2基因shRNA表达载体的构建及表达

目的:构建针对人EFNB2基因的特异性shRNA真核表达载体,并在宫颈癌Hela细胞中表达.方法:运用基因工程技术构建pEFNB2-shRNA载体,转染Hela细胞,通过RT-PCR及Western blot检测干扰效率,筛选抑制作用明显的载体.结果:构建获得的pEFNB2-shRNA表达载体能够有效抑制EFNB2基因...     

Survivin shRNA真核表达载体的构建及其生物学作用

目的:构建存活素(survivin)基因短发夹RNA(shR-NA)的表达质粒,为乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.方法: 设计并合成有小发夹结构的8条survivin shRNA对应模板序列,退火并与pShuttle 1.0-CMV载体重组质粒;将重组质粒转染人乳腺癌细胞MCF-7;MTT实验筛选出最有效质粒及其有效浓度,流式细胞术检测细胞周期的变化,经Hcechst染色观察凋亡情况,RT-PCR和Westem Blot检测survivin基因的表达情况.结果: 成功构建重组质粒并筛选出最有效质粒及其有效浓度;细胞受阻于G2/M期,并通过荧光染色发现有凋亡细胞;survivin基因表达受到抑制.结论: 构建的重组质粒能抑制survivin基因的表达,这为研究乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.     

人Smad3的shRNA表达载体构建和鉴定

目的：构建人Smad3的shRNA表达载体，运用RNAi下调Smad3基因在肿瘤细胞系中的表达，观察对肿瘤细胞生长的影响．方法：化学合成针对人smad3基因的dsRNA，瞬时转染入Hela细胞，检测RNA干扰效果，筛选有效干扰靶位点；设计并合成针对人smad3基因的siRNA寡核苷酸链，经退火形成双链后克隆入质粒载体pSilencer^TM3．1-H1hygro，转染入Hela细胞，用hygromycinB筛选稳定单克隆细胞株，对细胞株行RT-PCR和Western Blot检测，观察siRNA对靶基因的抑制效果，进一步研究下调目的分子表达水平以后肿瘤细胞生长的变化．结果：瞬时转染筛选到了有效的RNA干扰靶位点，构建载体后，建立稳定转染的单克隆细胞株，smad3mRNA和蛋白质水平均显著下调，导致肿瘤细胞生长抑制．结论：成功构建了针对人Smad3高效、特异、作用持久的shRNA表达载体，转染细胞后可下调Smad3的表达，为进一步研究smad3的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础．     

海人藻酸受体亚基GluR6特异性shRNA真核表达载体的构建

目的 构建海人藻酸受体亚基GluR6的shRNA真核细胞表达载体,进一步研究GIuR6在脑缺血中的作用机制.方法 根据GenBank数据库中GluR6的cDNA序列设计靶序列,化学合成两条互补的DNA寡核苷酸链,连接质粒后转染大肠杆菌,使其在大肠杆菌内大量复制;提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定及测序分析.结果 限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了序列的正确性,与合成的寡核苷酸序列完全相符,且以正确的方向插入.结论 成功构建了GluR6特异性shRNA真核表达载体.     

pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒的构建与鉴定

摘　要：目的　构建pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒靶向敲低ZNF703。方法　根据人和鼠ZNF703 基因序列中的外显 子区在RNA干扰平台上（broadinstitute.org）设计shRNA的靶向序列,并根据pLKO.1 中 Age I 和EcoR I酶切位点序列设 计并合成ZNF703 shRNA的引物;对引物进行退火;将pLKO.1 质粒进行酶切、胶回收;用T4 酶进行连接、转化、涂板,对 阳性克隆菌落PCR鉴定和测序鉴定;将构建好的质粒利用慢病毒包装并转染HCT-116 细胞系,Q-PCR检测ZNF703 的 敲低效率。结果　成功构建pLKO.1-ZNF703 shRNA质粒,并且利用病毒包装体系构建ZNF703 shRNAHCT-116 细胞系, RT-PCR结果显示设计并构建的pLKO.1-ZNF703 shRNA 质粒可用于有效敲低ZNF703。结论　成功构建可用于有效敲低 人或鼠源细胞系中ZNF703 的pLKO.1 -ZNF703 shRNA质粒。     

PLCε shRNA质粒构建及功能鉴定

T24细胞株后对PLCε mRNA及对PLCε蛋白表达均有明显抑制,流式细胞术结果表明细胞阻滞于G0/G1期,MTT检测表明重组的载体质粒明显抑制T24细胞增殖活力.结论 针对PLCε基因的shRNA能有效抑制膀胱癌T24细胞中PLCε基因的表达及膀胱癌细胞增殖.     

人睾丸特异表达基因TDRG1shRNA表达载体的构建及其表达

目的:构建人睾丸基因TDRG1 的shRNA 表达质粒, 并研究其在NTE-2 细胞中的表达。方法:设计合成有短发夹结构靶位TDRG1 基因的寡核苷酸, 经退火成双链, 克隆至载体pGPU6/GFP/Neo 中, 构建TDRG1shRNA 表达载体, 得到重组质粒TDRG1-shRNA486, TDRG1-shRNA738, TDRG1-shRNA921 和一个阴性对照, 使用Lipofectamine^TM 2000 转染shRNA 至NTE-2 细胞, 应用RT-PCR 法检测转染后NTE-2 细胞TDRG1 mRNA 的表达水平。结果:经测序证实, 插入的DNA 片段的序列与设计序列完全一致。同时筛选到转染TDRG1-shRNA486 的NTE-2 细胞TDRG1 基因的mRNA 表达水平明显抑制。结论:成功构建了人类睾丸基因TDRG1 的shRNA 表达载体, TDRG1-shRNA 在NTE-2 细胞内成功表达。