家蝇二氯苯醚菊酯抗性机理的初步研究

为了研究家蝇拟除虫菊酯抗性机理,在实验室选育了家蝇二氯苯醚菊酯抗性品系,根据P450基因CYP6D1的保守序列设计合成引物,用PCR方法从敏感品系和抗性品系个体都能扩增出一条约210bp的特异性片段,从片段大小和条带明亮程度上均未显示出二者之间有什么差异,初步表明抗性家蝇P450基因在DNA水平上没有明显的变化。RT-PCR结果多次重复显示抗性品系的扩增带明显比敏感品系的亮,揭示二者RNA的含量可能不同,抗性品系P450基因的转录活性可能升高。这些为在分子水平研究P450基因相关的拟除虫菊酯抗性机理打下基础。     

CYP4G19基因表达水平对德国小蠊耐药性的影响

目的通过对细胞色素P450家族CYP4G19基因在德国小蠊耐药株和敏感株中表达水平的研究,初步探讨CYP4G19基因与德国小蠊耐药性的关系。方法用广口瓶内采用药膜接触法测定野生株和敏感株德国小蠊的耐药指数,RT-PCR比较野生株和敏感株德国小蠊CYP4G19基因表达,RNAi沉默德国小蠊CYP4G19基因,免疫组织化学法测定CYP4G19蛋白表达。结果深圳市现场采集野生性德国小蠊,用广口瓶药膜法测得其抗性指数为3.88,其抗药性显著高于敏感株（P〈0.01）;野生株CYP4G19 mRNA表达水平比敏感株显著上调（P〈0.01）;野生株CYP4G19基因沉默后CYP4G19蛋白表达明显下降,但仍然具有一定的抗药性。结论深圳市德国小蠊野生株对＂家虫清＂产生了一定的抗药性,对菊酯类杀虫剂产生抗药性的德国小蠊CYP4G19基因的转录、翻译表达水平均有上调。     

贵阳市家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性现状与kdr(L1014F)等位基因频率分析

探讨贵阳市区家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂抗药性水平与kdr等位基因上的LI014F点突变频率相关性,为贵阳市科学合理使用卫生杀虫剂控制家蝇提供科学依据.本研究采用WHO推荐的微量点滴法进行抗性测定.结果显示贵阳市4城区家蝇对氯菊酯和高效氯氰菊酯的LD50分别为0.00620 ～ 0.013339μg/雌蝇、0.02298 ～0.03614 μg/雌蝇,抗性系数分别为3.35 ～7.56、7.38 ～11.62.采用特异性等位基因PCR法测定基因频率,结果显示4城区家蝇种群的L1014F点突变频率在29％ ～37％.相关性分析显示L1014F点突变等位基因频率与高效氯氰菊酯LD50值之间存在直线相关.研究结果表明贵阳市家蝇对氯菊酯、高效氯氰菊酯已经产生了抗药性,击倒抗性是其抗性机理之一.     

家蝇抗药性的分子遗传机制

综述了近年来家蝇抗药性分子机制的研究进展。脂族酯酶基因(MdaE7)在位置137(Gly)和251(Trp)的氨基酸突变可能与家蝇对有机磷抗性有关;谷胱苷肽S转移酶(GSTs)超量表达在家蝇对有机磷农药的抗性中起重要作用;有机磷抗性家蝇的AChE基因普遍存在Gly262Ala和Phe327Tyr突变。击倒抗性(kdr)和P450介导的代谢抗性是家蝇对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的重要机制,电压门控钠离子通道的L1041F突变产生Kdr,而M918T和L1041F双突变导致超击倒抗性(superkdr);P450介导的代谢抗性表现出进化可塑性的特点。有关家蝇抗性机制的阐明,可为抗性的检测和监测提供准确和方便的手段。     

白纹伊蚊基因组中CYP6家族新成员基因片段的克隆与分析

目的获得白纹伊蚊CYP6基因家族中新成员的基因片段。方法根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E1同源区氨基酸序列,设计1对简并引物,分别以白纹伊蚊敏感品系和抗性品系基因组DNA为模板进行PCR,产物经T-A克隆转化至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序,获得与设计的细胞色素P450基因片段大小相符合的5个基因片段,并将推导的氨基酸序列进行同源性分析。结果在白纹伊蚊敏感品系中获得了2个基因片段(AEDG-S1,AEDG-S2),核苷酸序列长度分别为240bp和236bp;在白纹伊蚊溴氰菊酯抗性品系中获得了3个基因片段(AEDG-R2,AEDG-R3,AEDG-R4),核苷酸序列长度分别为236bp、236bp和239bp。所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在23.1%～53.8%之间,与CYP3家族的同源性在25.6%～43.9%之间,而与CYP4家族同源性较低,为13.9%～24.4%。结论所得5个序列为CYP6家族中5个新成员的基因片段。     

家蝇抗药性相关乙酰胆碱酯酶基因突变的进化起源分析

家蝇是多种人与动物疾病的传播媒介，化学防治是家蝇防治的重要手段之一，但杀虫剂抗性是家蝇化学防治的一大障碍。以往的研究表明，乙酰胆碱酯酶(由Ace基因编码)的某些点突变与家蝇对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂抗性相关。在我国野外家蝇群中发现了可以导致抗药性的乙酰胆碱酯酶V260L、G342A、G342V和F407Y氨基酸置换，但对其进化起源模式尚缺乏认识。本研究采用基因片段测序的方法，获得了来自北京、山东、上海、广东4个省份的728头家蝇的Ace基因片段序列，从中鉴定出9种不同的Ace单倍型。分子系统树和网络图分析发现了V260L、G342A和F407Y突变的多起源性，4种三位点突变(L-A-Y)的单倍型源自两条不同的进化途径。     

用mRNA RT-PCR差异显示技术克隆拟除虫菊酯抗性家蝇细胞色素P450基因片段

细胞色素P450单加氧酶系是一类广泛分布在生物有机体中的重要酶系,具有多样的功能。细胞色素P450介导的杀虫剂代谢解毒作用的增强是昆虫对杀虫剂产生抗性的普遍机制。为揭示家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂的分子基础,我们利用mRNA差异显示技术(DDRTPCR)从溴氰菊酯抗性品系家蝇Muscadomestica中分离出2个新的基因片段(M1,M2)。序列比对(BlastP)结果表明,M1与黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中的Cyp6A9在氨基酸水平上具有54%的相似性,M2分别与果蝇Drosophilasimulans中的Cyp6g1有65%的相似性。M1和M2包含P450的特征序列,并与细胞色素P450具有最高程度的序列相似性,是为细胞色素P450基因片段。     

家蝇二氯苯醚菊酯抗性品系酯酶分析

本文利用离体酯酶测定和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分析了家蝇二氯苯醚菊酯抗性品系（下称Ｐｍ－Ｒ）和敏感品系（下称ＳＳ）的非专一性酯酶变化情况。实验结果显示：Ｐｍ－Ｒ非专一性酯酶活性比ＳＳ略有升高，仅１．５２倍，聚丙烯酰胺凝胶电泳发现二者酯酶带型不一样，各组份所占比例也不同。由此可以推断：在用二氯苯醚菊酯选育的家蝇抗性品系中，抗性的增长与非专一性酯酶活性变化关系不大，而可能与其组成结构的改变有关。     

广州地区白纹伊蚊对常用杀虫剂抗药性的初步研究

目的初步了解广州地区白纹伊蚊对常用杀虫剂的抗药性水平,为控制登革热媒介科学合理用药提供依据。方法从广州地区三种环境类型（农村、郊区、城区）采集白纹伊蚊幼虫,实验室繁殖1—2代,采用WHO推荐的生物测试法进行测定。结果广州农村地区白纹伊蚊对溴氰菊酯、高效氯氰菊酯的抗药性指数分别为4．95、2．41,已产生低抗性;城区、郊区白纹伊蚊对敌敌畏有低抗性,抗药性指数分别为2．16、3．45;三种环境类型白纹伊蚊均对倍硫磷、氯菊酯、残杀威敏感。结论广州地区不同环境类型白纹伊蚊对常用杀虫剂抗药性有差异．应因地制宜。科学合理使用杀虫剂。     

CYP4基因表达量在致倦库蚊溴氰菊酯抗性株和敏感株生活史各期中的初步研究

本用磁性分离法直接从蚊虫组织中提取mRNA．用地高辛标记的p450 CYP4基因片断为探针与mRNA杂交．检测致倦库蚊溴氰菊酯抗性株和敏感株生活史各期中CYP4基因表达量的变化情况。结果显示：两株的生活史各期中CYP4基因的表达量以幼虫为最高，蛹期最低，而抗性株与敏感株间同期的CYP4基因表达量未见显差别。     

广州市区致倦库蚊对溴氰菊酯抗药性现状调查

采用浸渍法测定致倦库蚊幼虫的LC50。结果东山区，海珠区，芳村区，荔湾区，越秀区及天河区各采集点致倦库蚊幼虫LC50分别为0.0067ppm,0.0091ppm,0.0072ppm,0.0111ppm,0.0081ppm,0.0130ppm；与致倦库蚊敏感品系相比，对溴氰菊酯抗性比分别为13.1倍，17.8倍，14.1倍，21.8倍，15.9倍，25.5倍。表明广州市区致倦库蚊对溴氧菊酯杀虫剂产生了不同程度的抗药性。     

淡色库蚊中溴氰菊酯和生物丙烯菊酯抗性发展与击倒抗性基因频率之间的关系?

使用溴氰菊酯和生物丙烯菊酯对采自北京的淡色库蚊蚊株进行抗药性筛选,筛选时,4龄幼虫被置于LC_(50)浓度值的水体中饲养。经过7代的不间断筛选,蚊虫对溴氰菊酯和生物丙烯菊酯的抗性倍数分别上升了12.9倍和4.8倍,对应敏感株,抗性倍数分别为217.8倍和41.6倍。PCR检测结果显示,kdr抗性基因的频率在逐代上升。F_7代时,溴氰菊酯筛选株和生物丙烯菊酯筛选株的kdr抗性基因频率已分别上升至98.96%和97.87%。结果表明,Phe1014的抗性纯合子频率和抗性杂合子频率均与LC_(50)值之间具有显著相关性。本文证明了高浓度的拟除虫菊酯杀虫剂筛选会使Phe1014突变频率快速的上升。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6cDNA片段克隆、鉴定

根据家蝇CYP6A1,CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E1的保守区氨基酸序列设计一组简并引物,采用RT-PCR的方法,从白纹伊蚊四龄期活体幼虫总RNA中扩增出与设计相符的基因片段。利用T-A克隆法,将获得的基因片段克隆入pGEM-Teasy载体。经限制性内切酶酶切和PCR鉴定证明重组成功。将筛选的阳性克隆经序列测定及同源性分析。表明共获得CYP6家族中9个的新cDNA序列。为进一步研究细胞色素P450的多样性及其与抗药性形成的分子机制打下基础。     

抗性家蝇para基因的选择性剪接和位点突变

为了在分子水平上研究拟除虫菊酯抗性家蝇靶标抗性机制 ,根据昆虫para型钠通道Ⅱ区S4至S6及Ⅱ与Ⅲ连接区的保守区域 ,设计简并引物 ,利用降落RT PCR ,克隆拟除虫菊酯kdr (R品系 )家蝇para型钠通道 70 4bp的cDNA ,根据此序列用PrimerPremier5 0设计特异引物 ,分别扩增敏感 (SS品系 )、super kdr(RR品系 )家蝇各 6 5 1bp的cDNA。结果SS无有义突变 ,R和RR在ⅡS6CTT到TTT的替换导致Leu 10 14到Phe的保守性突变 ,RR在ⅡS 4～ 5细胞内片段接头处没有与超 -kdr抗性相关的Met到Thr突变 ;另外首次发现kdr (R品系 )家蝇在Ⅱ与Ⅲ连接区出现 39bp的选择性剪接 ,构成家蝇para钠通道亚型 (命名为xych ,GenBank登陆号为AF4 114 5 2 )。     

德国小蠊细胞色素P450 CYP4G19基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建细胞色素P450 CYP4G19基因部分片段的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备CYP4G19多克隆抗体。方法应用RT-PCR扩增CYP4G19基因部分片段,产物经T-A克隆、测序鉴定,亚克隆入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,镍离子亲和层析法纯化重组蛋白后,免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA及Western-blot检测多抗的效价及特异性。结果从德国小蠊cDNA中克隆出一段771bp的亲水性基因片段,在大肠杆菌中诱导表达出约32000Mr、以包涵体形式存在的P450重组蛋白。将纯化、复性的重组蛋白免疫小鼠。得到了滴度高于1：10^6的高效价多克隆抗体。Western-blot显示此多抗能与32000Mr的重组蛋白特异结合,并能识别天然的德国小蠊微粒体P450蛋白。结论利用原核表达的CYP4G19融合蛋白具有良好的免疫原性。制备出效价高、特异性强的抗德国小蠊CYP4G19多克隆抗体,为下一步关于德国小蠊CYP4G19蛋白表达特性及其抗药性功能的深入研究提供了重要的实验工具。     

家蝇抗药性的分子机制：乙酰胆碱酯酶介导的抗药性

乙酰胆碱酯酶（AchE）是有机磷和氨基甲酸酯杀虫剂的主要作用靶标,该酶氨基酸残基的替换可以降低AchE对这两类杀虫剂的敏感性,从而使昆虫表现出对这两类杀虫剂的抗性。至今在抗性家蝇AchE中鉴定出多个不同位点的点突变,以G262A／V和F327Y突变最为普遍。262和327两位点上的氨基酸残基靠近AchE的活性位点三联体,G262A／V和F327Y替换可以通过改变起催化作用的丝氨酸的定位或通过降低酰基．结合袋的空间来改变酶的活性,在抗性进化过程中起着重要的作用。家蝇AchE点突变的效用是累加,多突变组合往往导致更高水平且更广谱的抗性。从不同抗性家蝇种群中检测出相同的AchE遗传突变,表明这一抗性进化机制的保守性;多种抗性等位基因共存于家蝇种群中,反映了杀虫剂使用的多重性。家蝇乙酰胆碱酯酶抗性等位基因种类分布因地区而不同,但也有重叠。家蝇种群表现出抗性等位基因的演替,推测是杀虫药剂的轮替使用的结果。     

河南省焦作和漯河两市淡色库蚊对常用杀虫剂抗药性调查

为掌握河南省焦作和漯河两市淡色蚊虫对常用杀虫剂的抗药性状况,为科学合理使用杀虫剂提供依据,本文采用WHO推荐的药液浸滞法,测定4龄期蚊幼虫的半数致死浓度。通过与敏感种群的对比,计算抗药性倍数。焦作市淡色库蚊对敌敌畏、马拉硫磷、溴氰菊酯、氯氰菊酯的抗性倍数分别为8?44、1?12、13?68、9?81,对溴氰氰菊酯类药物抗药性倍数最高,属于中抗水平（RR＞10）,其他属于低抗水平（RR＜10）;漯河市淡色库蚊对敌敌畏、马拉硫磷、溴氰菊酯、氯氰菊酯的抗性倍数分别为18?27、1?03、8?42、33?56,对氯氰菊酯类药物抗药性倍数达到了33?56倍,属于高抗水平（RR＞30）,敌敌畏达到了18?27倍,属于中抗水平（RR＞10）,其他属于底抗水平（RR＜10）。河南省焦作和漯河两市的淡色库蚊对常用杀虫剂已产生不同程度的抗药性。     

抗药性与敏感性德国小蠊乙酰胆碱酶的活性比较

目的研究德国小蠊抗药性与乙酰胆碱酯酶活性的关系。方法采用化学比色方法对敏感品系和抗性品系的德国小蠊分别测试乙酰胆碱酯酶,对比两者的测定值,分析抗性品系和敏感品系德国小蠊乙酰胆碱酯酶的差异。结果敏感品系和抗性品系德国小蠊的乙酰胆碱酯酶活性分别是2.863和5.609,抗性品系德国小蠊酶活性显著高于敏感品系,两者酶活性比值为1.96。结论乙酰胆碱酯酶活性与德国小蠊抗药性有关。     

家蝇抗性相关P450基因的初步研究

为了在分子水平上研究拟除虫菊酯抗性家蝇的 P4 50基因的特性 ,更好地研究其与抗性相关的机制 ,本研究根据在美洲地区的抗性家蝇品系 ( LPR)克隆的 P4 50基因 MDC YP6D1的保守序列设计合成引物 ,用 PCR方法从北京地区的家蝇中也扩增出 1条约 2 1 0 bp的特异性片段 ,片段长度与原序列对应片段相近 ,说明北京地区的家蝇 P4 50基因与 MDCYP6D1间有很大的同源性。H inf I酶切发现扩增产物上并没有相应的酶切位点 ,说明扩增产物与原序列 MDCYP6D1的相应部分不一样 ,提示这一用 PCR方法在北京地区的家蝇中扩增出的 P4 50基因片段有可能对应一新的 P4 50基因。 PCR-SSCP结果显示扩增产物在一级结构上有一定的多态性 ,这一现象可能与 P4 50基因在昆虫体内的复杂多样性有关     

昆虫CYP6家族与抗药性及其转录调控

已知昆虫细胞色素 P4 50单加氧酶是一类具有多样性的酶 ( Feyereisen,1 999) ,在各种杀虫剂如拟除虫菊酯、有机氯化合物、有机磷化合物及氨基甲酸酯类化合物等的代谢中起重要作用 ( Feyereisen,1 995)。目前已鉴定的昆虫细胞色素 P4 50有 8个家族 ( Scott etal.,1 988) ,但并非每一个家族均与昆虫抗药性有关。通过资料分析显示其中 CYP6家族成员与昆虫抗药性关系密切。有关昆虫 CYP6家族多样性与进化 ,本文作者已另文综述。另外 ,已知细胞色素 P4 50单加氧酶对杀虫剂的代谢抗性是由于基因表达调控尤其是转录调控的改变所致 ( Feyereis…