小鼠骨髓间充质干细胞外泌体的分离与鉴定

目的探讨骨髓间充质干细胞的外泌体的分离与鉴定方法。方法通过全骨髓贴壁法培养间充质干细胞;用新兴试剂法收集外泌体,采用电镜、粒径检测、流式细胞仪和Western blot鉴定外泌体。结果第三代骨髓间充质干细胞表面CD45呈阴性表达,CD73和CD105呈阳性表达;骨髓间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形,大小不均匀,直径30~100 nm,有完整的膜结构;粒径检测显示颗粒直径主峰为61.25 nm,直径为20~200 nm的颗粒占72.4%;外泌体CD63和CD81呈阳性表达;细胞培养上清液中可检测到外泌体CD9和CD63的蛋白表达。结论在培养间充质干细胞的培养基中可以收集到外泌体,可以通过透射电镜、粒径检测、流式细胞仪和Western blot对骨髓间充质干细胞的外泌体进行鉴定。     

人脐血间充质干细胞来源的外泌体:分离鉴定及生物学特性

背景:外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡,越来越多的研究表明,间充质干细胞可能通过旁分泌外泌体而发挥对组织损伤的修复作用,目前人脐血间充质干细胞来源的外泌体分离鉴定尚未见报道。目的:分离纯化人脐血间充质干细胞来源的外泌体,并鉴定其生物学特性。方法:收集人脐血间充质干细胞培养上清,采用超滤及梯度离心法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察其形态,流式细胞术检测其表面标志CD63、CD81、CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。结果与结论:人脐血来源的间充质干细胞能够分泌外泌体,电镜下呈椭圆或碟状的囊泡结构,直径40-100 nm。外泌体表达其共性表达标志CD63、CD81及间充质干细胞表面黏附分子CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。结果表明采用超滤及梯度离心法可以成功从间充质干细胞培养上清中分离纯化外泌体,间充质干细胞分泌的外泌体具有外泌体的胞膜蛋白组分。     

差异超速离心法对不同种属间充质干细胞外泌体分离的可靠性研究

目的　分离培养大鼠及小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),通过差异超速离心法分离纯化外泌体并鉴定其形态及生物学性质,分析此方法对外泌体分离的可靠性。 方法 将培养3-5代的骨髓间充质干细胞进行成骨、成脂、成软骨诱导分化并进行染色,同时鉴定细胞表面标志物;通过透射电镜、纳米颗粒示踪分析及Western Blot鉴定分离纯化的外泌体。 结果 通过对成骨、成脂、成软骨分化后染色,大鼠及小鼠BMSCs具备干细胞特有的多向分化潜能。流式检测结果显示大鼠和小鼠BMSCs表达干细胞标志性表面抗原;透射电镜下,小鼠及大鼠BMSCs外泌体呈典型双层膜的杯托结构;平均粒径大小为107 nm和152 nm;Western Blot结果显示其表达外泌体标志性蛋白。 结论 我们能成功分离培养大鼠及小鼠的骨髓间充质干细胞;同时,差异超速离心法能够可靠地分离纯化出大鼠及小鼠骨髓间充质干细胞来源的外泌体。     

不同来源间充质干细胞外泌体治疗骨关节炎疗效的比较

背景:在过去的数十年中,间充质干细胞作为组织工程种子细胞,在骨关节炎治疗中展现出了强大的疗效,在国内已开展了多项临床注册试验。研究表明,间充质干细胞主要依靠旁分泌效应释放外泌体等载体在体内发挥治疗作用。目的:比较骨髓间充质干细胞来源外泌体和脐带间充质干细胞来源外泌体治疗骨关节炎的效果。方法:采用超速离心法提取骨髓间充质干细胞来源外泌体和脐带间充质干细胞来源外泌体,采用透射电镜、Nanosight和Western blot鉴定两种外泌体;采用白细胞介素1β与软骨细胞共培养体外模拟骨关节炎环境,通过CCK-8、Western blot、qPCR评估两种外泌体对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡和细胞外基质分泌的影响;建立Ⅱ型胶原酶诱导的大鼠骨关节炎模型,通过大体和组织学染色评估体内注射两种外泌体治疗骨关节炎的疗效,ELISA检测关节液中白细胞介素1β和肿瘤坏死因子α水平。结果与结论:(1)两种外泌体在透射电镜下均为典型的圆形或杯状,粒径在105-120 nm之间,均表达CD63、CD81和TSG1010特征性蛋白;(2)脐带间充质干细胞来源外泌体的产量和纯度均高于骨髓间充质干细胞来源外泌体;(3)...     

人胎盘间充质干细胞来源的外泌体通过增强细胞自噬减轻脂多糖诱导的肺血管内皮细胞损伤

目的 探讨人胎盘间充质干细胞来源的外泌体(hPMSC-exs)对脂多糖(LPS)诱导的人肺微血管内皮细胞(HPMEC)损伤的影响及可能的机制.方法 体外扩增培养hPMSC,收集细胞培养上清,ExoQuick外泌体提取和纯化试剂盒分离、纯化上清液中hPMSC-exs.透射电镜观察外泌体形态特征,Western blot法...     

胎盘间充质干细胞来源人工外泌体的一种制备方法

目的探讨一种利用小鼠胎盘间充质干细胞(mPMSCs)制备人工外泌体的方法。方法采用胶原酶消化法从小鼠胎盘组织中分离培养mPMSCs,采用流式细胞仪检测细胞表面抗原,鉴定其多向分化潜能;利用机械挤压法使mPMSCs依次通过孔径为10、5、1μm的径迹蚀刻膜,经离心纯化后得到人工外泌体;采用超速离心法分离mPMSCs来源的外泌体,并采用透射电镜对比观察形态结构、纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)检测粒径和浓度、蛋白免疫印迹法检测表面标志物。结果通过胶原酶消化法分离培养的小鼠mPMSCs,形态呈长梭型,较为均一,细胞表面高表达CD29、CD44、CD105,不表达CD45、CD34,具有成骨、成脂细胞诱导分化潜能;通过机械挤压法制备得到的人工外泌体在电镜下形态呈圆球形囊泡状,与mPMSCs来源外泌体形态类似;人工外泌体平均粒径为(130.7±5.7)nm,浓度为(5.01±1.08)×10~(11) particles/mL,mPMSCs来源外泌体粒径为(146.7±4.9)nm,浓度为(4.34±0.97)×10~9 particles/mL;蛋白免疫印迹法检测得到人工外泌体和mPMSCs来源外泌体表面均表达抗原CD63、CD81和Tsg101。结论通过机械挤压法可较高效获得人工外泌体,该人工外泌体与通过超速离心法提取得到的mPMSCs来源外泌体具有相似的生物学特性,这为后期将其作为药物载体奠定了一定的研究基础。     

抑制外泌体释放对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的:探讨抑制骨髓间充质干细胞外泌体的释放对其生物学特性的影响及其机制。方法:利用TALEN技术靶向性敲除Rab27a基因构建外泌体释放缺失小鼠模型,随后分离、培养并鉴定骨髓间充质干细胞,用外泌体提取试剂盒提取培养基中的外泌体,并用纳米颗粒跟踪分析(NTA)计数外泌体的数量,透射电镜观察外泌体的大小及形态。利用Ed U实验及检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达来评价间充质干细胞的增殖能力。通过TUNEL染色及MTS实验检测间充质干细胞对缺氧的耐受能力。结果:敲除Rab27a的间充质干细胞释放外泌体的数量明显减少,抑制间充质干细胞外泌体的释放能显著降低其增殖及对缺氧的耐受能力。结论:抑制间充质干细胞外泌体的释放可导致其增殖能力及对缺氧的耐受能力明显降低。     

BDNF干预MSCs源性外泌体减轻过氧化氢致PC12细胞氧化应激损伤

目的探讨经脑源性神经营养因子(BDNF)干预后的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)源性外泌体对H2O2损伤大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的保护作用。方法全骨髓培养法提取大鼠MSCs,取P3代分为对照组及干预组(培养基中加入30 ng/mL BDNF),分别收集细胞上清,超速离心法分离并纯化外泌体,通过透射电镜观察鉴定外泌体形态;用Western blot鉴定外泌体表面标志蛋白CD9、CD63;实验将嗜铬细胞瘤细胞PC12分为4个组:对照组、H2O2组、MSCs外泌体组和BDNF-MSCs外泌体组,前2组培养基中加入PBS,后2组加入相应外泌体(MSCs外泌体组和BDNF-MSCs外泌体组外泌体蛋白浓度均为50μg/mL)均预处理12 h,后3组在培养基中加入H2O2(0. 521 mmol/L)对PC12建立氧化应激的细胞损伤模型;于10 h后以CCK-8法检测细胞活性,检测活性氧(ROS)及超氧化物歧化酶(SOD)值,Western blot检测Bcl-2与Bax蛋白质表达情况。结果 P3代MSCs细胞表面CD90表达阳性。成功提取出外泌体,透射电镜下可见大量直径40～100 nm的不规则球体或茶托形的囊泡结构,膜清晰,相对完整,Western blot显示CD9、CD63蛋白表达阳性。相比于单纯损伤组与MSCs外泌体组,BDNF-MSCs外泌体组细胞活性最高、SOD活性最高、ROS含量最低、Bcl-2/Bax值最高。结论经BDNF干预后的MSCs源性外泌体在H2O2对PC12细胞造成的氧化应激损伤的保护作用优于MSCs源性外泌体。     

脐带间充质干细胞外泌体抑制BEL7402细胞增殖与迁移

目的 研究脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)外泌体对人肝癌细胞株BEL7402细胞增殖与迁移能力的影响.方法 收集hUC-MSCs培养上清,采用超速离心法收集hUC-MSCs外泌体,利用透射电镜检测外泌体形态大小,使用纳米粒度颗粒跟踪分析仪(Nanosight,NTA)检测外泌体粒径大小,使用Western blot技术检测外泌体表面标记物表达情况;利用CCK-8实验观察hUC-MSCs外泌体作用BEL7402细胞后,细胞的增殖情况;运用Transwell迁移实验观察hUC-MSCs外泌体对BEL7402细胞迁移能力的影响.结果 从hUC-MSCs培养上清中成功分离hUC-MSCs外泌体,经检测hUC-MSCs外泌体呈茶托状结构,粒径大小位于50～150nm之间,表面标志物Alix、CD63、CD81及HSP70表达阳性.细胞功能学实验发现:与对照组相比,hUC-MSC-外泌体处理后的BEL7402细胞的增殖和迁移能力均下降.结论 hUC-MSC-外泌体抑制BEL7402细胞的增殖、迁移.     

黑色素瘤细胞来源的外泌体通过上调Treg的CXCR3促进其趋化

目的检测黑色素瘤细胞通过外泌体途径上调CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)CXCR3(chemokine receptor 3)受体表达,提高Treg向肿瘤免疫抑制微环境趋化的能力。方法以超速离心法纯化小鼠黑色素瘤细胞B16上清中的外泌体,透射电镜检测外泌体形态,Western blot检测外泌体标记性蛋白的表达。B16细胞荷瘤小鼠。流式细胞术检测荷瘤小鼠(1、2、3周)和尾静脉注射外泌体后脾脏、肿瘤内Treg的频率。磁珠法分离纯化小鼠的Treg;Transwell实验检测Treg的趋化能力。Western blot检测Treg的CXCR3、p-Smad2的表达水平。结果电镜结果显示,B16细胞释放的外泌体为直径30～100 nm的圆形或类圆形结构;高表达标志性蛋白CD63和Alix,不表达Calnexin。在外泌体刺激下Treg的趋化能力显著增强,但可被抗CXCR3的单克隆抗体阻断。Western blot结果显示外泌体可提高Treg细胞内Smad2的磷酸化,并上调CXCR3的表达水平,Treg的趋化能力随之增强。结论 B16细胞来源的外泌体通过Smad2磷酸化途径提高了Treg细胞内CXCR3的表达,进而增强其趋化能力。     

大鼠腹膜源肥大细胞外泌体的分离、培养与鉴定

目的：分离、培养及鉴定大鼠腹膜源肥大细胞外泌体。方法：提取8～10周龄SPF级雌性SD大鼠腹腔灌洗液,使用Percoll密度梯度分离法分离灌洗液中的肥大细胞,通过甲苯胺蓝染色鉴定肥大细胞,在细胞培养板中加入白细胞介素3和干细胞生长因子诱导肥大细胞成熟,收集细胞上清液,采用超速离心法分离上清液中的外泌体,通过透射电镜,纳米流式细胞仪从外泌体形态、粒径和表面标志蛋白三个方面鉴定外泌体。结果：分离得到的肥大细胞被甲苯胺蓝染成蓝紫色,分离的肥大细胞外泌体呈典型盘状,粒径分布范围为30～150 nm,平均粒径为75.33 nm,外泌体表面标志蛋白CD9和CD81呈阳性表达。结论：Percoll密度梯度分离法联合超速离心法分离大鼠腹腔灌洗液中肥大细胞外泌体的方法是可行的。     

高表达软骨调素1骨髓间充质干细胞来源外泌体促进骨关节炎软骨细胞的增殖

背景：软骨调素1(chondromodulin-1,Chm-1)在正常软骨中大量表达,具有抑制血管生成、阻止软骨细胞肥大、缓解骨关节炎发展的功能,在骨关节炎发生和发展中发挥着重要作用。目的：探讨高表达Chm-1骨髓间充质干细胞来源外泌体对骨关节炎环境中软骨细胞增殖的影响。方法：分离大鼠骨髓间充质干细胞并进行培养及鉴定;Chm-1慢病毒和空载慢病毒转染骨髓间充质干细胞,超高速离心法提取细胞培养上清液中外泌体(Chm-1-Exos和NC-Exos)。白细胞介素1β作用软骨细胞24 h构建体外骨关节炎模型,随后分别用2种外泌体处理7 d,将PBS处理的骨关节炎软骨细胞作为对照组。共聚焦显微镜观察骨关节炎软骨细胞对外泌体的摄取情况;CCK-8评估各组骨关节炎软骨细胞增殖能力;Western blot检测2种外泌体中Chm-1的表达;Western blot和RT-qPCR方法分别检测各组骨关节炎软骨细胞中Ⅱ型胶原、SOX9、AGG蛋白和mRNA的表达。结果与结论：(1)骨髓间充质干细胞呈典型纺锤状形态且具备三系分化能力;(2)带有绿色荧光的慢病毒成功转染骨髓间充质干细胞;(3)外泌体直径在40...     

人牙周膜干细胞来源外泌体干预成骨细胞MC3T3-E1的增殖和分化

背景:人牙周膜干细胞具有较强的成骨分化能力,人牙周膜干细胞来源外泌体作为牙周膜干细胞分泌的主要成分,对成骨细胞MC3T3-E1增殖和成骨分化的影响尚不明确。目的:探讨人牙周膜干细胞来源外泌体对MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响。方法:采用酶消化法分离及培养人牙周膜干细胞,超速离心法提取人牙周膜干细胞来源外泌体,通过透射电镜、粒径分析及Western blot方法对人牙周膜干细胞来源外泌体进行鉴定;CCK8法检测不同质量浓度人牙周膜干细胞来源外泌体对MC3T3-E1细胞增殖的影响,茜素红染色观察100 mg/L人牙周膜干细胞来源外泌体对MC3T3-E1细胞成骨矿化的影响,Western blot检测100 mg/L人牙周膜干细胞来源外泌体干预前后MC3T3-E1细胞内MEK和ERK的磷酸化水平。结果与结论:①透射电镜观察可见外泌体为脂质双分子层形成的囊泡结构,粒径检测显示外泌体直径分布在50-120 nm,集中在79.86 nm,Western blot检测结果显示提取的外泌体中含有CD81,CD63,TSG101的表达;②与对照组相比,人牙周膜干细胞来源外泌体对MC3T3-E1细胞的增殖具有促进作用,且作用呈剂量依赖性;③与对照组相比,人牙周膜干细胞来源外泌体组MC3T3-E1细胞能够形成更多的钙结节;与对照组相比,人牙周膜干细胞来源外泌体组MC3T3-E1细胞内p-MEK及p-ERK蛋白表达量升高;④结果表明,人牙周膜干细胞来源外泌体可以显著促进MC3T3-E1增殖和成骨分化,推测可能与其激活MEK/ERK信号通路有关。     

脂肪间充质干细胞外泌体可减轻过氧化氢诱导PC12细胞的凋亡

背景：间充质干细胞外泌体在组织损伤修复中可能发挥关键作用，而miRNA是外泌体发挥治疗作用的重要成分，其中miR-29b-3p具有减少细胞凋亡、促进轴突再生和血管生成的作用。目的：研究脂肪间充质干细胞外泌体通过miR-29b-3p对过氧化氢诱导PC12细胞损伤模型的保护作用，并探讨相关机制。方法：(1)首先采用胶原酶消化法提取大鼠脂肪间充质干细胞，通过miR-29b-3p模拟物及抑制物转染脂肪间充质干细胞，采用超速离心法从培养上清中提取外泌体并进行鉴定，从而构建高表达和敲低miR-29b-3p的脂肪间充质干细胞外泌体；(2)通过过氧化氢诱导PC12细胞模拟神经细胞损伤模型，研究脂肪间充质干细胞外泌体通过miR-29b-3p对神经元细胞损伤模型发挥保护作用的相关机制。结果与结论：(1)脂肪间充质干细胞外泌体具有典型的杯状形态，直径分布在50-140 nm范围内，表达外泌体表面特异性标志膜蛋白Alix、CD63及TSG101，并可被PC12细胞成功摄取；(2)脂肪间充质干细胞外泌体预处理可减轻过氧化氢诱导PC12细胞的凋亡，并且这种保护作用随着外泌体中miR-29b-3p表达的增加而增强，...     

试剂盒法与差速超速离心法所提血清外泌体的形态学比较

目的：比较常用的外泌体提取方法,获得可靠有效的血清外泌体提取方法。方法：电镜下观察鉴定差速超速离心法、试剂盒法及组合优化方法所提外泌体的形态;蛋白印迹法检测外泌体标志蛋白CD63的表达。结果：差速超速离心法提取的外泌体呈茶托样双层膜结构,直径100 nm左右;试剂盒法提取的外泌体颗粒多,大小50~200 nm之间,无明显的立体结构,经差速超速离心法纯化后形态与差速超速离心法类似,经试剂盒法纯化后与仅使用一次试剂盒提取的外泌体无明显形态差异;四种方法所提外泌体表达标志蛋白CD63。结论：差速超速离心法是更为可靠且有效的外泌体提取方法。     

流感病毒感染A549细胞外泌体差异microRNA筛选及靶基因分析

目的：提取、鉴定甲型流感病毒（A/PR8/34,PR8）感染A549细胞外泌体，检测外泌体差异表达miRNA并进行靶基因预测、分析。方法：间接免疫荧光法检测PR8对A549细胞的感染率；超速离心法和免疫磁珠法提取、纯化PR8感染细胞外泌体（PR8-exos）及正常A549细胞外泌体（Con-exos）；透射电镜观察外泌体形态和粒径大小；纳米粒径分析（NTA）检测外泌体粒径分布；Western blot检测外泌体标志蛋白；RNAseq检测外泌体差异表达miRNA;KEGG和GO富集分析差异miRNA靶基因。结果：100 TCID50的PR8对A549细胞感染率为100%；透射电镜观察PR8-exos及Con-exos均为杯托状双层膜小囊泡结构；PR8-exos和Con-exos粒径大小分布几乎一致，Con-exos浓度为8.3×1010Particles/ml,PR8-exos浓度为1.6×1011Particles/ml,PR8组外泌体浓度高于对照组；PR8-exos及Con-exos均检测出CD63、CD9和Hsp70蛋白表达，而未检测到calnexin;PR8-exos和Conex...     

骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧状态的影响北大核心

背景:细胞在缺氧条件下会发生功能的变化,而间充质干细胞分泌的外泌体可以缓解细胞缺氧带来的病理性损伤。目的:探讨不同浓度氯化钴对成肌细胞功能变化的影响,并进一步研究骨髓间充质干细胞来源外泌体对成肌细胞缺氧凋亡和活性氧产生的作用。方法:体外分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,通过超速离心法提取外泌体,采用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、Western blot对外泌体进行鉴定。应用0,50,100,200μmol/L氯化钴干预C2C12成肌细胞1,3,5,7 d,CCK-8检测成肌细胞增殖活性变化;干预5 d,qRT-PCR检测成肌分化基因MyHC、MyoD、MyoG的表达水平,改良吉姆萨染色观察成肌细胞融合情况;干预3,5 d,流式细胞仪检测细胞凋亡率;干预3 d,使用DCFH-DA染色观察细胞活性氧水平。成肌细胞分为4组:对照组(0μmol/L氯化钴),氯化钴组(200μmol/L氯化钴),外泌体组(200μmol/L氯化钴+50 mg/L外泌体),NAC组(200μmol/L氯化钴+2 mmol/L抗氧化剂NAC)处理,干预3 d,检测凋亡率和活性氧水平。结果与结论:①外泌体呈杯口状结构,粒径分布在30-150 nm之间,CD9、TSG101表达阳性;②氯化钴对成肌细胞的增殖、分化有显著抑制作用(P<0.05),并且促进了细胞凋亡(P<0.05),高浓度的氯化钴对成肌细胞的功能抑制作用更加明显;③外泌体能够降低200μmol/L氯化钴所诱导的成肌细胞缺氧凋亡和活性氧水平(P<0.05),并与抗活性氧试剂NAC具有相似的作用(P<0.05);④结果表明,氯化钴对成肌细胞的生理功能抑制作用具有一定的浓度和时间依赖性,而骨髓间充质干细胞来源外泌体与NAC具有相似的抗缺氧凋亡和降低活性氧产生的作用,其机制可能为外泌体通过降低活性氧产生的途径而缓解了成肌细胞的缺氧凋亡。     

寨卡病毒感染人肝癌细胞HepG2后外泌体中差异miRNA分析

目的探索人肝癌细胞HepG2感染寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)后的外泌体miRNA的表达差异, 对其靶基因进行预测、分析。方法以感染复数0.5的ZIKV(ZJ03株)感染HepG2, 以超速离心法提取、纯化感染2 d与未感染细胞的外泌体(Exo-ZIKV与Exo-NC)。以透射电镜观察外泌体形态, 纳米粒径分析检测外泌体粒径分布, Western blot检测外泌体标志蛋白质等方法鉴定。提取纯化外泌体小RNA, 进行miRNA测序与分析, 对部分差异表达miRNA采用实时定量PCR验证。生物信息方法分析差异miRNA靶基因。结果在透射电镜下呈杯托状双层膜小囊泡结构;粒径大小分布几乎一致但Exo-ZIKV浓度(5.24×108颗粒/ml )较Exo-NC(3.06×108 paritcle/ml)增多。Western blot检测出Hsp70、CD63和CD9蛋白表达, 测序分析显示共20个差异表达miRNA, 其中12个miRNA表达上调8个miRNA表达下调, 上调miRNA多与抗病毒通路相关, 差异表达miRNA对应的靶基因主要富集在嘧啶与嘌呤代谢等途径中。结论 ZI...     

人胚胎干细胞外泌体中miRNAs的鉴定及其对缺氧心肌细胞作用机制的探讨

目的:胚胎干细胞来源的外泌体对于缺氧心肌细胞的作用机制未明,本研究将对其中微小RNA(miRNA)的角色及作用进行探讨.方法:提取并鉴定胚胎干细胞H9分泌的外泌体,将外泌体处理缺氧条件下培养的AC16心肌细胞,通过Western blot、细胞活力实验、流式细胞术、线粒体膜电位检测等方法分析外泌体对缺氧心肌细胞的作用;...     

人脐带间充质干细胞外泌小体保护缺氧复氧损伤的心肌细胞

 目的: 研究人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs)外泌小体对心肌细胞缺氧复氧损伤后细胞凋亡的作用,并分析外泌小体内具有心脏保护作用的微小RNA(microRNA,miRNA)表达水平。方法: 酶消化法培养HUMSCs并对其免疫表型进行流式细胞术鉴定;收集培养的第3代HUMSCs上清液,利用试剂盒提取外泌小体,电镜观察其形态结构,并采用Western blot法鉴定试剂盒所提物质CD63蛋白水平的表达;用提取的外泌小体处理缺氧复氧条件下的心肌细胞,流式细胞术Annexin V-FITC/PI标记法观察外泌小体对心肌细胞凋亡的影响;实时荧光定量PCR检测外泌小体中miRNA的表达水平;miR-22抑制剂处理缺氧复氧条件下的心肌细胞,流式细胞术检测心肌细胞的凋亡。结果: 流式细胞术检测第3代HUMSCs的CD105、CD73和CD90呈高表达,而CD45、CD34、CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR的表达阳性率低,说明第3代培养的HUMSCs具有间充质干细胞的特异性表型特征。向骨细胞分化诱导HUMSCs,钙结节形成明显,经茜素红染色呈红色结节,分化率为(92.5±5.1)%以上。经向脂肪细胞分化,细胞见脂滴形成,油红染色将脂滴染成红色,分化率为(91.6±3.8)%以上,说明第3代培养的HUMSCs具有间充质干细胞的多向分化能力。扫描电镜观察可见外泌小体球状结构,并且外泌小体特异性蛋白CD63表达强阳性。缺氧复氧导致心肌细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。在缺氧复氧条件下,外泌小体处理使心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。不同浓度外泌小体处理心肌细胞,其抗细胞凋亡作用无明显变化(P>0.05)。实时荧光定量PCR检测外泌小体中富含miR-1a、miR-22、miR-24、miR-133a和miR-139-5p,其中miR-22表达水平最高;在缺氧复氧条件下miR-22抑制剂处理心肌细胞,细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。结论: 人脐带间充质干细胞外泌小体可有效减少缺氧复氧条件下的心肌细胞凋亡,其抗凋亡作用与外泌小体富含的miR-22密切相关。