纳米脂质微泡超声造影剂制备及其显影效果的实验研究

目的 制备一种纳米级脂质超声微泡造影剂,并将其与普通脂质微泡在正常兔肝的造影效果进行比较,以评价其造影效果.方法 经机械振荡法制备纳米脂质微泡,检测其形态、粒径、表面电位等物理特性.分别经兔耳缘静脉团注自制纳米脂质、普通脂质微泡造影剂(2.5 ml/kg),动态观察肝的实质回声增强情况,并用DFY型超声图像分析诊断仪对造影效果进行定量分析.结果 纳米脂质微泡平均粒径为415.8 nm,平均电位为-(13.7±1.6)mV.造影后观察:该纳米微泡能明显增强兔肝的二维灰阶显像,与普通脂质微泡比较,纳米微泡达峰时间较晚,峰值持续时间较短,增强持续时间较普通脂质微泡长,纳米微泡对肝的增强峰值强度略低于普通微泡.结论 自制纳米微泡形态好,粒径均一,显影效果理想,为肿瘤的靶向性研究提供了一个前期基础.     

自制脂质体超声纳米微泡的特性和显影效果

目的　测定自制纳米级脂质体超声微泡造影剂(nano-liposomal bubble,NB)的基本特性.方法　采用逆向蒸发法制备脂质体,用声震法制备NB后观察其形态,检测其平均粒径、表面电位及浓度等物理特性;在脱气水中分别注入生理盐水、NB及SonoVue (200μl),观察显影效果;分别经兔耳缘静脉团注生理盐水、NB及SonoVue (2.0 ml/kg),动态观察兔心脏及肝的增强情况.结果　镜下观察,NB粒径范围133.1～199.5 nm,平均粒径为(171.60±30.82)nm,平均电位为- (1.92±0.65)mV,分布均匀,浓度为(3.8～5.6)×108/ml.常温下造影剂放置1周、1月后观察,基本特性无明显改变.体外显影结果显示:NB与SonoVue一样具有显著的显影效果.体内造影后观察:NB与SonoVue均能明显增强兔心脏及肝的二维灰阶显像.结论　NB性质稳定,形态好,粒径均一,具有良好的显影效果.由于其粒径小且基于脂质体基础上易被修饰,因此在超声分子影像及基因/药物传递方面具有广阔的应用前景.     

纳米级超声微泡造影剂的制备及其性状的初步研究

目的制备适用于超声诊断的纳米级超声微泡造影剂,并对其性状进行初步研究。方法通过低速离心分级分离法制备纳米级的脂膜超声微泡,检测微泡大小形态、表面电位、粒径、分布,测试其与抗体结合情况,体外初步测试其增强显像效果。结果微泡呈圆形,分布均匀,粒径均值为623.4nm;微泡表面电位均值1.3mV,与抗体结合情况良好,体外初步测试能明显增强显像效果。结论通过低速离心分级分离法可以制备纯度较高的纳米级超声微泡,为超声造影剂的小型化和靶向性发展提供重要的工作平台。     

纳米级脂质微泡超声造影剂肿瘤被动靶向研究

目的 观察纳米微泡通过肿瘤血管内皮间隙实现被动靶向的可行性.方法 20只SKOV3细胞皮下种植荷瘤裸鼠分为A组(超声显像组10只)及B组(冰冻切片组10只,再分为B1组及B2组).制备DiI标记的纳米微泡及微米微泡并调整至相同浓度.A组:各裸鼠先后经尾静脉注射相同浓度微米微泡及纳米微泡(35μl/只,间隔1.5h),分别进行超声显像观察.B组;B1组及B2组各裸鼠分别注射相同浓度微米微泡及纳米微泡(约10μl/只),1.5h后对裸鼠进行心脏灌注后切取肿瘤组织及肌肉组织进行冰冻切片、Hoechst核染,激光共聚焦显微镜下观察不同微泡在两组织中的滞留情况.结果 超声显示:纳米微泡组达峰时间及消退时间均长于微米微泡组,而峰值强度低于微米微泡组.冰冻切片观察;纳米微泡组肿瘤细胞周围见明显红色荧光聚集,微米微泡组肿瘤、肌肉组织中及纳米微泡组肌肉组织中均未见明显红色荧光.结论 纳米级脂质微泡可通过肿瘤血管内皮间隙,即实现了肿瘤被动靶向.     

载多西紫杉醇脂质微泡超声造影剂的制备及其性质

目的 制备载多西紫杉醇脂质微泡并测定性质及观察其体内显像效果.方法 制备载多西紫杉醇脂质微泡,测定粒径、包封率等性质;观察60Co射线灭菌前后微泡性质的差异,观察超声辐照后载药微泡药物的释放,并观察其对兔VX2肝癌的显像效果.结果 载多西紫杉醇微泡的浓度为2.2×109～3.2×109个/ml;粒径分布范围为473.4～706.6 nm,平均粒径为623.1 nm;微泡的包封率为70%以上,载药量为(17.5±0.8)%;Zeta电位为-(3.1±0.9)mV;超声辐照微泡溶液后,药物可释放;静脉注射此微泡后,兔肝实质见良好、持续的增强显像,肝癌病灶可见明显的"快进快出"显影表现.结论 载多西紫杉醇脂质微泡包封率较高,性质较佳,体内显像效果好,提高了超声在肝癌等肿瘤诊断中的价值,超声辐照能促使微泡中的药物释放,有望在实时监控下体内定点靶向给药,实现对肿瘤的靶向治疗.     

机械振荡法与声振法制备纳米级微泡超声造影剂效能比较

目的 比较机械振荡法与声振法制备纳米级微泡超声造影剂(Nanobubbles,NBs)的效能.方法分别用机械振荡法和声振法制备NBs,比较两种方法制备NBs的粒径、粒径分布、浓度以及制备所耗时间等.结果 声振法与机械振荡法制备的NBs粒径分别为(373.88±18.43)nm、(360.74±14.39)nm,二者比较差异无统计学意义(P=0.523).声振法制备的NBs离心纯化前粒径分布较广,与机械振荡法制备的NBs粒径分布(分散系数,polidispersity值)比较差异有统计学意义(P＜0.001).机械振荡法制备的NBs浓度为(1.48±0.15)×1010,明显高于声振法制备的NBs浓度[(8.07±0.62)×108] (P＜0.001).声振法制备NBs较机械振荡法耗时长,两者比较差异有统计学意义(P＜0.001).结论 机械振荡法与声振法均能制备出NBs,但与声振法相比,机械振荡法制备的NBs粒径分布窄,浓度高,用时短,可更加快速有效地制备NBs,适合进行肿瘤超声造影成像方面的实验研究.     

以HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂的制备及实验研究

目的 制备以HER2受体为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂,并观察其体外寻靶能力及体外超声显像效果.方法 制备生物素化Herceptin单抗,检测其生物素化程度及生物学活性;薄膜水化-声振法制备生物素化纳米微泡,以生物素-亲和素为桥梁制备HER2为靶点的靶向纳米级脂质微泡超声造影剂,观察其对SKOV3卵巢癌细胞的体外寻靶能力及靶向结合的体外超声显像.结果 平均每分子Herceptin单抗可与16个生物素分子结合;与游离单抗相比,生物素化抗体的活性未见明显降低(P＞0.05).体外寻靶实验观察:靶向纳米微泡组SKOV3细胞表面有明显的红染纳米微泡与其牢固结合,沿细胞表面排列较规则;非靶向组SKOV3细胞表面未结合红染的纳米微泡.靶向纳米微泡体外超声显像:细胞爬片与靶向纳米微泡孵育后可明显增强超声显像效果,对照组均未见明显超声显像.结论 应用生物素-亲和素系统成功构建了以HER2为靶点的纳米级超声造影剂,与SKOV3细胞结合后有明显超声显像效果.     

纳米级超声造影剂制备及成像的实验研究

目的 探讨纯度较高的纳米级超声微泡造影剂的理化性质及体内成像效果.方法 机械振荡法与低速离心法结合制备纳米级微泡,观察微泡形态,检测其平均粒径,并观察其增强正常兔肝显影的情况,并与微米级微泡造影剂进行比较.结果 光镜以及透射电镜观察,微泡呈圆形,分布均匀,无聚集现象.Zeta SIZIER 3000测定微泡粒径均值为623.4 nm,微泡表面电位均值1.3 mV.注射纳米级造影剂于新西兰大白兔体内能持续增强肝的显像效果,与微米级造影剂对比无明显差异.结论 纳米级的微泡造影剂大小合理,分布均匀,显像效果强,为下一步研制小型化靶向造影剂奠定了基础.     

超声靶向微泡破碎和生物可降解纳米粒

目的 探讨超声靶向微泡破碎(UTMD)的物理靶向和纳米粒的生物靶向联合的双靶向方法细胞内递送siRNAs的效果.方法 制备RGD和非RGD生物可降解纳米粒;L16(45)正交设计筛选超声、微泡、纳米粒的优化参数;实验分成优化参数组、RGD纳米粒组、非RGD纳米粒组和空白对照组;倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察并检测分子探针Cy3标记的siRNAs在细胞内的摄取.结果 RGD纳米粒组的细胞摄取率和荧光强度分别为(93.49±1.37)%和34.28±2.06,优化参数组的细胞摄取率和荧光强度分别为(88.33±1.24)%和30.59±3.93,两组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).非RGD纳米粒组的细胞摄取率和荧光强度分别为(71.24±2.80)%和18.39±0.90,优化参数组的细胞摄取率和荧光强度分别为(84.78±2.13)%和27.18±0.91,两组比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 UTMD物理靶向和纳米粒生物靶向联合的双靶向方法不能提高siRNAs的细胞内递送.

Abstract：

Objective To investigate the intracellular delivery of siRNAs through the applications of ultrasound targeted microbubbles destruction(UTMD)and biodegradable nanoparticles carriers.Methods Preparation of nanoparticles with and without RGD sequences,parameters optimization via L16(45)orthogonal design,control experiments in groups of optimization,RGD targeted nanoparticles,non-RGD nanoparticles and blank control, and determinations by inverted fluorescence microscope and flow cytometry were performed.Results The uptake and fluorescence intensity of PC-3 cells in group of RGD targeted nanoparticle was (93.49±1.37)% and 34.28±2.06 respectively,and that in group of optimization was (88.33±1.24)% and 30.59±3.93 respectively(P＞0.05).Whereas the uptake and fluorescence intensity of PC-3 cells in group of non-RGD nanoparticles was(71.24±2.80)% and 18.39±0.90 respectively,and that in group of optimization was (84.78±2.13)% and 27.18±0.91 respectively(P＜0.05).ConclusionsThe applications of UTMD with RGD targted nanoparticles cannot increase the intracellular delivery of siRNAs.     

自制纳米级超声微泡体外基本特性和肿瘤造影增强显影的实验研究

目的 探讨自制纳米级超声微泡的体内基本特性及体内造影增强显影效果.方法 机械振荡与低速离心法结合制备纳米级微泡,并对微泡粒径大小、分布、微观形态和稳定性进行研究.同时在裸鼠肝、肾及前列腺癌皮下移植瘤进行超声造影实验,与常规微米级造影剂对比造影效果.结果 所制备的微泡形态圆整,大小均一性较好,分布均匀无聚集,平均粒径(580.6±36.3)nm.该纳米级微泡能显著增强裸鼠肝肾及皮下移植瘤显影,与常规造影剂比较,不但增强强度相当,且显影时间显著延长.结论 自制纳米级超声微泡造影剂各项物理特性符合纳米级超声造影剂的要求,体内增强效果和稳定性较强,为下一步纳米级微泡在肿瘤显像和治疗中的应用提供实验依据.     

以N-软酯酰基壳聚糖为壳膜的新型超声微泡造影剂的对比成像

目的 制备N-软酯酰基壳聚糖微泡(PCMB)类超声造影剂,评价其超声对比成像效果.方法 以N-软酯酰基壳聚糖为膜材料采用声振法制备PCMB造影剂,用光学显微镜、库尔特计数仪、Zeta电位仪检测其大小、形态、浓度和表面电位.经大鼠尾静脉团注0.1 ml该造影剂观察大鼠左心室、肝脏、肾脏超声造影效果,脱机分析峰值强度(PI)、达峰时间(TTP)、峰值减半时间(HPT)、廓清时间等参数,并与全氟显进行造影性能比较.结果 PCMB分布均匀,浓度为(2.88±0.45)×109/ml,直径为(1.31±0.07)μm(99.98%微泡直径小于8μm),表面电位为(55.03±3.08)mV;对大鼠左心室、肝脏、肾脏超声造影图像清晰,PI和TTP与全氟显相近(P>0.05),但HPT及廓清时间明显延长(P<0.001).结论 以廉价和生物相容性好的N-软酯酰基壳聚糖为壳膜材料制备新型超声造影剂具有良好的超声对比成像效果.     

含生物素化脂膜超声造影剂的制备与初步评价

目的 制备一种含生物素化脂膜的超声造影剂,并对其功能进行初步评价.方法 以冷冻干燥法在自制＂脂氟显＂（对照微泡）的基础上制备含生物素化脂膜超声造影剂微泡,检测其理化性质和造影功能,同时应用激光共聚焦显微镜和平行板流动腔法观察含生物素化脂膜微泡与链亲和素的黏附性.结果 ①含生物素化脂膜微泡造影剂在理化性质与小鼠肝脏造影显像方面能力与对照微泡比较差异无统计学意义（P〉0.05）;②与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的链亲和素孵育后,含生物素化脂膜微泡荧光检测呈阳性,对照微泡为阴性;③含生物素化脂膜微泡可结合于链亲和素包被的培养皿上,且随着链亲和素包被浓度的增加其结合稳定性也相应提高.结论 应用冷冻干燥法在制备＂脂氟显＂微泡造影剂的基础上,可成功制备含生物素化脂膜超声微泡造影剂,为今后制备靶向显影及载药（基因）超声造影剂奠定了基础.     

N-软脂酰基壳聚糖叶酸靶向微泡的体内外特性和靶向效果

目的 应用N-软脂酰基壳聚糖制备叶酸靶向微泡,评价其基本特征、体外靶向性及体内超声显影效果.方法 以高速剪切法制备叶酸靶向微泡和对照微泡,观察叶酸靶向微泡的大小、形态和叶酸分子在微泡的分布及对昆明鼠肾脏的超声显影效果和体外靶向效果,并与对照微泡比较.结果 叶酸靶向微泡呈空心球形结构,形态规则,分散均匀,平均粒径(1.32±0.20)μm,浓度(1.93±0.01)×109/ml;鼠肾对比显影明显增强,1 min、7 min视频强度分别为(30.35±5.01)GU、(17.41±3.15)GU,可视性对比增强持续时间(10.00±3.00)min;与叶酸受体高表达细胞结合数明显大于叶酸受体低表达细胞组和对照微泡组(P<0.01).结论 N-软脂酰基壳聚糖构建的叶酸靶向微泡可与叶酸受体有效结合,可用其作为分子探针,对叶酸受体高表达的肿瘤进行超声分子成像.     

负载液态氟烷的聚合物纳米胶束及囊泡的制备及超声显像

目的 应用人工合成高分子聚合物——聚乙烯二醇与多聚乳酸的两亲性嵌段共聚物制备纳米级超声造影剂（胶束及囊泡）,并评估其体内外的超声显影效果。方法 采用溶剂挥发法通过生物可降解共聚物自组装制备负载不同浓度1-溴代全氟辛烷(PFOB)的纳米胶束与囊泡,并观察其超微结构及粒径分布情况。分别对不同浓度的纳米胶束及囊泡进行体外超声检测及动物皮下注射体内超声显像。结果 透射电子显微镜下观察纳米胶束及囊泡形态规则呈球形,表面光滑;激光测径仪测量其平均粒径集中在404.3～475.8 nm,分布范围窄。体内外超声检测均可显像,且随着液态氟烷浓度的增加,显像效果逐渐增强;负载同一浓度液态氟烷的囊泡超声显像效果优于胶束。结论 采用溶剂挥发法通过生物可降解共聚物自组装可成功制备纳米级超声造影剂——纳米胶束及囊泡,体内外均可进行超声显像,且囊泡显像效果优于胶束。     

载诺帝脂质微泡的制备及特性的实验研究

目的 制备载诺帝(去甲二氢愈创木酸)脂质微泡并测定其包封率、载药量及观察其体内超声显像效果.方法 采用机械振荡法制备载诺帝脂质微泡,测定其粒径大小、分布和Zeta电位、包封率、载药量;超声造影观察其在兔肝内的显像效果.结果 载药脂质微泡的浓度为(2.53±0.52)×109个/ml,粒径为(2.61±0.32)μm,Zeta电位为+(17.52±2.04)mV;脂质微泡诺帝的包封率(27.1±2.01)%,载药量为(10.9±0.90)%;微泡经外周静脉注射后,兔肝可见良好、持续的增强显像效果.结论 采用机械振荡法可以成功制备携带诺帝的脂质微泡,微泡可以通过肺血管床,符合静脉注射要求,在家兔体内获得了良好的显像效果.     

不同部位前列腺癌超声造影增强程度的定量研究

目的 探讨前列腺癌经直肠超声造影增强程度与部位的相关性.方法 对150例前列腺癌可疑患者行经直肠超声造影检查,并运用时间-强度曲线分析软件对病灶增强的峰值强度(peak intensity,PI)进行定量测量,比较前列腺周缘区内侧、周缘区外侧及移行区的PI值差异.结果 150例患者中,前列腺癌96例,前列腺增生54例.前列腺癌组病灶PI值大于前列腺增生组[(9.88±3.76) dB对(8.74±4.52)dB,P＜0.01].前列腺周缘区内侧、周缘区外侧和移行区癌灶的PI值逐渐升高[(6.55±2.90)dB对(10.57±2.52)dB对(13.64±2.38) dB,P＜0.001].前列腺癌PI值和部位的相关系数为0.718(P＜0.001).以Gleason评分作为协变量,两者偏相关系数为0.720 (P＜0.001).结论 不同部位前列腺癌的增强强度存在差异,明确不同部位前列腺癌增强程度的差异有助于进一步提高超声造影对前列腺癌的诊断敏感性及特异性.     

术中超声造影评价脑胶质瘤病理分级及瘤周水肿

目的 探讨术中超声造影技术在评价脑胶质瘤病理分级及区分肿瘤、瘤周水肿脑组织与正常脑组织范围中的价值.方法 对80例脑胶质瘤患者的术中超声造影图像进行回顾性分析,观察肿瘤、瘤周水肿脑组织与正常脑组织的强化情况,定量分析不同部位造影参数.结果 正常脑组织呈等增强,高级别胶质瘤瘤体组织与瘤周水肿脑组织呈高增强,瘤体组织增强强度高于瘤周水肿脑组织;低级别胶质瘤瘤体组织呈高增强,但瘤周水肿脑组织增强强度与正常脑组织相近.瘤体组织的绝对峰值强度高于瘤周水肿脑组织与正常脑组织,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);高级别胶质瘤瘤体组织的造影达峰时间早于瘤周水肿脑组织与正常脑组织,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);低级别胶质瘤瘤体组织造影达峰时间与瘤周水肿脑组织和正常脑组织比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 术中超声造影技术有助于切除肿瘤前判断胶质瘤病理级别及确定瘤周水肿脑组织的边界,有效指导临床手术.     

应用超声造影评估慢性肝炎患者肝纤维化分期的研究

目的 探索超声造影无创评估肝纤维化分期的可行性,并评价相关指标的诊断价值.方法 对86例慢性肝炎患者行肝超声造影,以肝穿刺活检作为金标准进行对照.取部分肝实质为感兴趣区,通过时间强度曲线计算门静脉-肝动脉曲线下面积比(Qp/Qa)、门静脉-肝动脉灌注强度比(Ip/Ia)、肝实质灌注下降速率(β)和门静脉主干灌注时间(Tp).用单因素方差分析研究不同肝纤维化分期患者上述参数的变化,Spearman秩相关分析上述参数与肝纤维化分期的关系,ROC曲线分析各参数的诊断价值.结果 随着肝纤维化程度增加,Tp、β逐渐增加,Ip/Ia和Qp/Qa逐渐减少,各组间差异有统计学意义(P＜0.05),且上述参数与肝纤维化分期显著相关(P＜0.05).分期为≥S1,≥S2,≥S3,S4时Ip/Ia的ROC曲线下面积分别为0.931,0.884,0.820,0.846.分期为≥S1,≥S2,≥S3,S4时Qp/Qa的ROC曲线下面积分别为0.914,0.813,0.845,0.869.结论 根据肝实质超声造影时间强度曲线计算的参数Tp、Ip/Ia、Qp/Qa和β与肝纤维化分期相关,其中Ip/Ia和Qp/Qa可作为超声造影无创评估肝纤维化分期的新指标.     

超声造影评价肝纤维化的实验研究

目的 探讨超声造影评价大鼠肝纤维化的价值.方法 应用四氯化碳诱导大鼠肝纤维化,在反相脉冲谐波模式下,经尾静脉团注超声造影剂,记录造影剂到达肝动脉时间(hepatic artery arrival time,HAAT)、到达门静脉时间(portal vein arrival time,PVAT)、到达肝静脉时间(hepatic vein arrival time,HVAT),并与免疫组化结果进行相关性分析.结果 S0～S4期HAAT、PVAT两两比较差异无统计学意义;S3期、S4期HVAT较So～S2期缩短(P＜0.05).HVAT与C-Ⅳ、LN免疫组化染色阳性反应面积百分比呈负相关,相关系数分别为-0.680,-0.639.结论 超声造影对于评价肝纤维化有一定的价值.