转染丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对p53表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B对肝细胞内p53表达的影响,以及在肝癌发生中的作用与机制。方法设置空白对照组、空白载体组、转染NS4B组、转染p53组、共转染NS4B及p53组。使用脂质体介导转染法,转染丙型肝炎病毒非结构蛋白重组质粒PCXN2-NS4B及突变型p53基因重组质粒pC53-CX22AN3进入Chang肝细胞内,并用G418筛选获得稳定表达细胞。采用免疫细胞化学法检测p53表达率。结果空白对照组无p53表达,空白载体组及转染NS4B组呈弱阳性表达,转染p53组及共转染组呈阳性表达;转染p53组、共转染组分别与空白对照组、空白载体组及转染NS4B组比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 NS4B可能抑制p53表达,也可能阻止其进入细胞核,但NS4B与突变型p53关系不明确。NS4B导致肝细胞异常增生,诱导肝癌发生可能不依赖p53的异常表达及突变。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3对环加氧酶2表达的影响

目的探讨丙型肝炎病毒基因组产物对环加氧酶2(COX-2)表达的影响。方法将带有COX-2基因启动子的报告质粒分别与10种表达丙型肝炎病毒基因组的单个基因的质粒共转染Huh7细胞,并测定荧光色素酶的活性,采用反转录PCR和Western blot检测COX-2的mRNA和蛋白表达的变化,酶联免疫吸附试验检测前列腺素E2含量的改变,探讨这些丙型肝炎基因组产物与COX-2基因启动子之间的相互作用。结果在所有10个基因组产物中,非结构蛋白NS3能够显著地激活COX-2基因启动子的活性,并在mRNA和蛋白水平上调COX-2的表达。而且这种激活作用呈剂量依赖性,前列腺素E2的分泌量随着NS3蛋白表达量的增加而增加。结论 NS3蛋白能功能性地激活COX-2的表达。     

丙型肝炎病毒及其导致原发性肝细胞癌的研？…

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）与原发性肝细胞癌（ＨＣＣ）的关系已被越来越多的研究所证实,但ＨＣＶ导致ＨＣＣ的机理尚不清楚,本文从ＨＣＶ的结构、功能、ＨＣＶ与宿主免疫功能的相互作用以及ＨＣＶ对基因的调控功能等方面对几年ＨＣＶ及其与ＨＣＣ关系的研究作一综述。     

丙型肝炎病毒的结构,检测及献血者丙型肝炎病毒检测的意义

丙型肝炎病毒的检测自１９８９以来有了长足的发展，本文简述了丙型肝炎病毒基因的结构和功能，系统地介绍了丙型肝炎病毒检测手段的发展历程及各种检测方法的优点和局限性，并阐述了对健康献血者进行丙型肝炎病毒检测的意义。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白对QSG7701细胞survivin的影响

目的观察丙型肝炎病毒NS3蛋白对QSG7701细胞survivin的影响及其与细胞凋亡的关系,以探讨HCVNS3蛋白是否通过调节survivin的表达来参与对细胞凋亡的调控,进而参与HCV相关性肝癌的发生。方法采用Western blot、免疫细胞化学检测血清饥饿前后细胞survivin蛋白表达的变化,采用TUNEL法检测血清饥饿前后细胞凋亡的变化。结果HCVNS3蛋白促进QSG7701细胞survivin的表达,血清饥饿诱导凋亡后,survivin表达降低,HCV NS3蛋白亦表现出促进survivin表达的作用,效果呈浓度依赖性和时间依赖性。经血清饥饿诱导凋亡后,HCV NS3蛋白抑制凋亡。结论HCV NS3蛋白可能通过促进QSG7701细胞survivin的表达从而抑制细胞凋亡,对HCV相关性肝癌的形成有一定作用。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A与干扰素的应答耐受

丙型肝炎病毒是丙型病毒性肝炎的病原体，目前缺乏有效的疫苗，干扰素是其主要治疗药物，但普遍存在耐受。丙型肝炎病毒非结构蛋白5A在丙型肝炎病毒的干扰素耐受中发挥重要作用．涉及的可能机制包括：非结构蛋白5A干扰素敏感决定区变异、抑制双链核糖核酸依赖性蛋白激酶、抑制2’，5’-寡腺苷酸合成酶、诱生白介素培和作用于干扰素的蛋白酪氨酸激酶和转录激动子信号途径。     

乙型肝炎及丙型肝炎病毒对肝细胞癌临床病理特征及预后的影响

目的：探讨乙肝病毒及丙肝病毒感染对肝细胞癌的临床病理特征及预后的影响。方法：收集1995—2000年在复旦大学肝癌研究所行手术切除的355例肝细胞癌患者临床病理资料及术后随访资料。其中乙肝相关肝细胞癌163例（HBV组）,丙肝相关肝细胞癌73例（HCV组）,119例非病毒相关肝细胞癌作为对照组（NBNC组）,分析乙型肝炎病毒及丙型肝炎病毒对肝细胞癌的临床病理特征及预后的影响。结果：临床病理特征：乙肝相关肝细胞癌患者年龄轻,男性患者比例高,甲胎蛋白（AFP）均值高;丙肝相关肝细胞癌患者年龄最大,术前丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高伴白蛋白降低者比例高,体检发现的小肝癌居多,肿瘤分期相对较早;NBNC组患者由于无肝病背景,往往缺乏定期体检,多因出现临床症状就诊,故发现时以大肝癌为主,合并血管侵犯,肿瘤突破包膜者比例高。术后生存情况：HBV-HCC组患者中位生存期为15个月,1-,3-,5～7-年生存率分别为：71.0%,34.0%,30.7%和11.53%;HCV-HCC组中位生存期为19个月,1-,3-,5～7-年生存率分别为90.3%,68.2%,41.9%和31.41%。提示丙肝病毒相关肝细胞癌总体预后好于乙肝病毒相关肝细胞癌（χ2=10.92,P〈0.001）。多因素分析提示病毒感染类型是肝细胞癌预后的独立影响因素。相对于无病毒感染肝细胞癌患者而言,乙肝相关肝细胞癌术后死亡的风险是前者的1.5倍（P=0.03）,而丙肝相关肝细胞癌术后死亡的风险是其0.85（P=0.58）。结论：乙肝病毒与丙肝病毒相关肝细胞癌的临床病理特征及预后有显著差异。丙肝相关肝细胞癌总体预后好于乙肝相关肝细胞癌。     

丙型肝炎病毒不同基因区的聚合酶链反应扩增

探讨提高聚合酶链反应对丙型肝炎病毒病毒血症的检出率和对变异较大区域的扩增效率的方法。方法 分别以ＨＣＶ基因组５‘端非编码区，非结构基因４区及ＮＳ５ｂ区的引物检测ＨＣＶ，并比较双退火温度与单一退火温度对ＨＣＶ基因扩增效率的影响。     

九江地区丙型肝炎病毒基因分型

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是引起输血后非甲非乙型肝炎的主要病原分子.HCV是小的有包膜的单股正链RNA病毒,属黄病毒科丙型肝炎病毒属,颗粒大致呈球形,直径约50nm,基因全长约9400个核苷酸.     

102例丙型肝炎病毒基因分型结果分析

目的分析了解萍乡地区慢性丙型肝炎患者的丙型肝炎病毒(HCV)基因分型情况,为HCV诊断和治疗提供有力的依据。方法利用门诊及住院患者血清HCV抗体阳性标本,经荧光定量PCR检测HCVRNA阳性的102例标本用基因芯片进行不同基因分型检测。结果检测HCV感染标本102例,共检出7种基因亚型,分别为1b、6型、2a、1b+2a、1b+3a、3a和3b,其中1b占72.6%,6型占8.8%,2a占7.8%,1b+2a占5.9%,1b+3a占2.9%,3a占1.0%,3b占1.0%。结论萍乡地区HCV基因型主要为1b与中国南方地区HCV基因型分布比较一致。按照年龄分组20岁以下4例,占3.9%,20～30岁33例,占32.4%,30～40岁39例,占38.2%,40～50岁11例,占10.8%,50～60岁4例,占3.9%,60岁以上11例,占10.8%。青壮年和有吸毒史、外伤手术史、输注血液制品史的人群阳性率较高。     

人胰腺细胞cDNA 文库中丙型肝炎病毒NS4B 结合蛋白基因的筛选

目的 从人胰腺细胞cDNA 文库中,采用酵母双杂交方法 筛选HCV NS4B 包膜蛋白的相互作用蛋白.方法 人胰腺细胞cDNA 文库先进行扩增,随后纯化及鉴定,然后将鉴定好的人胰腺细胞cDNA 文库质粒转化入酵母菌株Y187.构建pGBKT7-NS4B 作为诱饵质粒,随之转化酵母菌株AH109,用色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)筛选阳性菌落.配合两种重组酵母菌株AH109 与Y187,用四缺培养基及X-α-gal 筛选蓝色酵母菌落,提取相应质粒,电转化感受态菌DH5α后再提取质粒,测序仪测序,结果 使用PUBMED 进行序列比对.结果 成功构建pGBKT7-HCV NS4B 重组质粒,并从人胰腺cDNA 文库中筛选出7 种与HCV NS4B 蛋白相结合的蛋白基因,包括CDK5RAP3、辅脂肪酶、胰石蛋白、凝乳蛋白、弹性蛋白酶2A、糜蛋白酶和胆盐刺激酯酶.结论 HCV NS4B 蛋白可能通过与所筛选出前述蛋白中参与代谢过程的相关蛋白结合,影响糖、脂类代谢过程.     

WT1基因转染增加白血病细胞凋亡的实验研究

为了探讨WT1基因异构体对急性早幼粒细胞性白血病细胞株NB4凋亡的影响及其分子机制,应用电穿孔的方法将携带WT1基因异构体WTA（-17AA/-KTS）全长cDNA的真核表达载体及其对照质粒pCB6^＋转导白血病细胞株NB4,建立WT1基因异构体表达比例改变的单克隆细胞株;用MTT、形态学观察、DNA凝胶电泳、An-nexin V结合力测定等方法观察WT1基因异构体表达比例的转变对白血病细胞NB4诱导凋亡的影响;用RT-PCR方法检测细胞中p21、p53、bcl-2、bcl-XL、和c-myc等凋亡相关基因表达的改变.研究结果表明,MTT显示NB4/WTA细胞对As2O3的IC50值较对照组明显降低;经As2O3作用48小时,NB4/WTA细胞Annexin V结合力较对照组细胞升高,出现更为典型的凋亡形态学改变;在DNA凝胶电泳可见更为明显的DNA梯形条带,RT-PCR检测提示NB4/WTA细胞p21、c-myc基因的表达较对照组高,bcl-2表达下降,p53、bcl-XL基因表达无明显改变.结论：增加外源性WT1基因异构体WTA的表达从而将WT1基因异构体表达的比例由＋17AA/＋KTS优势型转变为-17AA/-KTS优势型,能使NB4细胞对As2O3引起的凋亡更为敏感,这些改变可能与p21、c-myc等基因的表达上调和bcl-2基因的表达下调有关.     

对丙型肝炎病毒核酸稳定性的研究

目的探讨常规采血过程、标本采集及保存方式对HCV RNA稳定性的影响。方法采集HCV RNA阳性献血者的血样,以不同的抗凝剂、经不同的温度和时间保存后,采用荧光定量PCR方法测定HCV RNA病毒载量,考察HCV RNA的稳定性。结果不同抗凝剂下抗凝全血于4℃保存48h,HCV病毒载量未见显著降低（P〉0.05）;不同温度保存全血中,37℃组保存48h病毒载量显著降低（下降0.56Log）;不同温度保存的血浆样品中,25℃保存7d,病毒载量出现显著降低（下降0.60Log）;经反复冻融4次,血浆中病毒载量未见显著降低（P〉0.05）。结论HCV较为稳定,常规血液采集、运输、实验室处理和保存等方式对其稳定性影响不大。     

乙肝免疫球蛋白阻断乙肝病毒母婴垂直传播的临床观察

目的探讨用乙肝免疫球蛋白阻断乙肝病毒母婴垂直传播感染的临床疗效。方法将100例血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性的孕妇随机分为两组:乙肝免疫球蛋白(HBIG)组50例,分别在孕28、32、36周各肌肉注射乙肝免疫球蛋白200IU一次;对照组50例,未予用药。分娩后采集两组新生儿脐血,分离血清,用酶联免疫吸附(ELISA)法和荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测乙肝表面抗原HBsAg、乙肝e抗原(HBeAg)。结果乙肝免疫球蛋白(HBIG)组和对照组宫内感染率分别为10%、23.7%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论对乙肝表面抗原HBsAg阳性的孕妇产前多次肌内注射HBIG可以有效降低HBV宫内感染率。     

CIK细胞与HBsAg疫苗联合作用对于转基因乙型肝炎小鼠的影响

目的观察细胞因子激活的杀伤细胞（cytokine induced kill cell, CIK ）与乙型肝炎表面抗原 （Hepatitis B surface antigen, HBsAg ）疫苗联合应用对于乙型肝炎病毒转基因小鼠 （ Hepatitis B virus transgenic mice, HBV-Tg）的治疗作用。方法给予HBV-Tg小鼠腹腔注射CIK细胞及皮下注射HBsAg疫苗,观察外用血中HBVDNA水平变化,流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群改变,并用HE染色观察肝脏的组织病理改变。结果给予HBV-Tg小鼠CIK细胞治疗后,其外周血中HBVDNA载量减少,CD3^＋、CD4^＋及CD8^＋细胞增加,CIK细胞与HBsAg疫苗联合作用后,该作用明显加强。结论应用CIK细胞与HBsAg疫苗作用于慢性乙型肝炎小鼠后,两者可协同作用降低外周血中的病毒含量,并增强免疫作用。     

转染mFas配体的COS-7细胞诱导Fas+淋巴瘤细胞系(Yac-1)凋亡

本研究探讨通过Fas配体(Fas ligand,FasL)-Fas途径进行免疫治疗淋巴瘤的可能性。常规转化pBillneo-mFasL至大肠杆菌DH5α,经扩增、质粒抽提和纯化后,进行限制性内切酶酶切、mFasL基因PCR及其产物DNA测序,以鉴定pBillneo-mFasL内mFasL基因一级结构及插入方向;用脂质体法转染 pBillneo-mFasL至猴肾COS-7细胞,G418选择培养后,Western印迹分析外源性mFasL cDNA基因表达水平,将高表达mFasL的COS-7细胞与Fas~+小鼠淋巴瘤细胞系Yac-1以不同比例混合培养,5小时后收集悬浮的Yac-1细胞,用膜联蛋白(annexin)V/PI标记后,借助FCM观察细胞调亡率。结果表明,质粒pBillneo-mFasL的EcoRI酶切获得920 bp和7227 bp产物,Hind Ⅲ酶切获得1293 bp和6807 bp产物,初步证实插入mFasL cDNA片段与理论预计大小一致,并系正向插入;PCR扩增出自起始密码子(ATG)至终止密码子(TAA)后+36 bp的mFasL cDNA全长890 bp序列,DNA测序结果与基因库已知序列完全一致;pBillneo-mFasL转染COS-7细胞,并经G418选择培养后,Western印迹检测到明显mFasL蛋白质表达;当用这种高表达mFasL蛋白质的COS 7细胞与Fas~+ Yac-1细胞以1:1,5:1和10:1混合培养5小时后,用annexin V/PI标记悬浮Yac-1,结果后者调亡率分别为(22±4.8)％,(32.18±7.8)％和(51.8±5.4)％,与     

乙型肝炎病毒聚合酶基因变异检测及临床应用

目的：检测乙型肝炎病毒聚合酶基因变异并探讨其与拉米夫定疗效的关系。方法：对38例拉米夫定治疗（100mg/d)48w后血清HBV DNA阳性患者，采用聚合酶链反应（PCR）产物直接测序技术，检测其血清中HBV DNA P基因序列，并推导为相对应的氨基酸序列，同时和Genbank中标准株序列相比较。结果：G473→R和D477→N变异14例，M550→I变异12例，M550→V变异8例，L526→M变异10例，M550→V变异均伴有L526→M变异2例，M550→I变异伴有L526→M变异，未曾发现L526→M单独变异株，另外发现N（D）480→E2例，N（D）480→S2例，R485→H1例，S505→T2例，L510→M1例，V537→11例，有11例HBV DNA阳性标本未检出变异。结论：乙型肝炎病毒P基因区YMDD变异和L526→M变异是影响拉米夫定疗效的主要因素，G473→R和D477→N联合变异可能是影响拉米夫定疗效的又一重要原因，P基因变异的检测有助于临床疗效观察。