胎鼠表皮干细胞的体外分离培养及rAAV2/eGFP转染的研究

目的 对表皮干细胞(ESCs)进行分离培养和鉴定,利用携带绿色荧光蛋白(eGFP)基因的重组腺相关病毒(rAAV)转染表皮干细胞,探索不同滴度rAAV2/eGFP的转染效率.方法 1.获取胎鼠表皮单细胞悬液.2.利用层黏连蛋白(laminin)和Ⅳ型胶原(Collagen Ⅳ)筛选ESCs,在体外进行培养和鉴定.3.将ESCs按5×104个/孔接种入24孔培养板中,按照不同的病毒基因数与转染细胞数之比(MOI)加入所需rAAV2/eGFP病毒,计数绿色荧光细胞数目,并计算转染效率. 结果 1.ESCs对Laminin和Collagen Ⅳ的吸附性很好,克隆形成率较高.2.对ESCs进行β1整合素(Integrinβ1)单抗、角蛋白19(Keration 19,K19)单抗的免疫细胞化学染色,均呈阳性表达.3.利用rAAV1eGFP病毒体外转染ESCs,可稳定表达eGFP.结论 用Laminin和Collagen Ⅳ快速黏附法可从胎鼠皮肤分离和富集ESCs.     

用于IDDM基因治疗的rAAV2-GAD-Ig的研制

目的: 构建重组真核表达载体pSNAV- GAD -Ig[GAD- Ig融合基因是由小鼠GAD(glutamicaciddecarboxylase)基因插入到小鼠IgG3重链(Ig)基因的N端而成的 ], 制备含GAD- Ig融合基因cDNA的重组缺陷型腺相关病毒 -2 (rAAV2- GAD -Ig), 并探讨rAAV2所介导的GAD- Ig是否能诱导I型糖尿病(IDDM)动物模型 NOD(nonobesediabetic)小鼠产生特异性免疫耐受。方法: 从含GAD- Ig融合基因的中介载体BSSK(BSSK- GAD- Ig)中, 用PCR方法扩增目的基因片段, 并克隆入真核表达载体pSNAV中, 构建重组真核表达载体pSNAV- GAD Ig。以脂质体法将pSNAV GAD -Ig转染到rAAV2包装细胞BHK -21中, 产生rAAV2 -GAD- Ig。采用R-T PCR、Westernblot和ELISA法, 检测rAAV2- GAD -Ig感染的BHK- 21细胞中目的基因的表达。应用GAD抗原体外诱导特异性T细胞的二次应答, 来检测rAAV2所介导的GAD -Ig是否能诱导NOD小鼠产生特异性免疫耐受。结果: GAD- Ig目的基因已整合到靶细胞的基因组中, 并能以分泌形式表达目的蛋白GAD- Ig。将rAAV2 GAD- Ig肌注后, NOD小鼠能产生特异性免疫耐受。结论: 获得了可用于NOD小鼠治疗研究的rAAV2 GAD- Ig。     

Ad5-增强型绿色荧光蛋白和rAAV2-增强型绿色荧光蛋白转染脂肪间充质干细胞的对比

背景:利用基因转染技术诱导脂肪间充质干细胞成软骨细胞已有报道,但腺病毒和腺相关病毒转染脂肪间充质干细胞各有不同,且腺相关病毒载体能否转染脂肪间充质干细胞众说不一。目的:观察Ad5-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和rAAV2-EGFP转染脂肪间充质干细胞后增强型绿色荧光蛋白的表达及转染后细胞增殖能力的变化。方法:脂肪组织来源于6月龄新西兰大白兔颈背部。机械消化和酶消化法分离提取脂肪间充质干细胞,体外培养扩增。分别采用腺病毒载体(Ad5-EGFP)和腺相关病毒载体(rAAV2-EGFP)转染脂肪间充质干细胞,并观察EGFP的表达。rAAV2-EGFP转染后,需加入2μL丁酸钠(1mol/L)。采用MTT法检测基因转染对脂肪间充质干细胞增殖能力的影响。结果与结论:体外培养的脂肪间充质干细胞呈扁平状和长梭形,细胞形态均一,传代稳定。Ad5-EGFP组和rAAV2-EGFP组均能观察到较多荧光细胞,转染效率分别达到88%和83%。腺病毒和腺相关病毒载体均能转染脂肪间充质干细胞,且转染效率很高。腺相关病毒需要借助丁酸钠来提高其基因表达水平。     

重组9型腺相关病毒载体转染小鼠心脏及对心功能的影响

目的 探讨重组9型腺相关病毒(recombinant adeno-associated serotype 9,rAAV9)载体对小鼠心脏的转染效果及对心功能的影响.方法 16只昆明种小鼠经尾静脉将携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)报告基因的rAAV9(rAAV9-eGFP)转染入小鼠,于7、14、21、28 d留取标本,使用荧光显微镜观察eGFP在心肌、肝、肺、肾、脑、骨骼肌的荧光表达,Western blot法检测eGFP)的蛋白表达.另20只昆明种小鼠随机分为2组,每组10只,分别经尾静脉注射rAAV9-eGFP)和生理盐水,28 d后行心脏超声及血流动力学检查.结果 rAAV9-eGFP经尾静脉注射21 d时eGFP表达在心脏达到高峰,转染效率可达32%,在其他脏器表达量少或无表达.rAAV9-eGFP组较生理盐水组心功能差异无统计学意义(P＞0.05).结论 rAAV9可通过外周静脉注射在心脏较高表达,且对心功能无不良影响.     

rAAV2-EM>hGAD/EM>65重组载体的构建和功能检测

目的 构建rAAV2-hGAD65重组载体,观察其体内外功能。方法 应用RT-PCR的方法克隆hGAD65基因,与AAV载体连接得到重组载体(rAAV2-hGAD65)。包装重组腺相关病毒并检测病毒的滴度。体外感染成纤维细胞后,用免疫组织化学的方法检测GAD65在细胞中的表达水平,用高效液相色谱(HPLC)法检测培养上清中γ氨基丁酸(GABA)的含量。在体实验中,向丘脑底核(STN)立体定位注射rAAV2-hGAD65后,用HPLC方法检测黑质网状部(SNr)中的GABA含量。结果 应用RT-PCR方法成功地从人胚胎端脑组织中克隆出GAD65基因的cDNA,基因测序显示与基因库中人GAD65基因序列一致,亚克隆入AAV载体并包装后所得的病毒颗粒的滴度达到4.5×10¹¹/ml。组织化学检测感染大鼠肺成纤维细胞的效率约为80%,HPLC检测培养上清中GABA的含量为(45.66±6.07)nmol/L。STN立体注射rAAV2-hGAD65后,在STN可以检测到hGAD65的表达,SNr区GABA的含量由原来的(5.66±1.07)nmol/g升高到(12.66±2.59)nmol/g。结论 成功地克隆出了人GAD65基因,并构建了AAV重组载体。AAV病毒颗粒在体外能感染成纤维细胞并具有催化谷氨酸合成GABA的功能。在体内实验中,向STN注射rAAV2-hGAD65后,可以增加黑质网状部(SNr)中的GABA含量。     

rAAV2／1载体介导 EGFP 对大鼠骶髓转染的实验研究

以重组腺相关病毒载体（recombinant adeno -associated virus,rAAV）携带增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因转染入大鼠骶髓,观察其定位及表达情况,评价其作为骶髓病变基因治疗载体的可行性。SD 大鼠经膀胱肌层多点注射 rAAV2/1-EGFP,分别按转染复数1×109、1×1010、4×1010转染。分别在2周、4周、8周后,将大鼠深麻醉,经左心室-升主动脉插管4％多聚甲醛灌注固定,慢慢剥离出脊髓,将脊髓放入含30％蔗糖的 PBS 中过夜（4℃）,然后恒温冰冻切片机内连续切片,厚度12μm,免疫荧光染色（GFP 抗体,FITC 标记山羊抗兔 IgG）后,在荧光显微镜下观察 EGFP 表达情况。荧光显微镜下显示,4周时,转染复数为4×1010的大鼠骶髓神经元表达强荧光,可见增强型绿色荧光蛋白弥散表达。rAAV2/1载体可将 EGFP 基因有效地转染入大鼠骶髓,rAAV2/1载体是一种理想的基因治疗载体,为rAAV2/1作为载体转染骶髓治疗神经源性疾病提供理论依据。     

重组病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD的构建及其表达

目的构建含有大鼠源性锰超氧化物歧化酶(MnSOD)基因的重组病毒rAAV2-IRES-EGFP/Mn-SOD,检测其在大鼠耳血管纹边缘细胞和耳蜗组织内的表达。方法将大鼠心肌组织来源的SOD基因克隆入融合表达载体pEGFP-N1中,再以限制性酶切方法克隆入真核表达载体pSNAV2.0-IRES-EGFP中,最后将其包装为rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD病毒颗粒,用激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、RT-PCR及Western印迹检测MnSOD基因的表达。结果真核表达载体pEGFP-N1/MnSOD和pSNAV2.0-IRES-EGFP/MnSOD经酶切、PCR和测序鉴定均检测到MnSOD基因的完整序列,被rAAV2-EGFP/MnSOD感染的耳边缘细胞和内耳组织中MnSOD蛋白的表达均高于空白对照耳。结论成功构建了大鼠源性MnSOD基因的重组病毒rAAV2-IRES-EGFP/MnSOD,并使其在大鼠耳边缘细胞和大鼠耳蜗组织中成功表达,为抗氧化基因治疗内耳疾病的研究奠定了基础。     

血小板源性生长因子B基因转染抑制缺血缺氧诱导心肌细胞凋亡

背景:血小板源性生长因子B(platelet-derived growth factor-B,PDGF-B)是一种有效的促血管生长因子,9型腺相关病毒(adeno-associated virus serotype,rAAV9)对心肌细胞具有良好的靶向亲和力,是目前缺血性心脏疾病基因治疗的理想载体。目的:探索rAAV9介导PDGF-B基因(rAAV9-PDGF-B)体外转染乳鼠心肌细胞,抵抗缺血缺氧诱导心肌细胞凋亡的作用。方法:分离培养原代乳鼠心肌细胞,分别将感染复数为1×105,1×106及1×107 MOI携带rAAV9-PDGF-B基因的重组9型腺相关病毒及空病毒(rAAV9-eGFP)转染乳鼠心肌细胞,逐日在荧光显微镜下观察eGFP的阳性表达,采用流式细胞仪测定rAAV9载体的转染效率,Western blot和免疫荧光鉴定PDGF-B蛋白表达情况;并于rAAV9-eGFP及rAAV9-PDGF-B(107感染复数)转染第5天时,建立体外心肌细胞缺血缺氧损伤模型,通过TUNEL法检测心肌细胞凋亡数目,Western Blot检测Bax及Caspase-3凋亡相关蛋白的表达,研究PDGF-B基因过表达抗心肌细胞凋亡的作用及可能机制。结果与结论:rAAV9载体可有效转染乳鼠心肌细胞,eGFP和PDGF-B蛋白可在心肌细胞中高效正确表达,其表达强度随着转染时间和转染复数的增加而逐渐增强,第5天趋于稳定,此时各组转染率相比差异均有显著性意义(P0.01)。rAAV9-PDGF-B组心肌细胞凋亡率低于rAAV9-eGFP组(P0.05),且rAAV9-PDGF-B组凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3的表达与rAAV9-eGFP组比均显著下调(P0.05)。结果表明,PDGF-B基因过表达可有效减轻缺血缺氧诱导的心肌细胞凋亡,其机制通过抑制Bax和Caspase-3蛋白表达而发挥作用,为rAAV9-PDGF-B载体用于缺血性心脏疾病的基因治疗提供依据。     

rAAV2-hGAD65重组载体的构建和功能检测

目的构建rAAV2-hGAD65重组载体,观察其体内外功能。方法应用RT-PCR的方法克隆hGAD65基因,与AAV载体连接得到重组载体(rAAV2-hGAD65)。包装重组腺相关病毒并检测病毒的滴度。体外感染成纤维细胞后,用免疫组织化学的方法检测GAD65在细胞中的表达水平,用高效液相色谱(HPLC)法检测培养上清中γ-氨基丁酸(GABA)的含量。在体实验中,向丘脑底核(STN)立体定位注射rAAV2-hGAD65后,用HPLC方法检测黑质网状部(SNr)中的GABA含量。结果应用RT-PCR方法成功地从人胚胎端脑组织中克隆出GAD65基因的cDNA,基因测序显示与基因库中人GAD65基因序列一致,亚克隆入AAV载体并包装后所得的病毒颗粒的滴度达到4.5×1011/ml。组织化学检测感染大鼠肺成纤维细胞的效率约为80%,HPLC检测培养上清中GABA的含量为(45.66±6.07)nmol/L。STN立体注射rAAV2-hGAD65后,在STN可以检测到hGAD65的表达,SNr区GABA的含量由原来的(5.66±1.07)nmol/g升高到(12.66±2.59)nmol/g。结论成功地克隆出了人GAD65基因,并构建了AAV重组载体。AAV病毒颗粒在体外能感染成纤维细胞并具有催化谷氨酸合成GABA的功能。在体内实验中,向STN注射rAAV2-hGAD65后,可以增加黑质网状部(SNr)中的GABA含量。     

TG2基因修饰的鼻粘膜间充质干细胞向神经样细胞分化的研究

目的:研究重组transglutaminase 2(TG2)腺病毒转染对鼻粘膜骨髓间充质干细胞(EMSCs)向神经样细胞分化影响。方法:利用贴壁筛选法分离培养和扩增EMSCs,通过免疫荧光方法分析EMSCs的纯度,采用免疫荧光和免疫印迹方法测定转染效率。实验分组:重组TG2腺病毒转染EMSCs(ad EMSCs)组、重组GFP腺病毒转染EMSCs组(GFP-EMSCs)和空白对照组(control),诱导细胞向神经样细胞分化,倒置显微镜观察分化过程中细胞形态的变化。免疫荧光和免疫印迹方法检测诱导后EMSCs的轴突膜蛋白(GAP-43),微管相关蛋白(MAP2)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)的表达情况。向大鼠脊髓内注射ad EMSCs,2周后取脊髓。结果:实验数据表明转染TG2腺病毒的EMSCs可稳定表达TG2。诱导7 d后,ad EMSCs组细胞呈现双极和多极的典型神经样细胞形态,并且GAP-43,MAP2和MBP的表达水平较对照组高。移植入体内2周的ad EMSCs存活良好且部分细胞表达GAP-43。结论:TG2基因修饰有利于EMSCs在体外向神经样细胞分化,并且具有良好的可移植性。     

9型腺相关病毒介导RNA干扰抑制p65基因表达对血管紧张素Ⅱ诱导H9c2细胞凋亡的影响

目的:以9型腺相关病毒(AAV9)介导的RNA干扰抑制大鼠心室肌H9c2细胞中p65基因表达,研究其在血管紧张素II(Ang II)诱导下对H9c2细胞凋亡的影响,并阐明其可能机制。方法:分别将r AAV9-eGFP及r AAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA按转染复数(MOI)=4×106vg/cell转染至H9c2细胞,在荧光倒置显微镜下观察e GFP的阳性表达情况,采用流式细胞术检测其转染效率,并用Western blot法分析p65的表达情况。CCK-8法检测病毒对H9c2细胞活力的影响。流式细胞术分析各组细胞的凋亡情况。结果:病毒转染48 h后e GFP开始有表达,并且表达强度随着时间延长而增加,第5天达最高值,此时流式细胞术检测转染率为(52. 7±1. 9)%。与空白组相比,转染病毒后H9c2细胞的活力无明显变化。静息状态下H9c2细胞的NF-κB p65有一定活性,给予Ang II刺激后NF-κB p65的活性明显增高,而转染r AAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA可有效抑制NF-κB p65的活性。流式细胞术检测发现Ang II刺激组的凋亡程度明显高于空白组,而r AAV9-eGFP-NF-κB p65-siRNA组的细胞凋亡明显受到抑制。结论:通过r AAV9介导的RNA干扰能有效抑制H9c2细胞NF-κB p65基因的表达;抑制p65基因表达对H9c2细胞活力无明显抑制,但能减少Ang II诱导下的细胞凋亡。     

重组色素上皮衍生因子对人视网膜微血管内皮细胞迁移及凋亡的影响

目的: 构建rAAV2-PEDF腺相关病毒,研究色素上皮衍生因子(PEDF)基因高表达对人视网膜微血管内皮细胞的作用。方法: 将PEDF基因克隆、重组到腺相关病毒载体pSNAV,得到的pSNAV-PEDF后转染BHK细胞,用含G418的培养基进行筛选,得到稳定转染pSNAV-PEDF的生产细胞系,用重组1型单纯疱疹病毒HSV1-rc/△UL2感染细胞进行病毒包装,纯化后得到高滴度rAAV2-PEDF 病毒颗粒。按照10⁵v.g./cell的剂量进行rAAV2-PEDF病毒转染,分别设空白和阴性对照,激光共聚焦显微镜下观察GFP阳性细胞,Western blotting检测PEDF蛋白表达。Boyden小室法观察细胞迁移情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果: 通过PCR、酶切及基因测序的方法,证实rAAV2-PEDF构建成功。转染病毒48 h后,激光共聚焦显微镜下观察可见GFP阳性细胞,Western blotting检测,实验组PEDF表达明显强于其它组。rAAV2-PEDF干预正常氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,正常对照组凋亡细胞比例为2.10%±0.53%,rAAV2-GFP组为3.40%±0.62%,rAAV2-PEDF组为1.60%±0.47%,各组间无显著差异(P＞0.05)。rAAV2-PEDF干预低氧条件下人视网膜微血管内皮细胞,单纯CoCl₂组凋亡细胞比例为4.00%±0.55%,CoCl₂+rAAV2-GFP组为6.10%±0.71%,CoCl₂+rAAV2-PEDF组为40.00%±2.10%。rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。细胞迁移计数显示,正常对照组为33.0±2.7,rAAV2-GFP组为35.0±3.6,rAAV2-PEDF组为12.0±2.1,rAAV2-PEDF组与其它2组相比,有显著差异(P<0.05)。结论: 成功构建了rAAV2-PEDF,转染人视网膜血管内皮细胞后PEDF可稳定表达。PEDF高表达可显著抑制人视网膜微血管内皮细胞迁移并可在低氧条件下诱导其凋亡。     

转化生长因子β3基因转染兔骨髓间充质干细胞诱导其向软骨表型的分化

背景：内源性诱导软骨分为就是通过一定的载体将目的基因整合入干细胞内,使其自行分泌诱导因子诱导自身进行分化。 目的：观察将转化生长因子β3通过腺相关病毒载体转染诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨表型转化的能力。 方法：取体外培养的第3代骨髓间充质干细胞进行重组腺相关病毒转染,将转染后3,6,9,12 d细胞裂解提取蛋白进行酶联免疫检测目的蛋白转化生长因子β3的体外表达。RT-PCR,免疫印迹western blot分别从基因和蛋白水平上检测1,2周Ⅱ型胶原的表达,甲苯胺蓝染色检测1,2周蛋白多糖的表达。 结果与结论：重组腺相关病毒转染后,骨髓间充质干细胞可以较稳定的表达目的蛋白转化生长因子β3,并且转染成功的骨髓间充质干细胞较阴性对照组能够更好的向软骨表型转化。证实转化生长因子β3可以腺相关病毒为载体转染骨髓间充质干细胞并诱导其向软骨表型分化。     

More than chemotaxis: a new anti-tumor DC vaccine modified by rAAV2-SLC

Secondary lymphoid tissue chemokine (SLC) is strongly expressed in secondary lymphoid organs. Its ability to facilitate chemotaxis of both dendritic cells (DC) and T cells makes it a promising candidate for cancer therapy. In this study, we modified a BMDC vaccine by incorporating the SLC mature peptide gene. The efficacy of this vaccine was evaluated using a mouse hepatocellular carcinoma (HCC) model, with rAAV2 as the gene delivery vector. The rAAV2 encoding SLC (rAAV2-SLC) transfected immature BMDCs at high efficiency and the anti-tumor effects of SLC gene modified BMDCs (rAAV2-SLC/BMDC) were evaluated. In addition, rAAV2-SLC/BMDC vaccine injected directly into tumors attracted more CD4(+) and CD8(+) T lymphocytes into tumors and showed stronger anti-tumor effects than footpad delivery. Moreover, we found that the phenotypic expression of MHC II, the secretion of IL-12 and IFN-gamma, and T cell stimulation were increased in vitro following treatment with rAAV2-SLC/BMDC vaccine and these responses were inhibited by PTX. In vivo, PTX also inhibited the anti-tumor effects of the vaccine. The results suggest that the expression of SLC by rAAV2-SLC/BMDC plays more than a chemotactic role in anti-tumor responses, thus these studies further demonstrate that SLC has potential to be valuable in cancer therapy.     

rAAV2-NTF2对糖尿病大鼠血视网膜屏障的保护作用

目的： 观察2型重组腺相关病毒－核运输因子2（rAAV2-NTF2）对糖尿病大鼠血视网膜屏障功能损伤的拮抗作用。方法: 伊凡思蓝（EB）灌注铺片观察糖尿病大鼠视网膜血管分布和形态。亚克隆构建pSNAV－NTF2载体, 腺相关病毒包装形成rAAV2-NTF2。成年雄性Wistar大鼠,以右眼为实验眼,玻璃体腔注射4 μL rAAV2-NTF2,左眼为对照眼,玻璃体腔注射rAAV2-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）4 μL。1个月后取4只大鼠左眼,固定后取视网膜制备全视网膜铺片,荧光显微镜下观察EGFP表达情况。再行STZ腹腔注射诱导糖尿病,同时设单纯糖尿病组（diabetes,D组）和正常组（normal,N组）。糖尿病1个月后以45 mg/kg剂量静脉注射EB,循环2 h后1%多聚甲醛枸橼酸缓冲液灌注并摘除眼球取视网膜,置于甲酰胺中浸泡提取染料,用分光光度计测量甲酰胺中染料的浓度。结果: 正常组大鼠可见在低背景荧光下视网膜血管对EB有很好的屏障作用,糖尿病2周大鼠视网膜血管仅见背景荧光增强,糖尿病1月后血管出现异常节段性扩张,局部血管周围EB渗漏。糖尿病1个月大鼠视网膜内EB浓度是正常组的4.67倍,P<0.01,提示糖尿病大鼠血-视网膜屏障受损。玻璃体腔注射rAAV2-NTF2,视网膜内EB浓度为(8.30±4.16)μg/g视网膜干重,较对侧眼(22.13±8.43)μg/g视网膜干重明显减少,可以部分改善血-视网膜屏障的破坏,降低EB-白蛋白渗漏（P<0.05）。结论: 玻璃体腔注射rAAV2-NTF2可减轻糖尿病大鼠视网膜血-视网膜屏障功能的破坏,为糖尿病视网膜病变的基因治疗提供了实验依据。     

带有HBV基因的腺相关病毒为载体的重组病毒感染树突状细胞的研究

目的探讨腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）为载体的含有HBV—S、C或X基因的重组病毒（rAAV—HBV—S，C，X）感染正常人树突状细胞的效率。方法分别构建含有HBV-S、C和x基因的从v质粒，在293细胞中包装成重组病毒，测定病毒滴度。从正常人外周血中分离出单核细胞进行体外培养，在培养的第1天分别用rAAV—HBV—S、C、X和作为对照的293细胞裂解液感染刺激单核细胞，感染后的单核细胞在GM-CSF、IL-4和TNF-α作用下继续培养7d获得成熟的树突状细胞。用RT-PCR及流式细胞仪细胞内染色检测HBV基因的RNA和蛋白的表达。结果重组rAAV—HBV—S、C、X的病毒滴度可以达到10^7拷贝／ml，用重组病毒分别感染树突状细胞。与对照组相比，感染的树突状细胞可表达相应的HBV基因RNA，流式细胞仪检测显示约90％的树突状细胞有相应HBV蛋白的表达。结论rAAV-HBV可有效感染树突状细胞，提示可以通过该途径刺激树突状细胞提呈抗原。