人LAK细胞抗菌杀菌活性多肽HLP—2b的分离纯化

目的：分离纯化人LAK细胞小分子抗菌多肽，并检测其抗肿瘤细胞株K562活性。方法：采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，并用IL-2和PHA刺激培养。5%乙酸匀浆细胞获得其酸溶性提取物。应用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和反相高效液相色谱技术分离纯化多肽，Tricine-SDS-PAGE鉴定其分子量，并运用琼脂糖弥散法，MTT法鉴定其抗菌、抗肿瘤活性。结果：从人LAK细胞酸溶性提取物中纯化出一多肽，分子量为7.8kD，命名为HLP-2b，具有抗金黄色葡萄球菌活性和抗肿瘤细胞株K562活性。结论：HLP-2b可能为LAK细胞一新的抗菌抗瘤效应分子。     

刺激人γδ+T细胞增殖的结核杆菌多肽抗原的纯化与活性鉴定

目的：纯化可刺激人γδ^ T细胞增殖的结核杆菌耐热多肽抗原。方法：采用快速蛋白液相色谱仪（FPLC）S-100分子筛层析柱，对结核杆菌耐热抗原（Mtb-Ag)初步分离，将获得的结核杆菌耐热Mr低的多肽抗原（Mtb-LW-Ag)洗脱峰，分别再经FPLCMonoQ离子交换层析柱进一步纯化，并且采用流式细胞仪对获得的Mtb-LW-Ag进行刺激γδ^ T细胞增殖活性的测定。结果：Mtb-Ag经FPLCS-100柱可分离出1个大分子蛋白峰A和3个Mr低的多肽峰（B，C，D），Mr低的多肽峰分别糨MonoQ柱层析，鉴定出B峰含有6个主峰，C峰含有1个主峰，D峰含有8个主峰，对Mtb-LW-Ag及其纯化多肽进行活性检测，发现多肽峰B和C以及纯化多肽B-Ⅲ和C-主肽均可显著刺激γδ^ T细胞扩增。结论：利用FPLC法可快速高效地从Mtb-Ag中纯化出多种Mr低的多肽，而且其中的B-Ⅲ多肽的C-主肽可能是促进γδ^ T细胞活化增殖的主要多肽。     

蛋白酶体活性测定与组分分析方法的建立

背景:26S蛋白酶体对维持细胞周期、增殖、生存等细胞生物学行为的正常具有极其重要的作用,但目前对细胞体内蛋白酶体活性的测定及组分分析缺少明确的方法。目的:建立蛋白酶体活性与组分的分析方法,用以检测肿瘤组织、细胞蛋白酶体的活性状态与组分表达情况。方法:应用3种特异性的荧光多肽底物Suc-LLVY-AMC、Z-ARR-AMC和Z-LLE-AMC建立对蛋白酶体的糜蛋白酶样、胰蛋白酶样和肽基谷氨酰肽水解酶样蛋白酶活性的测定方法。并基于蛋白酶体特异亲和性探针AdaK(Bio)Ahx3L3VS建立对蛋白酶体各亚基(包括β1/β1i,β2/β2i,β5/β5i)组分分析的方法。结果与结论:利用特异性的荧光多肽底物检测蛋白酶活性及蛋白酶体特异亲和性探针检测蛋白酶体亚基组分分析的方法发现在K562红白血病细胞,β2、β5亚基表达较高,而蛋白酶体抑制剂PS341及PSI对K562细胞的蛋白酶体活性与组分的抑制作用主要是靶定在β5和β5i亚基,抑制其糜蛋白酶样活性。实验建立了对以上3种蛋白酶体活性测定及组分分析的方法,为蛋白酶体抑制剂的体外活性鉴定提供了实验方法。     

人LAK细胞抗菌杀瘤活性多肽HLP-2b的分离纯化

目的 :分离纯化人LAK细胞小分子抗菌多肽 ,并检测其抗肿瘤细胞株K5 6 2活性。方法 :采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞 ,并用IL 2和PHA刺激培养。 5 %乙酸匀浆细胞获得其酸溶性提取物。应用制备性酸性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术和反相高效液相色谱技术分离纯化多肽 ,Tricine SDS PAGE鉴定其分子量 ,并运用琼脂糖弥散法、MTT法鉴定其抗菌、抗肿瘤活性。结果 :从人LAK细胞酸溶性提取物中纯化出一多肽 ,分子量为 7 9kD ,命名为HLP 2b ,具有抗金黄色葡萄球菌活性和抗肿瘤细胞株K5 6 2活性。结论 :HLP 2b可能为LAK细胞一新的抗菌抗瘤效应分子。     

针刺诱导家蝇幼虫抗菌物质的动态观察

目的观察家蝇幼虫经针刺损伤并感染金黄色葡萄球菌后,家蝇幼虫抗菌物质的动态表达效果。方法室内饲养的家蝇3龄幼虫,经针刺损伤感染金黄色葡萄球菌后,分别于第0、12、24、36、48、60小时记录幼虫存活率,并提取其血淋巴,以溶壁微球菌和金黄色葡萄球菌作指示菌,采用平板法做抑菌试验,37℃恒温24 h观察抑菌圈,并以抑菌圈直径表示抗菌活力的大小,取诱导后高峰时间产生的抗菌物质进行抑菌实验,探讨家蝇抗菌物质诱导产生的规律。结果针刺损伤感染金黄色葡萄球菌后,家蝇幼虫存活率逐渐降低,提取的血淋巴对溶壁微球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活力峰均出现在诱导后48 h。结论针刺损伤感染金黄色葡萄球菌处理法可诱导家蝇产生抗菌物质,在诱导后48 h收集血淋巴最为适宜。     

WT1多肽致敏树突状细胞诱导杀伤K562细胞实验研究

目的：研究来自健康人外周血单个核细胞的树突状细胞（DC）负载WT1多肽抗原，体外诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对K562细胞的杀伤作用。 方法： 应用重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4（rhIL-4）、重组人肿瘤坏死因子α（TNF-α）等细胞因子，自外周血单个核细胞诱导扩增，培养出DC，使DC负载WT1多肽抗原。实验分3组，WT1多肽致敏DC为实验组A，未致敏DC为实验组B，单纯自体淋巴细胞未加DC激活为对照组C，观察CTL对K562细胞的杀伤作用。 结果： 培养出具有典型特征的DC，体外能诱导强烈的同种异体混合淋巴细胞增殖反应。在效靶比为20∶1时，实验组A诱导的CTL对K562细胞的杀伤率为86.1%±26.8%；实验组B为47.1%±20.8%；对照组C为27.7%±15.3% (P＜0.05)。 结论： WT1多肽抗原致敏DC能促使CD8阳性淋巴细胞扩增，并诱导激活特异性CTL，对K562靶细胞具有明显的杀伤作用。     

液-质联用分析肝癌细胞HLA-A2类分子递呈的抗原肽

目的：寻找MHCI类分子递呈的、T淋巴细胞识别的肝癌抗原肽。方法：人肝癌细胞系hHCC以枸橼酸－磷酸盐（pH3.3)液洗脱,洗脱物经粗分离,得到相对分子质量（Mr)＜5000的各种多肽组分混合液;取各组分多肽分离液分别与抗原加工缺陷细胞（T2,HLA－A2）进行细胞表位重建,加入特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL),^51Cr释放法测杀伤活性;选活性值高的抗原肽组分进行反相高效液相色谱－质谱（RP－HPLC－MS）检测,对活性峰手工读谱分析其一级结构;最后进行氨基酸同源性分析。结果：酸洗10^10hHCC细胞,样品蛋白质浓度2mg/ml;通过RP－HPLC－MS检测,其质谱图经手工解析,氨基酸序列为SXXVHXNEV,X＝1或L;氨基酸同源性分析证明SXXVHXNEV为SLIVHLNEV,是肝细胞生长因子受体的第1075－1083肽段,第1080位点发生突变,由F变为L,由HLA－A2分子递呈。结论：细胞膜温和酸洗技术结合RP－HPLC－MS联用技术,是寻找肝癌抗原肽的有效方法,尚未见相同研究报道。发现的肝癌抗原肽SLIVHLNEV是肝细胞生长因子受体的突变物,可能具有重要生物学意义。     

不同肿瘤细胞表面MICA的表达及NK细胞杀伤活性的研究

目的：观察不同肿瘤细胞表面MICA的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响。方法：以体外培养的K562（人慢性髓原白血病细胞株）、MCF-7（乳腺癌细胞株）、HR-8348（直肠腺癌细胞株）、CNE-2（人鼻咽癌细胞株）、Hela（人宫颈癌细胞株）为靶细胞，流式细胞仪检测细胞表面MICA的表达，以K562细胞作为对照，应用LDH释放法检测不同效靶比情况下体外培养的NK细胞对靶细胞的杀伤活性。结果：K562、MCF-7、HR-8348、CNE-2、Hela细胞表面均表达MICA，体外杀伤试验表明NK细胞对上述肿瘤细胞均有杀伤活性，anti-MICA单抗可部分封闭NK细胞对靶细胞的杀伤活性。结论：NK细胞对K562、MCF-7、HR-8348、CNE-2、Hela细胞具有较高的杀伤活性，可作为一种生物治疗手段。     

苦瓜蛋白诱导K562细胞凋亡及其对Bcl-2、PCNA蛋白表达的影响

目的：观察苦瓜蛋白是否具有诱导K562细胞凋亡的生物学活性，探讨苦瓜蛋白对K562细胞Bcl-2及PCNA表达水平的影响及其作用的分子机制。方法：以一定浓度的苦瓜蛋白处理K562细胞12～72小时，CCK-8检测其对细胞生长的影响；流式细胞术（AnnexinV）、细胞形态学（光镜及电镜）等方法检测细胞凋亡；同时应用流式细胞术检测Bcl-2及PCNA蛋白表达的变化。结果：苦瓜蛋白对K562细胞生长具有明显的抑制作用；流式细胞术及形态学观察（光镜及电镜）证实一定作用浓度的苦瓜蛋白可诱导K562细胞发生明显的细胞凋亡，且随着作用时间的延长细胞凋亡率逐渐升高。苦瓜蛋白处理组K562细胞中Bcl-2及PCNA蛋白的表达分别为0．33％和98．36％，对照组分别为74．03％和97．63％。结论：苦瓜蛋白对K562细胞生长具有明显抑制作用，其作用主要通过诱导K562细胞产生细胞凋亡．而不是抑制细胞增殖。苦瓜蛋白诱导K562细胞凋亡过程中，Bcl-2蛋白表达的下调对调控细胞凋亡有重要作用。     

胎牛骨髓多肽对小鼠和人巨噬细胞及NK活性的影响

以特定工艺从胎牛骨髓中提取分离到一种多肽类物质，用吞饮中性红试验表明，该物质能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞（Ｍφ）吞噬功能。进而用人全血化学发光仪测定，发现正常人外周血细胞与该物质共温后，血中吞噬细胞吞噬细菌后的化学发光峰高明显高于对照组，峰时明显缩短。此外用１２５Ｉ－ＵｄＲ释放法也表明该物质对ＮＫ细胞具有活化作用。从而提示胎牛骨髓多肽物质对机体免疫功能具有促进作用。     

Impaired neonatal natural killer-cell activity to herpes simplex virus: Decreased inhibition of viral replication and altered response to lymphokines

Human adult natural killer (NK) cells were recently demonstrated to inhibit herpes simplex virus (HSV) replicationin vitro. In this study we compared the ability of newborn and adult NK cells to inhibit HSV replication. Cord blood mononuclear cells (MNCs) from healthy, term newborns and MNCs from adults were analyzed for their percentage of Leu-11⁺ cells and comparedin vitro for their NK-cell activity against HSV-infected fibroblasts and the tumor cell line K562. Cord blood MNCs, compared with adult MNCs, had significantly lower percentages of Leu-11⁺ cells (5 vs 11%;P<0.01), less anti-K562 NK activity (6 vs 54 lytic units/10⁷ cells;P<0.001), and less anti-HSV NK activity (5 vs 52% HSV plaque inhibition;P<0.02). Comparing individual neonates and adults with equal percentages of Leu-11⁺ cells, neonatal MNCs still had less NK activity against either target. When Leu-11⁺ MNCs were isolated using the fluorescence-activated cell sorter, neonatal Leu-11⁺ MNCs still inhibited HSV replication less than adult Leu-11⁺ MNCs (P<0.01). MNCs from some neonates had significant anti-K562 NK activity but poor anti-HSV NK activity, suggesting either nonidentical NK-cell subpopulations or specific suppression. Whereas neonatal NK activity against K562 was always augmented by prior exposure to either interferon (IFN) or interleukin-2 (IL-2), the neonatal NK activity against HSV-infected cells was only augmented for half of the neonates tested. Endogenous production of alpha-IFN and gamma-IFN by MNCs exposed to HSV-infected fibroblasts was the same for cells from neonates or from HSV-seronegative adults. More gamma-IFN was produced by MNCs from HSV-seropositive adults than from neonates or HSV-seronegative adults. These results suggest that although newborns have phenotypically identifiable NK cells and the capacity for IFN production, the ability of the NK cells to inhibit HSV replication is impaired, and their level of response and augmentation by specific lymphokines is target specific.     

脂多糖诱导家蝇胚胎细胞抗菌肽的初步研究

目的观察脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导家蝇胚胎细胞产生抗菌肽的抗菌活性。方法LPS诱导家蝇胚胎细胞系（MDEC-07114）,收集诱导后4、8、12、16、20、24h上清液,三氯醋酸提取抗菌肽,抑菌圈法测定抗菌活性。结果LPS作用处于对数生长的家蝇胚胎细胞后,细胞形态、增殖无明显变化：诱导后8h家蝇胚胎细胞开始产生抗菌肽,16h达高峰,诱导后24h仍有抗菌活性。结论LPS可诱导家蝇胚胎细胞系MDEC-07114产生具抗菌活性的抗菌肽。     

阿霉素对K562细胞凋亡及FAK mRNA的影响

目的探讨阿霉素体外作用于K562细胞后,观察其对细胞增殖的影响,促进细胞凋亡情况,以及调节细胞周期和粘着斑激酶（FAK）mRNA基因,进一步探讨通过调控FAK表达,研究抗白血病的作用机制。方法应用细胞增殖实验（CCK8法）观察不同浓度阿霉素作用不同时间对K562细胞增殖的影响,应用流式细胞仪观察不同浓度阿霉素对K562细胞细胞凋亡,细胞周期的影响,应用RT-PCR和Western blot技术检测不同浓度阿霉素作用对K562细胞36h后FAK mRNA以及蛋白表达水平的变化。结果随着阿霉素浓度增加及作用时间延长,K562细胞的增殖抑制率逐渐升高,同一时间不同浓度之间比较,或者同一浓度不同时间组之间比较,差异均有统计学意义（P〈0.05）;阿霉素能引起K562细胞凋亡,且随着药物浓度增加,凋亡率也逐渐增加,差异均有统计学意义（P〈0.05）;阿霉素能引起K562细胞周期阻滞,多停留在S期;阿霉素能引起K562细胞FAK mRNA表达显著降低。阿霉素能引起K562细胞FAK蛋白表达水平的降低。结论阿霉素抑制分裂期细胞的增殖,诱导细胞凋亡增加,对细胞FAK基因和蛋白水平均显著下调,为进一步研究FAK基因表达的调控与肿瘤细胞凋亡的分子机制提供了实验基础。     

川芎嗪与环孢菌素A联合应用对转基因多药耐药细胞K562/MDR的逆转作用

目的研究中药川芎嗪(TMP)与环孢菌素A(CsA)联合应用对转基因多药耐药细胞K562/MDR的耐药性逆转作用及可能机制。方法应用非细胞毒性剂量的TMP和CsA单独及联合作用于K562/S和K562/MDR细胞,MTT法检测细胞对阿霉素(ADM)的药敏性,计算耐药倍数及逆转倍数。利用罗丹明123(Rh123)进行蓄积与排出试验,免疫组化检测P-gp的表达,RT-PCR方法检测MDR1基因的表达。结果与K562/S细胞相比,K562/MDR细胞的耐药倍数为19.2倍;TMP及CsA可显著降低ADM对K562/MDR细胞的IC50(P0.01),逆转倍数分别为4.9倍及9.2倍,两者联合应用,逆转倍数为15.4倍。TMP及CsA单独应用均能降低K562/MDR细胞P-gp的表达,联合应用使K562/MDR细胞P-gp的表达率明显低于单独应用(P0.01);TMP和CsA单独及联合应用,MDR1基因表达均有不同程度的下调。结论 TMP和CsA联合逆转K562/MDR细胞的多药耐药性具有协同作用,其机制可能与下调MDR1基因表达和降低P-gp水平有关     

黄粉虫抗菌肽促K562细胞凋亡作用及其机制的研究

为观察黄粉虫抗菌肽对K562细胞线粒体膜电位及K562细胞凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的影响,进而探讨黄粉虫抗菌肽否是影响线粒体膜电位以及是否可以引起K562细胞凋亡,本文首先采用荧光探针罗丹明123 标记K562细胞,在激光扫描共聚焦显微镜下观察K562细胞中罗丹明123荧光强度,以细胞内荧光...     

贵州小型猪胃粘膜5-HT及生长抑素免疫反应细胞的定位及表达

目的观察贵州小型猪胃粘膜5-羟色胺（5-HT）、生长抑素（SS）免疫反应（IR）细胞的分布及形态特点。方法用免疫组织化学SABC法显示成年贵州小型猪胃粘膜5-HT-IR、SS-IR阳性细胞,观察其分布和形态,并对阳性细胞进行计数。结果成年贵州小型猪胃粘膜5-HT-IR、SS-IR阳性细胞呈锥形、圆形、卵圆形、梭形等多种形态,主要分布于胃腺的体部和底部,阳性细胞计数以胃窦粘膜最多,胃体次之,贲门处最少。结论贵州小型猪胃粘膜5-HT-IR、SS-IR阳性细胞形态多样,分布密度以胃窦粘膜最多,与大多哺乳动物消化道内分泌细胞的分布规律相似。     

呼吸机机械通气对兔气道黏蛋白表达的影响

目的 观察呼吸机机械通气对黏蛋白(MUCSAC)表达的影响,并对其机制进行初步探讨.方法 日本大耳兔随机分为对照组、机械通气1、3、6、12和24 h组以及2、5和10 cm H<,2>O呼气末正压(PEEP)组.取支气管肺泡灌洗液(BALF),用ELISA和RT-PCR法检测BALF中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介...     

联合应用硫化砷和α干扰素对K562细胞的作用

目的:研究联合应用硫化砷和α干扰素是否可以增强对K562细胞的作用.方法:采用PCR-ELISA法测定端粒酶活性;流式细胞仪分析细胞凋亡.IFN-α和硫化砷的终浓度分别均为10 000 u/mL和0.6 mg/L.结果:单独应用IFN-α或硫化砷8 d,可以诱导37.8%和37%的K562细胞出现凋亡;同时应用IFN-α和硫化砷8 d或先单独应用IFN-α 3 d,再单独应用硫化砷5 d,K562细胞的凋亡率分别为59.9%和60.37%;端粒酶活性的抑制,单用硫化砷为71.3%,联合用药分别为81.2%和78.8%.结论:联合应用IFN-α和硫化砷较单独用药相比,可以显著提高K562细胞的凋亡,抑制细胞端粒酶活性.提示IFN-α司能促进硫化砷诱导K562细胞凋亡.     

家蝇幼虫、蛹、成虫抗菌肽的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

目的分析家蝇幼虫、蛹、成虫的抗菌肽成分。方法通过针刺感染大肠杆菌诱导家蝇各虫态产生抗菌肽，再经研磨、离心等步骤提取这些抗菌肽，用改进的聚丙烯酰胺凝胶电泳使其分离。结果家蝇幼虫有7条带，成虫有5条，蛹只有4条。结论家蝇幼虫和成虫的抗菌肽种类较蛹的多，且有一些小分子肽段，可能与其较强的抗菌效果有关；家蝇蛹处于相对静止期，其电泳图中抗菌肽条带较少，无较小的条带，抗菌效果可能较幼虫和成虫的差。     

干式融化箱与水浴锅复苏细胞因子诱导的杀伤细胞的比较

目的对比干式融化箱与水浴锅复苏冻存细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）的效果。方法提取10份健康志愿者外周血单个核细胞分别诱导培养CIK细胞并冻存于一80℃冰箱。1个月后从每份CIK细胞中取出相同的两个冻存管,分别采用干式融化箱和水浴锅进行复苏。记录复苏时间,检测复苏后细胞存活率及对K562细胞的杀伤作用。结果干式融化箱较水浴锅复苏时间较长[（4．33±0．19）min、（2．47±0．30）rain],差异有统计学意义（P〈0．05）。但两种方法复苏的CIK细胞存活率[（89．55＋5．36）％、（89．86±4．63）％]和对K562细胞的杀伤活性[（44．76±9．53）％、（46．97±10．17）％]差异无统计学意义（P〉0．05）。结论干式融化箱可以代替水浴锅进行冻存CIK细胞复苏。