熊果酸对肺癌细胞A549自噬相关蛋白的影响

目的研究自噬在熊果酸抑制人肺癌A549细胞增殖中的作用及机制。方法应用CCK8法检测熊果酸对A549细胞增殖的影响;实时荧光定量PCR法检测自噬相关基因LC3、 Beclin-1及p62的表达情况;Western Blot检测自噬相关蛋白LC3、 Beclin-1及p62的表达情况。采用自噬抑制剂3-甲基腺嘌(3-MA)观察熊果酸对A549细胞增殖的抑制作用。结果熊果酸可以显著抑制人肺癌A549细胞的活力(P0.01)且随着熊果酸剂量增加,对细胞的生长抑制率显著上升。熊果酸可诱导A549细胞自噬发生,诱导自噬相关基因、蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1表达的增加;p62表达降低(P0.01);3MA使得自噬相关基因、蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1表达明显降低;p62表达明显增加(P0.01)。自噬抑制剂3-MA提高了熊果酸对A549细胞的抑制作用(P0.01)。结论熊果酸抑制A549细胞的增殖,可能通过调节LC3Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1及p62蛋白表达诱导细胞发生自噬。自噬抑制剂3-MA能够增强熊果酸抑制A549细胞的增殖抑制作用,有望为肺癌的临床治疗提供新的联合治疗方案。     

月华胶囊对耐多药结核分支杆菌感染自噬的影响

目的:以月华胶囊含药血清对耐多药结核分支杆菌感染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)进行干预,探讨其对耐多药结核分支杆菌感染巨噬细胞自噬的作用及其机制。方法:低温冷冻干燥法制备月华胶囊,大鼠按3.02 g·kg^-1灌胃给药7 d,制备月华胶囊含药血清。体外培养RAW264.7,耐多药结核分子杆菌。以细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)检测含药血清对RAW264.7的增殖能力并选定其有效浓度。细胞分为模型组(10%胎牛血清);月华胶囊含药血清组(10%月华胶囊);自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)+月华胶囊含药血清组(5 mg·L^-1的3-MA+10%月华胶囊含药血清);雷帕霉素(Rap)组(200 mg·L^-1的Rap+10%胎牛血清);正常组(10%胎牛血清)。除正常组外,各组细胞培养24 h后,按细胞-细菌1∶10感染4 h。透射电镜观察细胞自噬体的出现和形成;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中I型微管相关蛋白轻链3(LC-3Ⅰ),Ⅱ型微管相关蛋白轻链3/I型微管相关蛋白1轻链3(LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ),Beclin-1蛋白的表达;间接免疫荧光染色法观察细胞中LC3B荧光颗粒、斑点及亮度;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测细胞中LC3,Beclin-1 mRNA的表达。结果:与正常组比较,模型组细胞未见自噬体,细胞中LC-3Ⅱ,LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ,Beclin-1蛋白及LC3,Beclin-1 mRNA的相对表达量均无显著变化,细胞无荧光颗粒、斑点,无荧光亮度。与模型组比较,月华胶囊含药血清组及Rap组细胞,均可观察到自噬体的形成,细胞LC-3Ⅱ,LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ,Beclin-1蛋白及LC3,Beclin-1 mRNA的相对表达量值均明显升高(P<0.05),月华胶囊含药血清组细胞荧光颗粒和荧光斑点明显增多,Rap组细胞荧光颗粒和荧光斑点增多非常明显,荧光闪亮,可判定细胞荧光呈现为阳性;自噬抑制剂3-MA+月华胶囊含药血清组细胞未见自噬体,细胞中LC-3Ⅱ,LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ,Beclin-1蛋白及LC3,Beclin-1 mRNA的相对表达量值均无明显升高。结论:月华胶囊含药血清能使耐多药结核分支杆菌感染细胞产生自噬而发挥抗结核的免疫效应,其机制是通过调控自噬相关蛋白LC3,Beclin-1蛋白及其mRNA的表达水平,促使LC3-I趋向LC3-Ⅱ的转化加快而实现的。     

竹节参总皂苷对妊娠期高血压胎盘滋养细胞氧化应激损伤与过度自噬的影响

目的探讨竹节参总皂苷对妊娠期高血压疾病胎盘滋养细胞氧化应激反应与自噬的影响及作用机制。方法采用100μmol/L亚硝基左旋精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methylester,L-NAME)处理人胎盘滋养细胞株HTR-8/SV-neo 48 h,并给予竹节参总皂苷(20、40、80μg/mL)干预24 h,采用CCK-8法检测各组细胞活力;采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;采用试剂盒检测各组细胞上清液中丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽(glutataione,GSH)水平;采用qRT-PCR和Western blotting法检测各组细胞脂肪酸结合蛋白4(fatty acid binding protein4,FABP4)m RNA和蛋白表达情况;采用Westernblotting法检测各组细胞微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3 Ⅱ,LC3-Ⅱ)、LC3-Ⅰ、p62和自噬效应蛋白(Beclin-1)表达情况;采用免疫荧光法检测各组细胞LC3表达情况。结果与模型组比较,竹节参总皂苷组细胞活力显著升高(P0.05),细胞凋亡率显著降低(P0.01);上清液中SOD和GSH水平显著升高(P0.01),MDA水平显著降低(P0.01);FABP4 m RNA和蛋白表达水平显著降低(P0.05);LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达水平显著降低(P0.05),p62蛋白表达水平显著升高(P0.05);LC3荧光染色强度降低。结论竹节参总皂苷能够改善妊娠期高血压疾病胎盘滋养细胞中的氧化应激反应,并抑制过度自噬,其机制可能与调控FABP4表达有关。     

苍膝通痹胶囊调控circRNA＿0008365/miR-1271/p38 MAPK通路轴促进膝骨关节炎软骨细胞自噬的机制研究

该研究旨在探讨苍膝通痹胶囊通过调控circRNA＿0008365/miR-1271/p38 MAPK通路轴促进软骨细胞自噬抑制膝骨关节炎(KOA)进展的机制。于体内、体外分别构建软骨细胞和大鼠的骨关节炎模型,分别给予苍膝通痹胶囊、circRNA＿0008365干扰、空载对照、以及苍膝通痹胶囊合用circRNA＿0008365干扰进行干预。应用流式细胞术观察细胞凋亡,透射电镜观察自噬小体,Western blot观察各组软骨细胞自噬指标微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)Ⅱ/Ⅰ、自噬效应蛋白-1(Beclin-1)、选择性自噬接头蛋白p62/sequestosome 1(selective autophagy junction protein p62/sequestosome 1,p62)、软骨细胞外基质代谢(collagenⅡ、ADAMTS-5)及p-p38 MAPK的蛋白表达,qRT-PCR观察各组软骨细胞circRNA＿0008365、miR-1271、collagenⅡ、ADAMTS-5的表达水平,...     

钩藤碱增强自噬改善TNF-α介导的血管内皮细胞血栓前状态的研究

目的基于细胞自噬探讨钩藤碱对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤时血栓前状态的影响。方法采用TNF-α诱导HUVECs制备损伤模型,透射电镜和免疫荧光技术观察HUVECs自噬水平的变化,Western blotting法检测自噬标记蛋白人微管相关蛋白轻链3II(LC3II)/LC3I、Beclin-1、p62和凝血相关因子核转录因子-κB(NF-κB)、血管假性血友病因子(v WF)和纤溶酶原活化物抑制剂-1(PAI-1)的蛋白表达水平,ELISA法检测细胞培养上清中前列环素(PGI2)和内皮素-1(ET-1)的量。结果 TNF-α上调了HUVECs中凝血相关因子NF-κB、v WF、PAI-1蛋白的表达水平,降低了细胞培养上清液中ET-1和PGI2的量(P0.05),使细胞中出现自噬小体,上调LC3II/LC3I、Beclin-1蛋白表达水平,下调p62蛋白表达水平(P0.05);钩藤碱能够促进HUVECs中自噬小体的产生,并在一定程度上调LC3II/LC3I、Beclin-1蛋白表达水平,下调p62蛋白表达水平(P0.05),下调凝血相关因子NF-κB、v WF、PAI-1蛋白的表达水平,上调细胞培养上清液中ET-1和PGI2的量(P0.05);自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)能够抑制钩藤碱的作用效果(P0.05)。结论钩藤碱能够通过增强自噬降低TNF-α介导的HUVECs细胞凝血相关因子的表达,抑制血管内皮炎性损伤时血栓前状态的发生。     

3-氢化松苓酸B诱导人胃癌HGC-27细胞的程序性死亡

目的研究3-氢化松苓酸B对人胃癌细胞HGC-27程序性死亡的影响。方法 MTT法测定细胞增殖。流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率。吖啶橙染色及透射电镜观察细胞自噬;Western blot法检测自噬相关蛋白的表达。结果 3-氢化松苓酸B对HGC-27细胞的增殖具有抑制作用,并呈明显的时间、剂量依赖性。10、20、40μmol/L 3-氢化松苓酸B处理HGC-27细胞24 h后,可将细胞阻滞于G0/G1期,但对细胞凋亡无明显影响。20μmol/L 3-氢化松苓酸B处理HGC-27细胞24 h后,透射电镜观察到大量自噬泡和自噬体,细胞自噬比例随浓度增加而显著提高;3-氢化松苓酸B促进I型微管相关蛋白1轻链3(LC3 I)向II型微管相关蛋白1轻链3(LC3 II)转化,上调肌球蛋白样B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)结合蛋白(Beclin-1)和细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21)的表达,并抑制G1/S-特异性周期蛋白-D1(Cyclin D1)的表达。结论 3-氢化松苓酸B可诱导HGC-27细胞发生自噬性死亡,但是对细胞凋亡无明显影响。     

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路的三七总皂苷调控自噬抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制研究

目的探讨三七总皂苷(PNS)能否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬从而减轻H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制。方法将H9c2细胞分为正常组、缺氧/复氧(A/R)组、A/R+PNS组、A/R+PNS+雷帕霉素(Rapa)组、A/R+Rapa组、A/R+羟氯喹(HCQ)组、A/R+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组。通过缺氧6 h、复氧2 h建立H9c2细胞A/R模型。CCK-8法检测细胞存活率,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测细胞损伤,Western blot检测自噬相关蛋白Atg5、p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、Akt、m TOR的表达,荧光法观察细胞自噬流。结果与正常组比较,A/R组H9c2细胞存活率明显下降,细胞损伤率明显升高(P0.05),自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高(P0.05),自噬体和自噬溶酶体数量显著增加,自噬流显著增强(P0.05);与A/R组比较,用PNS预处理后,H9c2细胞存活率明显上升,细胞损伤率明显降低(P0.05),自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低(P0.05),p62蛋白表达明显升高,与自噬抑制剂HCQ、3-MA作用相似,荧光结果显示,PNS对自噬流有明显抑制作用(P0.05);PNS预处理后p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显升高(P0.05)。结论 PNS能有效减轻H9c2细胞A/R损伤,其机制与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路从而抑制自噬流相关。     

人参三七川芎提取物对高糖高脂诱导的衰老血管内皮细胞自噬的影响

目的观察人参三七川芎提取物对血管内皮细胞自噬流的影响,探讨其延缓高糖高脂诱导血管内皮细胞衰老的作用机制。方法采用40 mmol/L葡萄糖和100μmol/L棕榈酸钠造模,实验分为空白对照组、衰老模型组和中药组(200 mg/L),干预48 h。采用CCK-8检测细胞增殖能力;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老程度;Western blot检测细胞p16、p21、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)和p62蛋白表达;免疫荧光检测自噬流变化。结果与空白对照组比较,衰老模型组细胞增殖能力和LC3B-Ⅱ表达降低,β-半乳糖苷酶蓝染细胞数量和p16、p21、p62蛋白表达增加,并存在自噬流阻滞;与衰老模型组比较,中药组细胞增殖能力增强,LC3B-Ⅱ表达升高,β-半乳糖苷酶蓝染细胞数量减少,p16、p21和p62表达降低,自噬流畅通。结论人参三七川芎提取物可延缓高糖高脂引起的血管内皮细胞衰老,其机制可能与增强细胞自噬活性有关。     

竹节参总皂苷调节大鼠海马区自噬减轻脑缺血再灌注损伤

目的探讨竹节参总皂苷对脑缺血再灌注损伤大鼠海马组织中自噬的影响。方法 40只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、竹节参总皂苷低剂量组(50 mg/kg)、竹节参总皂苷高剂量组(100 mg/kg)。提前连续给药7 d。末次给药30 min后,采用线栓法制备大脑中动脉闭塞模型使大鼠缺血1.5 h,再灌注24 h后进行神经功能评分。TTC染色检测脑梗死范围百分比,电镜观察自噬小体,Western blot检测海马组织中微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬底物蛋白p62的蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组大鼠神经功能评分和脑梗死范围百分比增加(P0.01),自噬小体增多,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ增加(P0.01),p62表达下调(P0.01)。与模型组比较,竹节参各组大鼠的神经功能损伤明显改善,脑梗死范围百分比减小(P0.01),自噬小体减少,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低(P0.01),p62表达上调(P0.01)。结论竹节参总皂苷可能通过抑制自噬的过度激活,从而减轻脑缺血再灌注损伤的发生。     

莪术醇诱导人骨肉瘤MG63细胞自噬的实验研究

目的观察莪术醇对人骨肉瘤MG-63细胞自噬性凋亡的作用。方法体外人骨肉瘤MG-63细胞单独或和莪术醇共同培养,MTT法检测莪术醇对骨肉瘤细胞系MG-63的增殖抑制作用;FITC-annexinⅤ/PI染色流式细胞术分析细胞凋亡;PI和hochest33258活细胞染色观察凋亡细胞核形态学变化;EGFP-LC3b细胞转染,荧光显微镜观察细胞自噬;微管相关蛋白1轻链3-β(LC3)蛋白和自噬相关蛋白Beclin-1表达水平用Western blotting方法分析。结果 MTT检测显示莪术醇可抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖,并具有浓度-时间依赖性;流式细胞术检测显示莪术醇可显著诱导MG-63细胞凋亡;活细胞荧光染色显示MG-63细胞核凝聚并碎裂成小体;细胞质内凝集荧光增强;LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白比值,Beclin-1蛋白表达明显增强;自噬抑制剂3-MA可明显逆转上述现象。结论莪术醇能明显抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖,其机制主要是通过诱导自噬性凋亡。     

姜黄素对人胃癌AGS细胞自噬流的作用

目的探讨姜黄素对人胃癌AGS细胞自噬流的作用。方法 5、10、20μmol/L浓度的姜黄素处理AGS细胞24 h,采用MTT法观察姜黄素对AGS胃癌细胞增殖的抑制作用,Western blot检测姜黄素对微管相关蛋白LC3和泛素相关蛋白SQSTM1/p62蛋白表达的影响。Western blot检测自噬抑制剂氯喹与姜黄素联合使用对LC3和SQSTM1/p62蛋白表达的影响。结果 MTT结果显示,姜黄素可以明显抑制AGS胃癌细胞的增殖,并且呈剂量依赖性(P0.05,P0.01)。Western blot结果显示,随着姜黄素浓度的增加,LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62蛋白的表达均呈剂量依赖地上调(P0.05,P0.01),提示姜黄素可以引起自噬体的堆积。自噬抑制剂氯喹与姜黄素联合使用可以增强LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62蛋白表达的上调,进一步验证了姜黄素对自噬流的抑制作用。结论姜黄素可能通过阻滞人AGS胃癌细胞自噬体降解,抑制AGS胃癌细胞的自噬流,促进AGS胃癌细胞的死亡。     

迷迭香酸抑制自噬诱导HepG2细胞凋亡的作用研究

目的:观察迷迭香酸(RA)对HepG2细胞凋亡和自噬的作用,探讨自噬与凋亡之间的相互作用。方法:用不同浓度迷迭香酸作用于HepG2细胞24h、48h、72h。MTT法检测细胞存活率,观察迷迭香酸对HepG2细胞核形态的影响,流式细胞术检测细胞凋亡变化,台盼蓝染色法观察细胞自噬泡情况,透射电镜观察HepG2细胞的自噬变化,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Bcl-2和自噬相关蛋白(LC3)、p62的表达水平。采用迷迭香酸+3-甲基腺嘌呤(3-MA,自噬抑制剂)或迷迭香酸+雷帕霉素(RAP,自噬诱导剂)分别培养处理HepG2细胞,观察细胞增殖、细胞凋亡情况及相关蛋白表达变化。结果:与对照组相比,迷迭香酸(6.25、12.5、25、50、100、200μmol/L)均能降低HepG2细胞的存活率,诱导HepG2细胞发生凋亡,具有量效和时效关系,减少细胞内自噬泡和自噬小体,降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值,减少Bcl-2的表达,增加Cleaved Caspase-3、p62蛋白的表达。与迷迭香酸25μmol/L处理组相比,迷迭香酸25μmol/L+3-MA 1.0μM/mL应用可诱导HepG2细胞凋亡增加,可进一步减少细胞内自噬泡和自噬小体数目,降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,进一步抑制HepG2细胞的自噬水平,减少Bcl-2的表达,增加Cleaved Caspase-3和p62表达;迷迭香酸25μmol/L+RAP 1.0μM/mL处理HepG2细胞,增加细胞内自噬泡和自噬小体数目,升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,可以抑制和逆转迷迭香酸诱导的细胞自噬水平下降,增加Bcl-2的表达,减少Cleaved Caspase-3和p62表达,细胞凋亡水平下降,这说明抑制或增强自噬时,迷迭香酸能改变对HepG2细胞的凋亡影响作用。结论:迷迭香酸可通过抑制自噬促进HepG2细胞的凋亡。     

芪蛭胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠自噬相关因子LC3、p62表达水平的影响

目的 通过研究益气活血通络中药芪蛭胶囊对脑缺血再灌注损伤大鼠自噬相关因子LC3、p62表达的影响，阐明该方拮抗脑缺血再灌注损伤的可能分子机制。方法 将大鼠随机分为sham组、I/R组、3-MA组、中药组。中药及3-MA抑制剂干预后，复制MCAO/R模型，再灌注24 h后进行神经功能评分；TTC染色评定脑梗死体积；免疫荧光、Western-Blot及电镜检测自噬发生水平、自噬相关蛋白表达水平、细胞损伤程度。结果 与I/R组相比，中药组大鼠神经功能损伤显著减轻，脑梗死体积显著缩小，LC3BⅡ/Ⅰ比值明显升高，p62蛋白表达量显著降低，中药组细胞形态及细胞器保留较完整，有较多自噬小体及自噬溶酶体出现。结论 芪蛭胶囊可有效缓解脑梗死及神经功能损伤，提高LC3,降低p62的表达，进一步激活细胞自噬，从而有效拮抗CIRI,保护神经元。     

香连丸对急性溃疡性结肠炎小鼠氧化应激介导的细胞自噬的影响研究

目的观察香连丸对急性溃疡性结肠炎大鼠氧化应激反应及其介导的细胞自噬的影响。方法 60只C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、香连丸低、中、高剂量组和美沙拉嗪组。除正常对照组外,余下各组大鼠均采用DSS的方法复制UC模型。分别观察各组大鼠结肠组织病理学形态,生化法检测氧化应激指标(MDA、SOD和GSH-px)的含量,Western blotting法检测自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ和p62)的表达。结果香连丸能够显著改善UC小鼠结肠组织形态,降低DAI及组织学损伤评分,与模型组比较差异均具有显著统计学意义(P 0.01);此外,香连丸还能显著下调结肠组织中MDA和LC3Ⅰ的表达,增加SOD及GSH-px的活性、Beclin-1、LC3Ⅱ、p62蛋白的表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值,与模型组比较差异均具有统计学意义(P 0.05和P 0.01)。结论香连丸可以明显降低氧化应激反应,促进细胞自噬,减轻肠道炎性损伤,促进组织修复。     

眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织自噬的影响

目的:观察眼针疗法对脑缺血再灌注损伤大鼠脑血流以及脑组织自噬的影响,探讨眼针对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织产生保护作用的机制。方法:将50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、眼针组、抑制剂组和增强剂组,每组10只。采用改良线栓法制备脑缺血再灌注损伤大鼠模型。眼针组大鼠在造模成功后0.5 h、12 h及24 h给予眼针干预30 min;抑制剂组和增强剂组大鼠在造模前30 min给予侧脑室注射自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和自噬诱导剂雷帕霉素,且抑制剂组和增强剂组给予同眼针组相同的眼针干预。在大鼠脑缺血再灌注后24 h用Longa评分法进行神经功能评分,用激光多普勒血流仪测量大鼠大脑皮层血流量和血流速度,用尼氏染色法观察缺血区脑组织神经元损伤情况,用Western blot法测定缺血区脑组织自噬相关蛋白Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62的表达。结果:与假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高(P<0.01);大脑皮层血流量和血流速度明显降低(P<0.01);缺血区脑组织尼氏小体数量减少(P<0.01);Beclin-1蛋白表达水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高,而p62表达水平降低(P<0.01)。与模型组比较,眼针组和抑制剂组大鼠神经功能缺损评分下降(P<0.01);大脑皮层血流量和血流速度均明显增加(P<0.01);缺血区脑组织尼氏小体的数量增多(P<0.01);Beclin-1蛋白表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显降低,p62的表达水平明显升高(P<0.01)。增强剂组与模型组比较,上述各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:眼针能够改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能,其机制可能与增加脑血流量,加快脑血流速度以及抑制缺血区脑组织自噬有关。     

柴胡皂甙d对特发性肺纤维化肺泡上皮细胞自噬作用机制研究北大核心CSCD

目的研究柴胡皂甙d(SSd)对特发性肺纤维化(IPF)中Ⅱ型肺泡上皮细胞(AT-Ⅱ)自噬的调控作用及其对纤维化程度的干预作用。方法转化生长因子β1(TGF-β1,5 ng/mL)诱导A549细胞48 h建立肺纤维化细胞模型,分别联合SSd低、中、高浓度(2.5、5、10μg/mL)、雷帕霉素(100 ng/mL)处理细胞。CCK8法检测各组细胞存活率,Western Blot法检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、Ⅰ型胶原蛋白(Col-Ⅰ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)/LC3B-Ⅰ、p62、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路活化蛋白表达水平,单丹磺酰尸胺(MDC)染色法检测细胞内自噬泡形成。结果与正常组比较,模型组细胞存活率下降(P<0.05),E-cadherin、Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表达水平亦降低(P<0.05,P<0.01),Col-Ⅰ、α-SMA、p62、mTOR通路活性蛋白表达水平升高(P<0.05,P<0.01),胞质内荧光标记的自噬泡较少。与模型组比较,SSd高浓度组细胞存活率升高(P<0.05),SSd组及雷帕霉素组E-cadherin、Beclin1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ蛋白表达水平升高(P<0.05,P<0.01),Col-Ⅰ、α-SMA、p62蛋白表达水平降低(P<0.05,P<0.01),SSd高浓度组及雷帕霉素组p-mTOR/mTOR、p-AKT1/AKT1、p-S6K1/S6K1表达水平降低(P<0.05,P<0.01),SSd高浓度组及雷帕霉素组细胞质内荧光标记的自噬泡增多。与SSd低、中低浓度组比较,SSd高浓度组及雷帕霉素组Ecadherin、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ表达水平升高(P<0.05,P<0.01),Col-Ⅰ、α-SMA、p62表达水平降低(P<0.05,P<0.01)。结论SSd可改善TGF-β1诱导的ATⅡ纤维化改变,可能通过抑制mTOR通路激活诱导细胞自噬发挥作用。     

人参多糖对D-半乳糖诱导的PC12细胞拟老化模型自噬和相关信号通路的影响

目的:探讨人参多糖对D-半乳糖(D-Gal)诱导的大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞衰老损伤后自噬和相关信号途径的影响。方法:将PC12细胞分为正常对照组、模型组、人参多糖组。除正常对照组外,其余各组用含20 mg/mL D-Gal的培养基损伤24 h;人参多糖组加入终浓度分别为65、75μg/mL人参多糖作用24 h。CCK-8法检测人参多糖对细胞活力的影响;β-半乳糖苷酶染色法检测细胞衰老;流式细胞仪检测细胞周期、活性氧(ROS)及线粒体膜电位(MMP);Seahorse代谢分析系统结合ATP生成量评估线粒体功能;免疫蛋白印迹法检测自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3B(LC3B-Ⅱ)、泛素结合蛋白P62(P62)]和自噬相关信号通路Parkin、PINK 1蛋白的表达。结果:与正常对照组比较,D-Gal可引起细胞衰老,表现为细胞活力降低,β-半乳糖苷酶阳性染色率增加,细胞周期G_1阻滞;与模型组比较,人参多糖75μg/mL组线粒体膜电位升高,活性氧降低,ATP及最大呼吸量升高(P0.05～P0.01);与模型组比较,人参多糖组自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表达水平上升,P62表达下降(P0.001),Parkin、PINK1蛋白的表达趋势与LC3Ⅱ/Ⅰ的结果一致(P0.05～P0.001)。结论:人参多糖可能通过影响PINK1/Parkin途径调控线粒体自噬,维系线粒体稳态改善D-Gal引起的PC12细胞衰老,保护受损细胞。     

RSV诱导树突细胞自噬对哮喘小鼠气道反应性的影响及五虎汤的干预作用

目的:探讨呼吸道合胞病毒诱导的树突细胞自噬对哮喘小鼠气道反应性的影响及五虎汤的干预作用。方法:160只SPF级雌性BALB/c小鼠,用呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)复合鸡卵蛋白(Ovalbumin,OVA)雾化吸入激发哮喘,造模成功后随机分为正常对照组、模型对照组、地塞米松1.8 mg/kg组、雷帕霉素1 mg/kg组及五虎汤6.4 g/kg、3.2 g/kg、1.6 g/kg组,并予以相应药物干预两周。使用动物呼吸机检测小鼠气道反应性值;HE染色法观察小鼠肺组织病理学改变;Masson和PAS染色法观察气道胶原沉积和粘液储备情况;Western Blot法测定α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型(microtubule-asso ciated protein 1 light chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ),程序性死亡受体-1(programmed cell death-1,Beclin-1)、自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3 I型(microtubule-asso ciated protein 1 light chain 3 I,LC3-I)蛋白水平;透射电镜检查肺组织自噬小体。结果:与正常对照组比较,模型对照组气道反应性显著增高(P0.01),支气管管腔狭窄,血管及支气管周围大量炎性细胞浸润,气道黏液储备指数和气道胶原沉积指数明显增高(P0.01),小鼠肺组织中α-SMA、TGF-β、LC3-Ⅱ/LC3-I、Beclin-1蛋白相对表达均显著升高(P0.01),DC自噬小体数量增加(P0.05);与模型对照组比较,五虎汤6.4 g/kg、3.2 g/kg、1.6 g/kg组及雷帕霉素1 mg/kg组小鼠气道反应性明显下降(P0.01),气道胶原沉积情况显著下降(P0.01),肺组织中α-SMA和TGF-β蛋白表达均显著下调(P0.01),五虎汤6.4 g/kg、3.2 g/kg剂量组及雷帕霉素1 mg/kg组肺组织树突细胞中自噬小体数量明显增多(P0.01),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达显著增高(P0.01)。结论:RSV感染可以应激性引起肺组织树突细胞自噬水平的上调,而树突细胞自噬水平的上调有利于促进机体的抗病毒反应,降低哮喘小鼠气道反应性;五虎汤对此的改善作用可能与其上调哮喘小鼠肺组织中树突细胞自噬水平有关。     

川陈皮素防治肝缺血再灌注损伤的作用机制研究

目的探究川陈皮素防治肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)的作用及机制。方法 SD大鼠随机分为对照组、模型组和川陈皮素(10 mg/kg)组,采用ELISA法检测各组大鼠血清中丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)活性;采用苏木素-伊红(HE)染色法考察各组大鼠肝组织病理变化;采用透射电子显微镜(TEM)观察各组大鼠肝细胞线粒体结构;采用Western blotting和qRT-PCR考察各组大鼠肝组织自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)、自噬相关基因-7 (autophagy-related gene-7,ATG-7)、p62蛋白和mRNA表达情况。采用H2O2诱导大鼠肝细胞BRL建立氧化损伤细胞模型,设置对照组、模型组和川陈皮素(10μmol/L)组,采用Western blotting和qRT-PCR考察各组细胞Beclinl、LC3-Ⅱ、ATG-7、p62蛋白和mRNA表达情况;采用MitoTracker染色和免疫荧光法考察各组细胞自噬蛋白与线粒体的共定位情况;考察自噬抑制剂和诱导剂对川陈皮素细胞保护作用的影响。结果与对照组比较,模型组大鼠血清ALT和AST活性均显著升高(P0.05),肝组织病变,肝细胞线粒体数目增加,结构错乱,受损的线粒体被吞噬,肝组织中LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.05),p62蛋白和mRNA表达水平显著降低(P0.05);与模型组比较,川陈皮素组大鼠血清ALT和AST活性明显降低(P0.05),肝组织病变程度减轻,线粒体形态变化得到明显改善,肝组织中LC3-Ⅱ、Beclinl、ATG-7蛋白和mRNA表达水平显著降低(P0.05),p62蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.05)。氧化损伤细胞模型中BRL细胞LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.05),p62蛋白和mRNA表达水平显著降低(P0.05),Beclin1和MitoTracker的共定位数目增加;与模型组比较,川陈皮素组BRL细胞中LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG-7蛋白和mRNA表达水平显著降低(P0.05),p62蛋白和mRNA表达水平显著升高(P0.05),Beclin1和MitoTracker的共定位数目减少;自噬抑制剂3-MA (1、5 mmol/L)显著增强川陈皮素对BRL细胞的保护作用(P0.05),自噬诱导剂雷帕霉素显著抑制川陈皮素对BRL细胞Beclin1蛋白和mRNA表达水平的下调作用(P0.05)。结论川陈皮素对HIRI具有较好的防治作用,其机制可能与抑制线粒体自噬有关。     

电针对失神经骨骼肌萎缩大鼠自噬相关因子的影响

目的探讨电针对失神经骨骼肌萎缩大鼠自噬相关因子的影响。方法健康SD大鼠30只随机分为假手术组、模型组、电针组,每组10只。采用暴露并切断坐骨神经的方法制备失神经骨骼肌萎缩大鼠模型,假手术组只暴露坐骨神经不离断神经。造模后第2天,电针组电针术侧足三里、承山两穴,每日1次,每次10 min;其余两组只固定,不作处理,连续干预21 d。测定术侧腓肠肌湿重比,HE染色观察腓肠肌组织病理变化,Masson染色观察腓肠肌纤维变化,Western blot检测腓肠肌组织p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白表达,q RT-PCR检测腓肠肌组织Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3ⅠmRNA表达。结果与假手术组比较,模型组腓肠肌湿重比明显下降,腓肠肌组织内部肌纤维严重萎缩变形,p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白和Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3ⅠmRNA水平明显升高(P0.05);与模型组比较,电针组的腓肠肌湿重比明显升高,腓肠肌萎缩较模型组明显减轻,电针组可明显降低Beclin-1蛋白和Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3ⅠmRNA水平(P0.05)。结论电针干预能下调失神经骨骼肌萎缩大鼠腓肠肌中Beclin-1、Vps34、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达,提示电针可能通过抑制细胞自噬的激活,稳定细胞内环境,延缓肌萎缩的进程。