频谱照射对受损视网膜节细胞的早期保护作用

目的：观察频谱照射对受损中枢神经元自我保护及修复机制的激发和增强作用，使受损的神经元在早期启动自我保护及修复机能，为进一步促进受损中枢神经元存活和纤维再生创造有利的条件。 方法：实验于2004-09／2005-03在北京大学医学部神经解剖实验室完成。选取成年雄性SD大鼠36只，实验中动物随机分成2组：①正常对照组（n=4）：动物不造模，取正常视网膜。②实验组（n=32）：再随机分成2组，手术损伤组，即实施视神经轴索切断术（n=16）；照射治疗组（n=16），建立中枢神经损伤模型（视神经轴索切断术），外加频谱治疗仪照射（术后30min，将实验动物置于周林频谱下，保持照射源与动物之间的距离在30cm，照射30min，连续照射3d）。于实验开始后的7，14，21，28d，取视网膜，制作冰冻切片，Nissl染色观察视网膜节细胞形态和存活数量的变化，用免疫组织化学染色的方法观察节细胞层中热休克蛋白27的表达程度。 结果：实验组32只SD大鼠进入结果分析。①视网膜节细胞层Nissl染色的形态学改变：与手术损伤组相比，照射治疗组细胞排列的较整齐，发生中晚期溃变的细胞比例较小。②视网膜节细胞计数：照射治疗组各时间点细胞计数均高于手术损伤组[7d：（600&;#177;25．40，480&;#177;22．65）；14d：（468&;#177;12．73，324&;#177;12．19）；2ld：（236&;#177;9．15，192&;#177;8．23）；28d：（120&;#177;9．57，104&;#177;5．62）,P〈0．01]。③热休克蛋白27在视网膜节细胞层的分布：各时间点照射治疗组热休克蛋白27的表达（用平均吸光度表示）均强于手术损伤组[7d：（127．179&;#177;8．127，93．799&;#177;4．80）；14d：（117．291&;#177;9．575，80．157&;#177;2.904）；21d：（100.589&;#177;8．275，70．847&;#177;5.052）；28d：（102.078&;#177;31．283，63．669&;#177;2．523），P〈0．01]，并且能观察到清晰的树突野。热休克蛋白27在节细胞层分布的变化趋势与视网膜节细胞存活率的变化趋势近似。 结论：形态学结果表明频谱照射可使具有保护作用的热休克蛋白27表达上调，受损细胞存活数量增加，激发并增强了受损中枢神经的自我保护及修复作用，将为进一步治疗做准备。     

甲基强的松龙对嗅鞘细胞移植治疗受损视网膜神经节细胞的早期保护效应

目的:观察注射甲基强的松龙对嗅鞘细胞移植治疗受损视网膜节细胞的早期保护作用。方法:实验于2005-09/2006-09在北京大学医学部神经解剖实验室完成。实验动物分组:成年雄性SD大白鼠55只随机取出7只为正常对照组,不进行任何实验处理;其余48只为实验组,在手术显微镜下经动物的左侧眶上缘暴露视神经,然后将视神经鞘顺向划开,在距眼球后壁2mm处将视神经剪断。将实验组动物随机分成4组,每组12只:①损伤组。②静脉注射甲基强的松龙组,动物实施术后30min给予一次性尾静脉注射甲基强的松龙注射液(90mg/kg)。③嗅鞘细胞移植组,动物术后移植嗅鞘细胞组织层。④给药后嗅鞘细胞移植组,动物术后30min给予一次性尾静脉注射甲基强的松龙注射液(90mg/kg),然后移植嗅鞘细胞组织层。术后21d麻醉下处死各组大鼠。实验评估:通过视神经逆行荧光标记和蛋白免疫印迹方法观察视网膜神经节细胞存活状况以及热休克蛋白27表达情况。结果:55只SD大鼠均进入结果分析。①视网膜神经节细胞的存活数量:甲基强的松龙静脉注射组高于损伤组[(16.525±9.557),(9.889±5.585)个/视野,P<0.1],给药后嗅鞘细胞移植组明显高于甲基强的松龙静脉注射组和嗅鞘细胞移植组[(28.881±13.660),(16.525±9.557),(13.513±6.840)个/视野,P<0.1,<0.01]。②各组视网膜神经节细胞热休克蛋白27的表达:甲基强的松龙静脉注射组高于损伤组,给药后嗅鞘细胞移植组明显高于甲基强的松龙静脉注射组和嗅鞘细胞移植组。结论:早期注射甲基强的松龙使受损视网膜神经节细胞存活率升高,并使热休克蛋白27表达上调,同时亦表现出了对移植嗅鞘细胞移植治疗受损视网膜神经节细胞的显著保护效应。     

热休克蛋白27对人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用及其机制

目的:观察热休克预处理诱导的热休克蛋白27对晶状体上皮细胞的保护作用。方法:实验于2004-01/12在中国医科大学卫生部小儿先天畸形重点实验室完成。体外培养人晶状体上皮细胞系HLB-C3细胞,随机分为4组:①正常对照组。②氧化损伤组:细胞中加入200μmol/LH2O2作用6h。③热休克处理组:42℃预热30min后,37℃恢复2h,处理同氧化损伤组。④放线菌酮组:预热前30min加入放线菌酮(25mg/L),其余处理同热休克处理组。观察各组细胞存活率、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性;DNAladder和AnnexinⅤ-FITC流式细胞仪检测晶状体上皮细胞凋亡率;免疫印迹法检测各组中热休克蛋白27和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。结果:①细胞活力:氧化损伤组低于正常对照组(0.24±0.02,0.28±0.04,P<0.01),热休克处理组高于氧化损伤组(0.27±0.04,P<0.05),放线菌酮组低于热休克处理组(0.23±0.01,P<0.01)。②细胞凋亡率:氧化损伤组高于正常对照组[(15.69±1.54)%,(4.17±0.83)%,P<0.01];热休克处理组低于氧化损伤组[(8.34±1.19)%,P<0.01];放线菌酮组高于热休克处理组[(13.58±1.21)%,P<0.01]。③超氧化物岐化酶和过氧化氢酶活性:氧化损伤组低于正常对照组(P<0.01),热休克处理组高于氧化损伤组(P<0.05),放线菌酮组低于热休克处理组(P<0.01)。④热休克蛋白27表达:正常对照组细胞中略有表达,氧化损伤组表达稍有增加,热休克处理组表达明显增多,放线菌酮组未见表达。⑤半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达:正常对照组细胞表达较弱,氧化损伤组表达增多,热休克处理组的表达少于氧化损伤组。结论:热休克预处理诱导的热休克蛋白27对氧化损伤的晶状体上皮细胞起着保护作用。其保护机制可能是:①对与晶状体抗氧化有关的酶防御系统的影响:②小分子热休克蛋白对抗细胞凋亡。     

臂丛神经损伤对热休克蛋白和神经型一氧化氮合成酶表达的影响

目的:观察臂丛神经远侧不同损伤后脊髓前角运动神经元中热休克蛋白70(Hsp70)、热休克蛋白27(Hsp27),以及神经型一氧化氮合成酶(nNOS)的表达变化.探讨其与运动神经元存活和再生的相互关系.方法:选用18只健康成年雄性SD大鼠,随机分为3组:肌皮神经切断组、挫伤组和对照组.术后2个月进行Grooming实验,检测其患肢运动功能的恢复.后取脊髓C5节段标本.观察脊髓运动神经元中三种蛋白的表达情况.结果:神经切断组和挫伤组的运动功能恢复均较明显,4级以上的百分比挫伤组(86%)优于切断组(57%).与对照组相比,两实验组损伤侧脊髓运动神经元中三种蛋白的表达均显著上调.切断组较挫伤组表达较高水平的Hsp70(140.61 1.25,130.08±2.38)和Hsp27(143.86±1.32,138.93±1.58);而nNOS蛋白在挫伤组中有较高水平的表达(挫伤组:106.12±0.91;切断组:68.18±0.63).结论:肌皮神经切断和挫伤后脊髓运动神经元中三种蛋白表达有所不同,其与损伤后功能恢复直接相关.     

hBDNF-GFP基因转染神经干细胞对视神经损伤大鼠视网膜BDNF表达的影响

目的 探讨移植hBDNF-GFP基因转染神经干细胞后对视神经损伤大鼠视网膜BDNF表达的影响.方法 ①78只SD大鼠随机分为正常对照组(n=6)、视神经夹伤组(n=72).视神经夹伤组动物行右侧视神经夹伤后随机平均分为三个亚组:分别于玻璃体腔内注射0.01 mol/L PBS(PBS组),GFP基因转染神经干细胞(GFP-NSCs组)和hBDNF-GFP基因转染神经干细胞(hBDNF-GFP-NSCs组).各组动物单纯暴露左侧视神经作为假损伤组.分别于移植后3 d,7 d,14 d和28 d处死动物取视网膜,ELISA法检测各组视网膜中BDNF含量.②另取6只视神经损伤大鼠移植hBDNF-GFP-NSCs,分别于2周、4周和8周各处死2只大鼠,取眼球做冰冻切片观察移植细胞存活、迁移情况.③35只sD大鼠随机分为4组:正常对照组(n=5)、右眼视神经损伤NSCs治疗组(n=10)、GFP-NSCs治疗组(n=10)及hBDNF-GFP-NSCs治疗组(n=10).④各组于术后4周和8周分别处死5只大鼠,West-era-blot法检测视网膜组织中BDNF表达.结果 ①ELISA结果显示,正常对照组BDNF含量与假损伤组间比较差异无统计学意义(P>0.05),移植手术后第3天时,三个损伤亚组视网膜匀浆上清中hBDNF含量明显增加(与假损伤组比较P<0.05),而三组间差异无统计学意义(P>0.05);7 d时,GFP-NSCs组与假损伤组比较差异具有统计学意义(P<0.05),而PBS组、hBDNF-GFP-NSCs组与假损伤组比较差异无统计学意义(P>0.05),PBS组与GFP-NSCs组间及hBDNF-GFP-NSCs组与GFP-NSCs组间差异具有统计学意义(P<0.05);移植第14天和28天时,PBS组和GFP-NSCs组中视网膜BDNF含量降低,而hBDNF-GFP-NSCs组中BDNF含量与其他三组比较明显升高,差异有统计学意义(P<0.05).②冰冻切片示移植后,hBDNF-GFP-NSCs可在宿主视网膜内存活,并逐渐迁移至视网膜各层.③Western-blot检测显示,各组内第4周和第8周BDNF表达差异无统计学意义,移植hBDNF-GFP-NSCs组视网膜组织中BDNF表达明显高于于其他各组.结论 hBDNF-GFP基因转染神经干细胞移植后可在宿主视网膜长期存活,且可以稳定高表达BDNF.     

牛磺酸对谷氨酸诱导大鼠视网膜神经节细胞凋亡的抑制

目的:视网膜谷氨酸兴奋毒性可引起视网膜内层神经元尤其是视网膜神经节细胞的凋亡,牛磺酸作为神经保护剂,本研究观察其是否可以减少削弱大鼠视网膜神经节细胞兴奋毒性损伤,减少视网膜神经节细胞凋亡.方法:实验于2003-03/09在第三军医大学营养与食品卫生学教研室完成.通过玻璃体注射谷氨酸建立大鼠视网膜谷氨酸兴奋毒性损伤模型,实验分为正常对照组、玻璃体注射磷酸盐缓冲液对照组,牛磺酸干预高、低剂量组及MK-801干预阳性对照组.牛磺酸干预采用腹腔注射,其高、低剂量分别为25 mg/kg体质量及5 mg/kg体质量.通过Thy-1免疫组化、原位缺口末端标记法观察谷氨酸兴奋毒性及牛磺酸干预对大鼠视网膜神经节细胞的Thy-1蛋白表达及细胞凋亡的影响.结果:玻璃体注射谷氨酸使视网膜Thy-1免疫反应下降、内核层及神经节细胞层出现大量凋亡细胞.谷氨酸组平均每张视网膜切片节细胞层有(200&;#177;12)个原位缺口末端标记阳性细胞,牛磺酸干预使视网膜Thy-1免疫反应增强、节细胞层凋亡细胞数显著下降[高、低剂量组分别为(68&;#177;6)个及(163&;#177;10)个],以高剂量牛磺酸的效果显著.结论:一定剂量的牛磺酸在体内可有效抑制谷氨酸兴奋毒性引起的大鼠视网膜神经节细胞损伤及凋亡.     

牛磺酸对谷氨酸诱导大鼠视网膜神经节细胞凋亡的抑制

目的:视网膜谷氨酸兴奋毒性可引起视网膜内层神经元尤其是视网膜神经节细胞的凋亡,牛磺酸作为神经保护剂,本研究观察其是否可以减少削弱大鼠视网膜神经节细胞兴奋毒性损伤,减少视网膜神经节细胞凋亡。方法:实验于2003-03/09在第三军医大学营养与食品卫生学教研室完成。通过玻璃体注射谷氨酸建立大鼠视网膜谷氨酸兴奋毒性损伤模型,实验分为正常对照组、玻璃体注射磷酸盐缓冲液对照组,牛磺酸干预高、低剂量组及MK-801干预阳性对照组。牛磺酸干预采用腹腔注射,其高、低剂量分别为25mg/kg体质量及5mg/kg体质量。通过Thy-1免疫组化、原位缺口末端标记法观察谷氨酸兴奋毒性及牛磺酸干预对大鼠视网膜神经节细胞的Thy-1蛋白表达及细胞凋亡的影响。结果:玻璃体注射谷氨酸使视网膜Thy-1免疫反应下降、内核层及神经节细胞层出现大量凋亡细胞。谷氨酸组平均每张视网膜切片节细胞层有(200±12)个原位缺口末端标记阳性细胞,牛磺酸干预使视网膜Thy-1免疫反应增强、节细胞层凋亡细胞数显著下降高、低剂量组分别为(68±6)个及(163±10)个,以高剂量牛磺酸的效果显著。结论:一定剂量的牛磺酸在体内可有效抑制谷氨酸兴奋毒性引起的大鼠视网膜神经节细胞损伤及凋亡。     

远期缺血预适应激活热休克蛋白27、促红细胞生成素、血红素加氧酶1对肾脏缺血再灌注损伤的影响

背景:缺血再灌注损伤是临床导致急性肾衰竭等其他疾病的重要原因,其机制为多因素、多途径的复杂的病理过程。目的:观察肾脏进行预处理后激活热休克蛋白、促红细胞生成素和血红素加氧酶1对肾脏缺血再灌注损伤的影响。方法:雄性C57BL/6小鼠90只随机分成3组。缺血再灌注组为右肾切除,左肾缺血25min再灌注24h;预适应组为双侧肾脏缺血20min再灌注8d后再进行缺血再灌注。假手术组开腹游离肾蒂。结果与结论:血清肌酐和尿素氮检测预适应组和假手术组明显低于缺血再灌注组(P<0.01);MPO染色发现缺血再灌注组大量中性粒细胞浸润(P<0.01);PAS染色发现预适应组肾组织病理情况轻于缺血再灌注组(P<0.05);TUNEL染色分析结果表明预适应组和假手术组细胞凋亡数明显少于缺血再灌注组(P<0.01);预适应组热休克蛋白27mRNA表达明显高于缺血再灌注和假手术组(P<0.05),热休克蛋白27mRNA于第8天时最强,促红细胞生成素、血红素加氧酶1mRNA在24～48h达到峰值A,然后逐渐下降,第8天后达到峰值B,B>A,并且高于假手术组(P<0.01)。提示远期缺血预适应激活热休克蛋白27、促红细胞生成素、血红素加氧酶1,能减少炎症因子浸润、促进肾小管细胞修复和抑制细胞凋亡从而参与肾脏内源性保护机制。     

白细胞介素-1β在激光损伤家兔视网膜组织中的表达变化

目的探讨白细胞介素-1β(IL-1β)在激光损伤视网膜组织中的表达变化。方法成年健康有色家兔72只,随机分为对照组(不做任何处理)、假手术组(除不进行532nm绿激光照射外,其余操作与损伤组相同)、损伤组(532nm绿激光进行视网膜激光损伤照射造模)各24只,以术后7d、术后14d、术后21d、术后28d作为观察时间点,每个时间点各处死对照组、假手术组、损伤组家兔6只。观察并计算各时间点家兔的视网膜细胞的凋亡指数,记录视网膜组织中IL-1β表达变化视网膜损伤形态与病理变化。结果损伤组术后7d激光斑中心呈灰色改变周围可见灰白色边缘;术后14 d激光斑呈黑灰色改变;术后21d和28d激光斑之间有融合的趋势。术后7d、14d、21d和28d损伤组家兔的视网膜细胞凋亡指数均显著高于对照组(P<0.05)。术后7d损伤组的IL-1β蛋白阳性信号显著高于对照组(P<0.05)在术后14d、21d和28d逐渐下降但仍显著高于对照组(P<0.05)。损伤组术后7 d视细胞内外节数量显著减少术后14d、21d和28d外节部分再生,盘膜排列疏松线体肿胀减轻。结论激光损伤家兔视网膜组织中早期伴随有IL-1β的大量表达,随着损伤愈合的进行,IL-1β表达量逐渐减少,可反映视网膜功能状态的变化。     

锥体束损伤后不同时间点脑内锥体束神经元热休克蛋白27表达的变化

目的:探讨大鼠锥体束损伤后不同时间点脑内锥体束神经元热休克蛋白27表达的变化。方法:制作大鼠锥体束损伤模型,分别在损伤后3,7,14,28d用免疫组织化学方法检测热休克蛋白27在大鼠脑内初级运动皮质锥体束神经元的表达,分析其表达变化的特点。结果:锥体束损伤3d,HSP27在大多数锥体束神经元中呈强阳性表达,阳性神经元数目为(252±25)个/视野,与对照组(97±18)个/视野比,差异有非常显著性意义(t=10.262,P<0.01),7d时仍维持较高水平(t=2.513,P<0.05),以后则逐渐下降。结论:HSP27的表达随时间而变化,提示其参与了神经系统受损后早期神经元的保护和修复。