艾灸对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞自噬功能的影响

目的:观察艾灸对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心功能及自噬相关蛋白LC3、p62表达的影响,探讨艾灸防治CHF的可能机制。方法:SD大鼠随机分为正常组12只与造模组48只,采用腹腔注射盐酸多柔比星复制CHF模型,将建模成功的大鼠随机均分为模型组、艾灸组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)组、自噬激动剂雷帕霉素(RAPA)组。艾灸组用艾条温和灸双侧"肺俞""心俞"穴,每日1次,每次20min,治疗3周。3-MA组按15 mg/kg给予3-MA混悬液腹腔注射,每日1次,共3周。RAPA组按2mg/kg给予RAPA混悬液灌胃,每日1次,共3周。观察大鼠的一般情况及行为体征;心功能测量仪检测大鼠心率(HR)、心输出量(CO)、左心室收缩压(LVSP)、左心室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升或下降速率(±dp/dtmax);HE染色法观察心肌病理变化;Western blot法检测心肌细胞自噬相关蛋白LC3及p62表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠心肌细胞出现肿胀、空泡,肌纤维断裂、溶解,排列紊乱;与模型组比较,艾灸组和3-MA组大鼠心肌细胞的数量正常,心肌纤维排列相对整齐,RAPA组心肌细胞出现肿胀、空泡,心肌纤维断裂、溶解,排列紊乱等状况。与正常组比较,模型组HR和LVEDP明显升高(P0.01),CO、LVSP及±dp/dtmax明显下降(P0.01),LC3-Ⅱ表达、LC3-Ⅱ/Ⅰ明显升高(P0.01),而p62表达明显下降(P0.01)。与模型组比较,艾灸组和3-MA组HR和LVEDP明显下降(P0.05),CO、LVSP及±dp/dtmax明显升高(P0.05),LC3-Ⅱ表达、LC3-Ⅱ/Ⅰ明显降低(P0.01),p62表达明显升高(P0.01),而RAPA组LC3-Ⅱ/Ⅰ明显升高(P0.01),p62表达明显降低(P0.01)。结论:艾灸可以改善CHF大鼠心肌损伤,其作用可能与降低心肌细胞LC3-Ⅱ/Ⅰ、升高p62蛋白表达水平,发挥类似于3-MA的自噬抑制作用,抑制心肌细胞过度自噬、减轻心肌损伤有关。     

电针对胰岛素抵抗大鼠肝脏组织自噬相关蛋白表达的影响

目的 观察电针对胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)大鼠肝脏组织自噬相关蛋白表达的影响,探讨电针治疗IR的潜在机制。方法 将Wistar雄性大鼠随机分为正常组、模型组和电针组,每组8只。电针干预选取中脘、关元、足三里及丰隆穴,每周干预3次,共8周。检测各组大鼠的餐后血糖(postprandial blood glucose, PBG)、腹腔糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)血糖、葡萄糖输注率(glucose infusion rate, GIR)。采用高压尾静脉注射GFP-LC3质粒,观察肝细胞GFP-LC3荧光斑,Western Blot法检测大鼠肝脏组织中微管相关蛋白1轻链3B-Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3B-Ⅱ, LC3B-Ⅱ)、p62(sequestosome 1, p62)、蛋白激酶B(protein kinase B, AKT)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated-AKT, p-AKT)、胰岛素受体底物-...     

针刺调控自噬流拮抗大鼠脑缺血损伤

目的:观察针刺对脑缺血损伤大鼠脑梗死体积及自噬相关蛋白表达的影响,探讨针刺拮抗大鼠脑缺血损伤的效应及其可能的机制。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组,每组根据缺血时间不同分为3、6、12和24 h亚组,每个亚组7只。采用线栓法制备大脑中动脉栓塞模型。造模成功后,各针刺组于“水沟”“内关”进行针刺,留针30 min。观察干预后不同时点各组大鼠神经功能缺损评分变化;用2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色法观察各组大鼠脑梗死体积百分比;Western blot法检测各组大鼠大脑皮层缺血区域自噬相关基因Beclin1、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62的表达。结果:与同时点假手术组比较,模型组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积百分比、大脑皮层Beclin1蛋白表达水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明显升高(P<0.01,P<0.05),p62蛋白表达水平降低(P<0.01)。与同时点模型组比较,针刺组大鼠6、12、24 h神经功能缺损评分及各时点脑梗死体积百分比、3 h的p62表达水平降低(P<0.01,P<0.05),6、12 h的Beclin1表达水...     

基于自噬探讨左归降糖通脉方对糖尿病合并脑梗死大鼠的神经保护作用机制

目的 从自噬角度探讨左归降糖通脉方(熟地黄、枸杞子、山茱萸、黄芪、黄连等)对糖尿病合并脑梗死大鼠的神经保护作用机制。方法 将96只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、左归降糖通脉方组(24 g·kg^-1)及二甲双胍+阿司匹林组(150 mg·kg^-1+15 mg·kg^-1),每组24只。除假手术组大鼠外,其余大鼠采用高糖高脂饲料喂养4周后腹腔注射链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型,模型复制成功后开始灌胃给药,每日1次,连续5 d。末次灌胃后采用线栓法制备大脑中动脉栓塞大鼠模型。术后进行神经功能评分;采用TTC染色法测定脑梗死率;检测大鼠血糖值及糖化血清蛋白含量;HE染色观察缺血半脑皮质区组织损伤;ELISA法检测缺血侧大脑皮质组织中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;Western Blot法检测皮质组织中微管相关蛋白轻链3(LC3)、p62蛋白表达情况;免疫荧光法检测皮质组织中LC3蛋白表达。结果 与假手术组比较,模型组大鼠的神经功能损伤评分、脑梗死率、血糖水平、治疗前后的体质量...     

葛根素调节AMPK-mTOR信号通路抑制自噬改善大鼠脑缺血再灌注损伤研究

目的探讨葛根素通过腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)-Unc-51样激酶1(Ulk1)通路抑制自噬改善大鼠脑缺血再灌注损伤的作用。方法 40只雄性SD大鼠随机分为4组,即假手术组、模型组及葛根素低、高剂量(50、100 mg/kg)组。各组大鼠连续给药7 d,末次给药30min后,采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,缺血1.5 h再灌注24 h后,进行神经功能评分,TTC染色观察脑梗死体积,电镜观察自噬小体的形成,Western blotting法检测海马组织中微管相关蛋白1轻链3(LC3)、p62、AMPK、p-AMPK、m TOR、p-mTOR、Ulk1、p S757-Ulk1蛋白表达水平。结果与假手术组比较,模型组大鼠神经功能评分显著增加,脑梗死体积明显增大,自噬小体增多,LC3-II/LC3-I显著增加,p62蛋白表达水平显著降低,p-AMPK表达水平显著升高,p-m TOR和p S757-Ulk1蛋白表达水平显著降低。与模型组比较,葛根素各组大鼠的神经功能损伤明显改善,脑梗死体积减小,自噬小体减少,LC3-II/LC3-I显著降低,p62蛋白表达水平显著升高,p-AMPK蛋白表达水平显著降低,p-m TOR和p S757-Ulk1蛋白表达水平显著升高。结论葛根素可能通过调控AMPK-m TOR-Ulk1信号通路抑制自噬的过度发生,从而减轻脑缺血再灌注损伤的发生。     

当归拈痛汤对风湿热痹型佐剂性关节炎大鼠自噬蛋白LC3，Beclin1，p62表达的影响

目的:研究当归拈痛汤对风湿热痹型佐剂性关节炎大鼠的防治作用及对自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3),自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin1),p62表达的影响。方法:将6周龄SD雄性大鼠随机分为正常组,风湿热痹模型组,当归拈痛汤低、中、高剂量组(5.67,11.34,22.68 g·kg^-1),甲氨蝶呤(MTX)组(1.35 mg·kg^-1),每组10只,通过对大鼠尾根部皮下注射灭活结核分支杆菌佐剂建立佐剂性关节炎大鼠模型,用人工气候箱进行风湿热痹证模型造模16 d,于免疫当天灌胃给药,持续28 d。进行大鼠一般情况观察及足趾肿胀度、关节炎指数(AI)检测,苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠膝关节滑膜组织病理形态学改变,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠滑膜组织LC3,Beclin1,p62的mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)及免疫组化法分别检测大鼠滑膜组织LC3,Beclin1,p62的蛋白表达。结果:与正常组比较,风湿热痹模型组大鼠给药16,20,24,28 d时足趾肿胀度显著升高(P<0.01),AI显著升高(P<0.01),滑膜细胞增生显著,自噬蛋白LC3,Beclin1蛋白及mRNA表达显著上调(P<0.01),p62蛋白及mRNA表达显著下调(P<0.01);与风湿热痹模型组比较,各给药组大鼠足趾肿胀度减轻,滑膜增生情况有不同程度改善,LC3,Beclin1的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.01),p62的mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),且当归拈痛汤中剂量组防治效果最佳。结论:当归拈痛汤对风湿热痹型佐剂性关节炎大鼠有明显的防治作用,且这种防治作用可能与调控滑膜组织中自噬相关因子LC3,Beclin1,p62的表达,抑制自噬有关。     

大黄素抑制HBSS诱导的肾小管上皮细胞自噬的分子机制

目的:探讨大黄素(emodin)对饥饿诱导的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)自噬的调节作用及其可能机制。方法:首先,用Western blot检测大黄素对Hank's平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution,HBSS)饥饿诱导的细胞自噬标志性蛋白——哺乳动物同族物微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)Ⅰ/Ⅱ表达水平的影响;其次,用红色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(redfluorescent protein-microtubule associated protein light chain3,RFP-LC3)质粒瞬时转染NRK-52E细胞,以HBSS(1 mL)联合巴弗洛霉素A1(10 nmol·L^-1)处理,予大黄素(10 μmol·L^-1)干预后,荧光显微镜下观察RFP-LC3荧光颗粒的变化;然后,以哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂雷帕霉素(100 nmol·L^-1)干预,观察阻断mTOR信号通路对大黄素抑制细胞自噬作用的影响;最后,通过诱导内源性mTOR抑制蛋白DEPTOR(DEP domain-containing mTOR-interacting protein)过表达,进一步评估mTOR信号通路对大黄素抑制细胞自噬的影响。结果:HBSS饥饿可诱导NRK-52E细胞LC3Ⅱ蛋白高表达,大黄素干预后可逆转HBSS诱导的LC3Ⅱ蛋白表达增加;HBSS联合巴弗洛霉素A1处理后可引起RFP-LC3荧光颗粒数目增多,大黄素干预后可抑制其数目的增加;雷帕霉素与大黄素、HBSS联合干预后,雷帕霉素可以恢复HBSS诱导的NRK-52E细胞LC3Ⅱ蛋白表达水平;而过表达内源性mTOR抑制蛋白DEPTOR同样可以阻断大黄素对LC3Ⅱ蛋白表达的抑制作用。结论:大黄素可以抑制HBSS诱导的肾小管上皮细胞LC3Ⅱ蛋白表达和自噬活化,其阻断自噬的作用可能是通过mTOR信号通路介导的。     

当归饮子加减方对气血两虚模型慢性荨麻疹小鼠全身皮肤瘙痒影响的实验研究

目的:研究当归饮子加减方对气血两虚型小鼠皮肤瘙痒的影响。方法:KM小鼠,雌雄各半,采用利血平+乙酰苯肼制作动物气血两虚模型,联合I型变态反应模拟荨麻疹模型,选择模型制作成功的动物,随机分为模型组、氯雷他定组、当归饮子加减方高剂量组、中剂量组和低剂量组,每组8只动物,另取8只作为空白对照组。利用低分子右旋糖酐诱发小鼠皮肤瘙痒,观察小鼠搔抓次数,搔抓时间,实验结束时,各组动物眼眶取血,分离血清,ELISA法测试血清组胺含量。结果:当归饮子加减方各剂量组可显著延长小鼠搔抓潜伏期(P<0.01);减少小鼠搔抓次数(P<0.01);缩短搔抓持续时间(P<0.01),显著降低血清组胺水平。结论:当归饮子加减方可显著抑制低分子右旋糖酐致小鼠皮肤瘙痒反应。     

四妙散调节软骨细胞凋亡与自噬治疗膝骨关节炎大鼠的实验研究

目的:通过膝骨关节炎大鼠模型研究四妙散调节软骨细胞凋亡与自噬治疗膝骨关节炎(KOA)大鼠的作用机制。方法:8周龄SD大鼠27只,随机分为正常对照组、KOA模型组、四妙散组,KOA模型组和四妙散组采用前交叉韧带切除法制作KOA模型,手术6周后四妙散组以四妙散药液灌胃,正常对照组和KOA模型组以生理盐水灌胃。连续灌胃4周后取膝关节软骨组织,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定凋亡细胞所占比例,采用荧光定量PCR检测关节软骨组织中凋亡和自噬相关基因表达水平。结果:与正常对照组比较,KOA模型组大鼠关节软骨细胞凋亡率显著升高,关节软骨细胞中凋亡相关蛋白Fadd、Casp3的表达显著升高,自噬相关蛋白LC3的表达显著降低,差异均有统计学意义(P0.05)。与KOA模型组比较,四妙散组大鼠关节软骨细胞凋亡率显著降低,关节软骨细胞中凋亡相关蛋白Fadd、Casp3的表达显著降低,自噬相关蛋白LC3的表达显著升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:软骨细胞凋亡是KOA发病中的重要因素,该凋亡可能通过FADD-CASP3途径发挥作用。软骨细胞自噬作用的激活可抑制细胞凋亡,可能是延缓及控制KOA进展的一个新机制,四妙散可能通过该机制发挥治疗作用。     

电针预处理通过调控皮层区自噬改善大鼠脑缺血再灌注损伤

目的:观察电针"百会""曲池""足三里"对脑缺血再灌注损伤大鼠大脑皮层区自噬的影响,探讨电针预处理改善大鼠脑缺血再灌注损伤的机制。方法:SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组、电针组,每组11只。电针组电针"曲池""百会""足三里",每次30 min,每天1次,连续5 d。模型组和电针组大鼠末次电针结束30 min后,采用线栓法制备大脑中动脉栓塞模型,使大鼠脑缺血1. 5 h,拔栓再灌注24 h后进行神经功能缺损评分,2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色法检测脑梗死体积,高尔基染色法检测神经元树突棘密度,电镜观察大脑皮层缺血区神经元结构及自噬小体形成情况,Western blot法检测大脑皮层缺血区中微管相关蛋白1轻链3(LC3)和选择性自噬接头蛋白sequestosome-1(SQSTM1/p62)的表达水平。结果:与假手术组相比,模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高(P<0. 01),脑梗死体积显著增大(P<0. 01),自噬小体增多,皮层缺血区LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著增加(P<0. 01),p62的表达显著下调(P<0. 01)。与模型组相比,电针组大鼠神经功能缺损评分明显降低(P<0. 01),脑梗死体积显著减小(P<0. 01),自噬小体减少,皮层缺血区LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ显著降低(P<0. 01),p62的表达显著上调(P<0. 01)。结论:电针预处理可能通过抑制自噬改善脑缺血再灌注损伤。     

芪玉三龙汤调节Beclin1,Atg5,LC3B表达以抑制肺癌肿瘤生长机制

目的:研究芪玉三龙汤对肺癌小鼠皮下移植瘤生长及对自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin1),自噬相关基因5(autophagy related genes,Atg5)及微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1light chain3,LC3B)表达的影响。方法:采用Lewis肺癌细胞(lewis lung cancer cell,LLC)构建肺癌移植瘤小鼠模型,造模成功后随机分为模型组、芪玉三龙汤组、顺铂组及联合组,每组18只移植瘤小鼠。模型组每日按照生理盐水20 mL·kg~(-1)灌胃;芪玉三龙汤组每日按照80. 48 g·kg~(-1)灌胃;顺铂组在第1,3,5天腹腔注射顺铂溶液(DDP)0. 4 mL;联合组每日按80. 48 g·kg~(-1)灌胃给药,并分别在第1,3,5天腹腔注射顺铂溶液0. 4 mL;连续治疗21 d剥离瘤组织,称取瘤重,计算抑瘤率。苏木素-伊红(HE)染色观察肿瘤组织形态学改变。免疫组化检测肿瘤组织中Beclin1,LC3B蛋白表达和定位。蛋白免疫印迹法(Western blot)测定Beclin1,Atg5,微管相关蛋白1轻链3-I(LC3B-Ⅰ)及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)蛋白表达,并计算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肿瘤组织Beclin1,Atg5 mRNA转录水平。结果:芪玉三龙汤具有温和的移植瘤抑制作用,抑瘤率为31. 2%;镜下观察芪玉三龙汤组肿瘤组织可见片状坏死的肿瘤细胞;免疫组化及Western blot实验表明,与模型组比较,芪玉三龙汤能够上调Beclin1,Atg5,LC3B蛋白的表达(P 0. 01),并且能促进LC3B-Ⅰ转化为LC3B-Ⅱ;Real-time PCR结果表明,与模型组比较,芪玉三龙汤能够促进Beclin1,Atg5 mRNA的转录(P 0. 01)。结论:芪玉三龙汤对肺肿瘤生长具有温和地抑制作用,其作用机制可能与上调自噬关键分子Beclin1,Atg5,LC3B表达,促进LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ转化有关。     

基于环状RNA测序探讨当归芍药散对APPswe/PS1ΔE9转基因小鼠的神经保护作用

目的:研究环状RNA(circRNA)在当归芍药散对APPswe/PS1ΔE9双转基因(APP/PS1)小鼠神经保护作用及其机制。方法:6月龄APP/PS1小鼠20只随机分为模型组和药物组,药物组予以当归芍药散水提液灌胃,10只野生C57BL/6小鼠为正常组,正常组和模型组给予等体积生理盐水,各组连续灌药8周。应用circRNA测序分析当归芍药散干预前后APP/PS1小鼠差异表达circRNA,构建circRNA-miRNA mRNA相互作用网络,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)验证cric RNA测序结果,应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测海马区磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K),磷酸化PI3K(p-PI3K),蛋白激酶B1(Akt1),p-Akt1,B淋巴细胞瘤-2和Bcl-2-相关X的蛋白质(Bax)的蛋白表达水平,应用免疫组化检测海马区的Caspase-3的蛋白表达水平,应用末端标记(TUNEL)法检测小鼠海马区神经元凋亡水平。结果:与模型组比较,当归芍药散干预后有90个差异表达的circRNA,其中46个上调,44个下调。与正常组比较,模型组circRNA1398,circRNA1399表达水平下降,miR-103-3p,miR-153-3p,miR-143-3p及miR-143-5p表达水平上调(P<0.01),与模型组比较,当归芍药散组circRNA1398,circRNA1399表达水平上调,miR-103-3p,miR-153-3p,miR-143-3p及miR-143-5p表达水平下降(P<0.01)。通过circRNA-miRNA mRNA相互作用网络分析circRNA1398和circRNA1399调控Bcl-2和Akt1基因表达。与正常组比较,模型组的p-PI3K,Akt1,p-Akt1和Bcl-2表达量下降(P<0.01),Bax和Caspase-3的蛋白表达量升高(P<0.01);与模型组比较,当归芍药散组APP/PS1小鼠海马区的p-PI3K,Akt1,p-Akt1和Bcl-2表达量增加(P<0.01),Bax和Caspase-3的蛋白表达量下降(P<0.01)。与正常组比较,模型组小鼠海马区神经元凋亡水平上升,细胞凋亡率为(43.76±2.92)%。与模型组比较,当归芍药散干预后细胞凋亡率为(24.64±3.39)%。结论:当归芍药散可以激活PI3K/Akt通路和抑制APP/PS1小鼠海马区神经元凋亡,发挥神经保护作用,具体机制可能与其上调circRNA1398和circRNA1399表达及其相应miRNA的表达相关。     

心阳片通过抑制心肌细胞自噬改善心力衰竭小鼠心功能的作用研究

目的探讨心阳片调节心肌细胞自噬改善心力衰竭(Heart failure,HF)小鼠心功能的作用机制。方法将48只雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组,模型组,心阳片低、中、高剂量组(455、910、1820 mg·kg^-1)及3-甲基腺嘌呤组(15 mg·kg^-1,腹腔注射给药),每组8只;采用主动脉弓缩窄术复制HF小鼠模型;按上述剂量灌胃给药,灌胃体积为8 mL·kg^-1,每天给药1次,连续4周。采用心脏彩超检测各组小鼠心功能:小鼠左心室射血分数(LVEF)及左室短轴缩短率(LVFS);采用q PCR法检测小鼠心脏组织HF生物标记物B型钠尿肽(BNP)mRNA的表达;采用Western Blot法检测小鼠心肌细胞自噬相关蛋白Beclin-1及LC3BⅡ/Ⅰ的表达。结果与假手术组比较,模型组小鼠的LVEF、LVFS显著降低(P<0.05),BNP mRNA及Beclin-1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达明显上调(P<0.05)。与模型组比较,心阳片低、中、高剂量组及3-甲基腺嘌呤组小鼠的LVEF、LVFS显著升高(P<0.05),BNP mRNA及Beclin-1、LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论心阳片可能通过抑制心肌细胞过度自噬改善HF小鼠的心功能。     

基于TXNIP/NLRP3/GSDMD信号通路探讨当归补血汤对糖尿病肾病大鼠足细胞焦亡的影响

目的:观察当归补血汤对糖尿病肾病(DKD)大鼠足细胞焦亡的影响,探讨其防治DKD及足细胞焦亡的可能作用机制。方法:将50只雄性SD大鼠随机分为造模组42只和正常组8只,造模组大鼠高糖高脂饮食6周结合链脲佐菌素(STZ)35 mg·kg^-1一次性腹腔注射制备2型糖尿病模型。造模成功后随机分为模型组、当归补血汤低剂量(0.72 g·kg^-1)组、当归补血汤高剂量(1.44 g·kg^-1)组、厄贝沙坦(0.017 g·kg^-1)组进行灌胃,正常组及模型组给予等体积生理盐水灌胃,每日1次,连续干预20周。给药期间定期检测各组大鼠空腹血糖(FBG),24 h尿蛋白(24 h-UTP);给药结束后采用过碘酸六胺银(PASM)染色观察肾组织病理形态学变化;透射电镜(TEM)观察足细胞超微结构变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠血清白细胞介素-1β(IL-1β),白细胞介素-18(IL-18)水平;原位末端标记法(TUNEL)检测大鼠肾组织细胞DNA损伤情况;免疫组化法(IHC)检测大鼠肾组织硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP),半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1),消皮素D(GSDMD)蛋白表达水平;免疫荧光(IF)三标法检测核苷酸结合域样受体蛋白3(NLRP3)及肿瘤蛋白-1(WT-1)在足细胞的表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠肾组织TXNIP/NLRP3/Caspase-1/GSDMD通路蛋白及足细胞突触足蛋白(Synaptopodin)表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠FBG,24 h-UTP显著升高,肾小球肥大,系膜增生,系膜外基质增加,基底膜增厚,出现K-W结节,肾小管上皮细胞空泡变性,足突融合或丢失,血清中IL-1β,IL-18含量明显升高,肾组织TUNEL阳性细胞明显增多,NLRP3在足细胞表达增多且WT-1在足细胞表达减少,Synaptopodin蛋白表达水平显著降低,TXNIP/NLRP3/Caspase-1/GSDMD蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,当归补血汤高剂量组明显降低FBG,24 h-UTP水平,明显改善肾组织病理学,改善足细胞的损伤和丢失,减少肾组织TUNEL阳性细胞数,NLRP3在足细胞表达减少且WT-1在足细胞表达增多,升高Synaptopodin蛋白表达水平,降低TXNIP/NLRP3/Caspase-1/GSDMD蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论:当归补血汤可能通过调控TXNIP/NLRP3/GSDMD信号通路,抑制足细胞焦亡以减少蛋白尿,从而延缓DKD的发展进程。     

基于Nrf2/Keap1/p62信号通路探讨百合固金汤对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用

目的:探究百合固金汤对脂多糖诱导的急性肺损伤(LPS-ALI)小鼠的预防作用及其机制。方法:将KM小鼠随机分为5组:空白组,模型组,地塞米松组(0. 002 g·kg~(-1)),百合固金汤组(0. 417,1. 25 g·kg~(-1))。除空白组外,其余各组采用LPS诱导小鼠ALI模型。给药组分别在造模前的第1～7天连续灌胃给药7 d。在造模后6 h取小鼠肺组织,测定左肺湿/干质量比(W/D);收集小鼠血清检测超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),活性氧(ROS),一氧化氮(NO)的水平;应用苏木素-伊红(HE)染色方法观察肺组织病理改变;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肺组织中核转录因子E2相关因子2(Nrf2),Kelch样环氧氯丙胺相关蛋白1(Keap1),p62以及自噬相关蛋白(LC3)Ⅱ蛋白的表达水平。结果:与空白组比较,模型组小鼠W/D显著升高(P 0. 01),血清中MDA水平显著性升高(P 0. 01),SOD显著降低(P 0. 01),肺组织病变严重,并显著降低肺组织Nrf2,Keap1,升高p62,LC3Ⅱ的蛋白表达(P 0. 01)。与模型组比较,地塞米松组、百合固金汤1. 25 g·kg~(-1)组W/D显著降低(P 0. 01);百合固金汤1. 25 g·kg~(-1)组及地塞米松组,能够明显抑制血清中MDA的水平(P 0. 05,P 0. 01),升高SOD(P 0. 05,P 0. 01)水平,地塞米松组及百合固金汤各剂量组对小鼠肺组织病变较模型组有不同程度的改善,且显著性升高肺组织Nrf2,Keap1,降低p62及LC3Ⅱ的蛋白表达(P 0. 05,P 0. 01),但百合固金汤各剂量组对LC3Ⅱ无影响。结论:百合固金汤对LPS-ALI小鼠具有明显的预防作用,其机制可能与调控Nrf2/Keap1/自噬反馈回路有关。     

基于RIPK1/RIPK3/MLKL信号通路探讨当归补血汤对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的影响

目的:观察当归补血汤对糖尿病肾病(DKD)大鼠足细胞损伤及受体相互作用蛋白激酶1/受体相互作用蛋白激酶3/混合系激酶区域样蛋白(RIPK1/RIPK3/MLKL)信号通路的影响,探讨其治疗DKD的可能作用机制。方法:50只SD大鼠随机选取8只设为正常组,其余大鼠6周高糖高脂饮食结合一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)0.035 g·kg-1制备2型糖尿病大鼠模型。模型制备成功后随机分为模型组,当归补血汤高、低剂量(1.44,0.72 g·kg-1)组,厄贝沙坦(0.017 g·kg-1)组。药物干预20周后检测各组大鼠空腹血糖(FBG),肾重指数(KI),尿微量白蛋白与尿肌酐比值(UACR);苏木素-伊红(HE)染色观察肾组织病理形态学变化;透射电镜观察足细胞超微结构变化;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测大鼠肾组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α),白细胞介素-6(IL-6)水平;免疫组化法检测大鼠肾组织RIPK1,RIPK3,MLKL蛋白表达;原位末端标记法(TUNEL)检测大鼠肾脏足细胞凋亡率;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠肾组织RIPK1,RIPK...     

参苓白术散通过调节肠上皮细胞自噬治疗葡聚糖硫酸钠所致小鼠炎症性肠病

目的:探究参苓白术散对5%葡聚糖硫酸钠(DSS)所致BALB/c小鼠炎症性肠病(IBD)的改善作用与肠上皮细胞自噬的关系。方法:84只BALB/c小鼠,除正常组之外,5%DSS自由饮用7 d诱导急性炎症性肠病,治疗组分别给予参苓白术散高、中、低剂量组(12,6,3 g·kg-1·d-1),美沙拉嗪组(2 g·kg-1·d-1),自噬诱导剂雷帕霉素组(4 mg·kg-1·d-1)灌胃。观察小鼠体质量、粪便性状、隐血便血,计算疾病活动度(DAI)积分;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测小鼠血清中炎症因子白细胞介素-8(IL-8),IL-10含量;苏木素-伊红(HE)染色观察结肠组织病理学改变;免疫组化检测肠组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-1β的表达;共聚焦显微镜观察肠上皮细胞自噬体形成情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测自噬相关通路蛋白的水平。结果:与模型组比较,参苓白术散组小鼠隐血,便血,体质量下降,DAI积分,病理改变等均改善;与正常组比较,模型组小鼠血清中IL-10含量显著降低,IL-8含量显著升高(P 0. 01),小鼠肠组织中IL-1β和TNF-α的表达明显升高(P 0. 01),肠上皮细胞自噬体减少,微管轻链蛋白3(LC3)-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值含量显著降低(P 0. 01);与模型组比较,参苓白术散可以升高小鼠血清IL-10含量,降低IL-8含量明显(P 0. 05,P 0. 01),明显降低IL-1β和TNF-α的表达(P 0. 05),参芩白术散高剂量组、雷帕霉素及美沙拉嗪组肠上皮细胞自噬体形成显著增多,显著升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ含量。结论:参苓白术散抗DSS诱导的IBD的作用与抑制炎症及调节肠上皮细胞自噬有关。     

加味升降散对膜性肾病大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路及自噬的影响

目的:探讨加味升降散对膜性肾病(MN)大鼠的干预作用及相关作用机制。方法:采用大鼠尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)的方法建立MN大鼠模型。设正常组、模型组、加味升降散组(27.3 g·kg-1)和贝那普利组(10 mg·kg-1),分别给予相应剂量药物灌胃,每日1次,连续干预4周。给药结束后检测大鼠24 h尿蛋白(UTP)水平,血清总胆固醇(TC),甘油三酯(TG),总蛋白(TP),白蛋白(Alb),肌酐(SCr),尿素氮(BUN)水平;马松(Masson)染色、碘酸六胺银(PASM)染色及透射电镜观察大鼠肾脏病理学变化;免疫荧光观察大鼠肾脏免疫球蛋白(Ig)G沉积;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路相关分子及自噬相关指标LC3和Beclin1的表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠UTP,血清中TC,TG水平均升高,TP,Alb水平明显降低(P0.05);肾小球增大,基底膜出现不同程度的增厚和空泡变性,嗜复红蛋白沉积,肾小球毛细血管袢IgG弥漫性沉积,上皮下可见大小不等的电子致密物沉积,足细胞足突广泛融合;磷酸化(p)-PI3K,p-Akt和p-mTOR蛋白表达均明显增加(P0.05),自噬标志蛋白LC3和Beclin1蛋白表达量均明显下降(P0.05);与模型组比较,加味升降散组和贝那普利组大鼠UTP,血清中TC,TG水平均有不同程度的下降,TP,Alb水平有不同程度的升高(P0.05);大鼠肾组织病理损伤均有所减轻;p-PI3K,p-Akt和p-mTOR蛋白表达量明显下降(P0.05);自噬标志蛋白LC3和Beclin1蛋白表达量明显升高(P0.05)。结论:加味升降散可通过减少尿蛋白,减轻肾脏病理损伤,延缓疾病进展,其作用与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路和激活肾脏自噬有关。