高分辨率熔解曲线检测结核分枝杆菌 对利福平耐药性研究

摘要：目的　评价高分辨率熔解曲线（ｈｉｇｈｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｍｅｌｔ,ＨＲＭ） 技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药 性的临床应用价值。方法　用传统结核分枝杆菌药敏试验对新疆石河子大学人畜共患病实验室保存的５０株 临床分离菌进行耐药性检测。以狉狆狅犅基因的利福平耐药决定区为靶标设计引物进行高分辨率熔解曲线分 析,判断分离出的结核分枝杆菌是否对利福平耐药。应用ＳＰＳＳ１７．０分析,以传统结核分枝杆菌药敏试验 结果为标准,计算两种方法的符合率。用χ ２ 检测分析比例法药敏结果与高分辨率熔解曲线检测结果的差异 性。用Ｋａｐｐａ检测分析两种结果的一致性。结果　药敏试验结果显示,５０ 株菌中有１ 株为非结核分枝杆 菌;４９株中有２０株同时对利福平和异烟肼耐药、１株仅对利福平耐药;ＨＲＭ 检测结果显示,２１株对利福 平耐药,２８株为敏感株。以传统药敏试验为参考,ＨＲＭ 检测利福平耐药性的敏感性为８６．３６％,特异性 为９２．５９％,经Ｋａｐｐａ检验显示,两种方法检测结果具有高度一致性。结论　ＨＲＭ 可快速检测结核分枝杆 菌对利福平的耐药性,具有较高灵敏度,在耐药结核病的早期诊断上有一定的应用价值。 关键词：高分辨率熔解曲线（ＨＲＭ）;结核分枝杆菌;利福平;耐药性;药敏试验;狉狆狅犅基因;分子诊断 中图分类号：Ｒ４４６．５　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１９）０３ ０１６１ ０４     

Gene-Xpert MTB/RiF与熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药分析

目的评价Gene-Xpert MTB/RiF法与熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药的不同应用价值。方法入选235例涂阳结核病患者痰标本分别做传统比例法药敏试验、Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法检测结核分枝杆菌的利福平耐药,以传统药敏试验作为金标准进行比较。结果 235例标本中比例法药敏试验利福平耐药12例(5.1%)、Gene-Xpert MTB/RiF利福平耐药例15例(6.4%)、熔解曲线法利福平耐药19例(8.1%),Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法敏感度分别为91.7%和100.0%;特异度分别为98.2%和96.7%。结论Gene-Xpert MTB/RiF和熔解曲线法两者均可应用于结核分枝杆菌利福平耐药性的快速检测,Gene-Xpert MTB/RiF法在我国开展结核菌耐多药筛查具更有较强的实用性,有更广的应用前景。     

应用Xpert MTB/RIF技术快速筛查耐多药肺结核

目的评估Xpert MTB/RIF技术(简称Xpert法)快速筛查耐多药结核(MDR-TB)的可行性。方法采用Xpert法和结核液体药敏试验分别对197株痰培养检出结核分枝杆菌菌株做利福平耐药检测,比较两者诊断利福平耐药的一致性;收集温州市2 417例肺结核患者一线液体药敏试验结果,分析利福平耐药作为MDR-TB诊断指标的可行性;并依上述两项结果评估用Xpert法快速筛查耐多药结核的可能性。结果以液体药敏法为金标准,197株菌株中Xpert法检测利福平耐药的灵敏度为100.00%,特异度为98.45%,阳性预测值为97.14%,阴性预测值为100.00%,与液体药敏法检测结果具有较高的一致性(Kappa值=0.978)。对2 417例结核患者液体药敏结果进行分析,与同时对异烟肼和利福平耐药作为MDR-TB的诊断标准比较,利福平耐药作为MTB-TB筛查指标的灵敏度为100.00%,特异度为99.13%,阳性预测值为92.52%,阴性预测值为100.00%,两者Kappa值为0.957。结论 Xpert法可快速、准确检测利福平耐药性,至少在温州市可考虑将该法用于MDR-TB的快速筛查。     

荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究

目的对荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变方法进行临床研究,评价检测能力及在国境口岸的应用价值。方法应用荧光PCR熔解曲线法检测结核病人临床分离结核分枝杆菌,以传统药物敏感性试验为标准,获得该方法的灵敏性、特异性。结果对347例结核病人临床分离培养样本,传统药物敏感性试验检出271例利福平敏感标本,76例利福平耐药标本。荧光PCR熔解曲线法检出269例利福平敏感标本,78例利福平耐药标本,灵敏性为93.42%,特异性为97.42%,符合率为96.54%。结论荧光PCR熔解曲线法检测速度快速、灵敏度高、特异性强,可用于结核分枝杆菌利福平耐药突变的快速检测,适于国境口岸对耐多药结核病的快速筛查。     

基因芯片技术在新发涂阳肺结核患者结核杆菌菌种鉴定及药敏试验中的应用

目的探究分子芯片技术在新发涂阳肺结核患者结核杆菌菌种鉴定、药敏试验中的应用。方法入组526株菌株分离自2018年7月-2019年9月间下属7个县市区收治的新发涂阳结核患者,采用间隔区寡核苷酸分型法(Spoligotyping法)及基因芯片技术进行菌种鉴定,对鉴定为结核分枝杆菌的菌株采用绝对浓度法进行利福平、异烟肼药敏性分析,采用基因芯片技术对利福平耐药基因rpoB、异烟肼耐药基因katG、inhA突变位点进行检测,以Spoligotyping法、绝对浓度法作为金标准,分析基因芯片技术对结核杆菌菌种鉴定、药敏分析的应用价值。结果 526株分离株经Spoligotyping法鉴定,414株为结核分枝杆菌复合群,112株为非结核杆菌,其中胞内分枝杆菌57株,龟或脓肿分枝杆菌30株,鸟分枝杆菌25株;基因芯片法对结核分枝杆菌复合群鉴定符合度为100.00%,对非结核分枝杆菌鉴定符合度为95.54%。基因芯片技术共检出33株存在rpoB突变,突变频率最高的位点为531,占比为45.45%,其次为526位点,占比36.36%;共检出42株存在katG/inhA突变,其中78.57%为katG单一位点突变,19.05%为inhA单一位点突变,2.38%为katG、inhA双突变。基因芯片技术诊断利福平耐药的敏感度、特异度、准确度分别为90.90%、99.21%、98.54%,两者一致性Kappa值为0.901;对异烟肼耐药分析的敏感度、特异度、准确度分别为65.08%、99.72%、94.44%,两者一致性Kappa值为0.751;对多药耐药分析的敏感度、特异度、准确度分别为90.48%、99.23%、98.79%,两者一致性Kappa值为0.877。结论基因芯片技术可较好的鉴别结核分枝杆菌菌种及耐药性,与常规菌培养、药敏试验结果具有较高的一致性。     

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐药性价值及耐药特征分析

目的 评价荧光PCR熔解曲线法(熔解曲线法)对结核分枝杆菌(MTB)耐药性检测价值。方法 采用熔解曲线法与传统液体药敏法同时检测156例临床分离培养MTB对抗结核药物利福平(RFP)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(SM)和氟喹诺酮类药物耐药情况,并对2种检测方案结果进行比较。结果 与液体药敏检测相比,熔解曲线法对5种抗结核药物耐药性检测结果差异无统计学意义(P> 0.05),以液体药敏检测为金标准,熔解曲线法检测RFP、INH、EMB、SM以及氟喹诺酮类药物耐药性的灵敏度分别为100.00%、75.86%、61.54%、75.00%、90.00%,特异度分别为97.10%、95.28%、99.30%、96.21%、100.00%,Kappa值分别为0.885、0.721、0.707、0.724、0.944,表明2种检测方法一致性好。结论 荧光PCR熔解曲线法对抗结核药物RFP、INH、EMB、SM及氟喹诺酮类的耐药性与液体药敏法检测效果一致,灵敏度、特异度均较高,具有较好的临床应用价值。     

荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究

目的 对荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变方法进行临床研究,评价其检测效能及在国境口岸应用价值.方法 应用荧光PCR熔解曲线法检测结核病人临床分离标本,与传统药物敏感性试验对比,衡量该方法的灵敏度、特异性.结果 对347例结核病人临床分离培养样本,药敏试验检出271例利福平敏感标本,76例利福平耐药标本;...     

PCR熔解曲线法筛查结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药性

目的 利用PCR熔解曲线法快速筛查结核分枝杆菌(MTB)对链霉素、乙胺丁醇耐药性,并与药敏试验结果比较,评价其应用价值.方法 收集深圳市2007-2009年331株MTB临床分离株,应用PCR熔解曲线法检测embB基因306、378～380、406和497、rpsL基因43、88及rrs基因513～517、905 ～ 908位点耐药突变,并与药敏试验结果比较.结果 以药敏试验结果为标准,PCR熔解曲线法检测MTB链霉素耐药突变的敏感性为78.6％、特异性为90.1％、准确性为86.7％;检测MTB乙胺丁醇耐药突变的敏感性为83.0％、特异性为93.3％、准确性为91.8％.PCR熔解曲线法与药敏试验检测结果具有很好的一致性.结论 PCR熔解曲线法能够快速、特异地检测MTB对链霉素、乙胺丁醇耐药突变,可用于临床筛查.     

基因芯片技术在雅安市结核分枝杆菌耐药检测中的应用

目的评价基因芯片技术在雅安市结核分枝杆菌耐药检测工作中的应用价值。方法收集2016-06/2018-11雅安市结核病可疑患者痰培养分离株190株进行基因芯片菌种鉴定、耐药检测和比例法药敏试验。以比例法药物敏感试验为金标准,分析基因芯片技术检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼和耐多药诊断的敏感度、特异度、正确指数。采用McNemar检验比较两方法有无差异;采用Kappa检验比较两方法的一致性。两方法有差异的部分样本用基因测序的方法进行比对。结果基因芯片技术进行菌种鉴定,190株分离株中,有186株为结核分枝杆菌,4株为非结核分枝杆菌。以传统比例法药敏试验为金标准,186株结核分枝杆菌对利福平检测的敏感度和特异度为90.0%和96.6%,正确指数为0.866;对异烟肼检测的敏感度和特异度分别为89.5%和99.4%,正确指数为0.889;对耐多药的敏感度和特异度分别75.0%和99.4%,正确指数0.744。两种检测方法比较差异均无统计学意义(McNemar检验,P值分别为0.125、1.000和1.000)。两种检测方法具有较高的一致性(Kappa值分别为0.701、0.910、0.792)。基因芯片技术检测利福平耐药相关rpoB基因突变率最高的位点为531;异烟肼耐药相关katG基因主要突变位点为315。结论基因芯片技术与比例法药敏试验具有较好的一致性,灵敏度高、特异性好,是一种值得推广的耐药结核病诊断方法,在地市级结核病检测中具有重要的应用价值。     

Xpert MTB/RIF检测技术用于耐多药结核分枝杆菌利福平耐药检测分析

目的了解利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF)用于福建省耐多药结核病(MDRTB)利福平耐药检测的可行性。方法对来源于福建省结核病耐药性监测30个监测点纳入的79株耐多药和40株全敏感结核分枝杆菌分离菌株进行Xpert MTB/RIF检测,同时用PCR测序验证是否存在利福平耐药位点突变。结果119株菌Xpert MTB/RIF检测结果均为结核分枝杆菌。以比例法药物敏感试验结果作为对照,Xpert MTB/RIF检测MDR结核分枝杆菌利福平耐药的敏感度为97.47%(77/79),特异度为100.00%(40/40),Xpert MTB/RIF检测结果与PCR测序结果的一致性达到100%。结论 Xpert MTB/RIF方法用于耐多药结核分枝杆菌利福平耐药检测的意义较大,可用于福建省MDR-TB的快速筛查。     

用聚合酶链反应单链构象多态性分析技术检测结核分枝杆菌L型的rpoB基因突变

目的：探索结核分枝杆菌L型的耐药基因rpoB突变与利福平耐药性的关系，以及聚合酶链反应单链构象多态性分析（PCR-SSCP）技术的临床应用价值。方法：收集结核分枝杆菌L型菌株52株，采用PCR-SSCP方法检测rpoB基因，与采用常规药敏试验法检测利福平耐药的结果进行对比分析。结果：采用常规法检测，52株临床分离株中有38株利福平耐药，耐药率为73.08%（38/52）；PCR-SSCP方法对52株临床耐药株rpoB基因突变的检出率为65.38%（32/52），两种方法检测耐利福平的符合率为84.21%。结论：PCR-SSCP对利福平耐药的结核分枝杆菌L型菌株检出率较高，将其与常规药敏试验联合应用，是一种指导临床用药的好方法。     

Xpert MTB/RIF技术对结核分枝杆菌检测和耐多药结核快速筛查的研究

目的探讨Xpert MTB/RIF技术检测涂阳痰标本结核分枝杆菌和利福平耐药性的效能,分析该技术在不同利福平耐药率患者中进行耐多药结核诊断的应用价值。方法连续纳入769例涂阳肺结核患者的痰标本,分别进行涂片镜检、固体培养、分枝杆菌初步菌型鉴定、比例法药敏试验和Xpert MTB/RIF检测。结果 Xpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌的灵敏度为98.15%,特异度为70.00%。检测利福平耐药性与比例法药敏结果比较,Kappa值为0.859,灵敏度为93.04%,特异度为95.71%,复治涂阳患者特异度低于初治涂阳患者,阳性预测值和阴性预测值分别为85.47%和98.07%。结论 Xpert MTB/RIF技术能够快速检测出涂阳痰标本中结核分枝杆菌和利福平耐药性,具有较高的灵敏度和特异度。在云南省用于耐多药结核病患者快速筛查时,优先用于利福平耐药率较高的定点医院以及罹患耐多药高危人群。     

Xpert MTB/ RIF技术在贵州地区耐药结核病诊断中的应用价值

目的:探讨利用Xpert MTB/RIF技术直接快速检测结核分枝杆菌利福平药物敏感性的可行性及作为新的分子药敏试验方法的应用价值。方法:选取贵州地区耐药监测点分离培养的阳性菌株217株,用Xpert MTB/RIF技术和国际标准比例法同时检测,比较一致性,评价Xpert MTB/RIF技术的敏感度及特异度。结果:检测利福平耐药的灵敏度为100%,特异度为100%。结论:Xpert MTB/RIF技术可用于结核分枝杆菌利福平药物敏感性的直接快速检测,是快速发现耐药结核分枝杆菌的有效方法。     

线性探针技术在四川地区结核分枝杆菌耐药检测中的应用评价

目的评估线性探针技术(LPA)在四川地区结核分枝杆菌耐药检测中的应用价值。方法对2014-04收集的297例分枝杆菌分离培养物进行传统比例法药敏实验和线性探针检测,分析线性探针技术检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼耐药性及MDR-TB的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、一致性及Kappa值。结果以传统比例法药敏为金标准,线性探针技术检测利福平耐药情况的灵敏度为90.00%,特异度为96.08%,阳性预测值为78.26%,阴性预测值为98.39%,一致性为95.25%,Kappa值为0.81;检测异烟肼耐药情况的灵敏度为85.00%,特异度为97.87%,阳性预测值为91.07%,阴性预测值为96.23%,一致性为95.25%,Kappa值为0.85;检测MDR-TB的灵敏度为88.46%,特异度为97.40%,阳性预测值为76.67%,阴性预测值为98.87%,一致性为96.61%,Kappa值为0.80。利福平耐药菌株中,rpoB主要突变位点为531、526和516,异烟肼耐药菌株的主要突变位点为katG S315T1。结论线性探针技术能够快速准确的检测利福平、异烟肼的药物敏感性,有利于耐多药结核病的快速筛查和诊断。在基层应用时应加强管理和人员培训。     

基因芯片技术对结核分枝杆菌耐药性检测的临床应用

目的评价基因芯片技术对结核分枝杆菌耐药性检测的效果。方法选取我院结核科2014年3月至2016年3月收治的涂片阳性的肺结核住院患者238例,取其痰标本,分别用基因芯片、传统的罗氏培养和药敏试验3种方法进行结核分枝杆菌的异烟肼耐药性检测和利福平耐药性检测;把罗氏培养和药敏试验的结果作为金标准,评价基因芯片技术的临床应用价值。结果基因芯片技术检测涂片阳性患者痰标本异烟肼耐药的情况与金标准无显著差异(P>0.05);利福平耐药的情况与金标准相比也无明显差异(P>0.05)。结论基因芯片能够快速、准确地检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药情况,是一种值得推广的临床实验室检测方法。     

Xpert MTB/RIF检测技术在结核病患者痰标本中的应用价值分析

目的评价Xpert MTB/RIF技术对临床标本中结核分枝杆菌及利福平耐药检测的应用价值。方法对80份痰标本采用Xpert MTB/RIF系统进行结核分枝杆菌与利福平耐药基因rpoB的突变检测,以培养结果及表型药敏试验为金标准,判断Xpert MTB/RIF检测的敏感度、特异度、95%CI。结果对临床确诊为结核病患者的80份临床标本中,Xpert MTB/RIF系统的结核分枝杆菌阳性检出率为76.2%;42份培养阳性标本中,Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的敏感度为97.6%;38份培养阴性标本中,Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的敏感度为52.6%;以传统表型药敏试验为金标准,采用Xpert MTB/RIF系统行利福平耐药性检测的敏感度为95.4%,特异度为95.1%。结论 Xpert MTB/RIF是一种简便、快速、准确,且能够同时对结核临床标本行结核分枝杆菌检测与利福平耐药性检测的分子检测技术,对及时发现病情与耐药结核病患者诊断具有重要价值。     

应用基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药基因

目的应用基因芯片快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变和耐异烟肼katG、inhA基因突变,建立一种新的分子药敏试验方法。方法根据结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA基因序列设计探针并制作DNA芯片,PCR掺入法荧光标记,结核分枝杆菌基因突变位点的目的片断与DNA芯片杂交,同时以传统药敏试验和DNA测序法为对照。结果 70株结核分枝杆菌临床分离株中,20株药物敏感株芯片杂交结果与标准株完全相同;30株耐RIF临床分离株均检测到rpoB基因突变;50株异烟肼耐药株中有41株检测到katG基因突变,9株检测到inhA基因突变,与测序结果完全一致。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌分离株的rpoB、katG、inhA基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药。     

PCR-线性探针杂交酶显色法在结核病诊断与耐药性检测中的应用研究

目的对比PCR-线性探针杂交酶显色法(简称线性探针法)与BACTEC MGIT960液体培养及药敏在结核分枝杆菌检出率的差异,评价两种方法检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的应用效果。方法选取医院结核科2013年8月-2015年5月369例确诊及疑似结核病的住院患者送检标本,同时采用线性探针法和BACTEC MGIT960对其进行结核分枝杆菌及利福平和异烟肼耐药性检测,数据采用SPSS 13.0软件进行统计分析。结果线性探针法检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的灵敏度为90.4%、特异度为97.3%、Kappa值为0.872;对异烟肼耐药性检测的灵敏度为86.6%、特异度为96.3%、Kappa值为0.841,两种方法在利福平和异烟肼耐药性检测中具有较好的一致性。结论 PCR-线性探针杂交酶显色法是一种快速、准确的结核分枝杆菌及其对利福平和异烟肼耐药性的诊断方法,对耐多药结核病的快速诊断具有显著的优点。     

PCR-SSCP检测结核分枝杆菌利福平耐药性

目的:建立PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变。方法:用比例法筛选出70株耐利福平结核分枝杆菌临床分离株,用PCR-SSCP方法检测菌株ropB基因突变,并与比例法检测结果进行对比。结果:70株耐利福平菌株中,单耐利福平菌株为12株,同时耐福平和异烟肼菌株为58株。扩增菌株rpoB基因,70株结核分枝杆菌临床分离株ropB基因突变率为91.43%(64/70),其中,耐多药菌株ropB基因突变率为91.38%(53/58),单耐利福平菌株ropB基因突变率为91.67%(11/12)。结论:用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌RFP耐药性所用时间大幅缩短,检测出的结果与传统方法一致率高,但结核分枝杆菌表型耐药菌株,存在rpoB基因位点无突变的现象,是否存在其他耐药位点或耐药机制,值得深入研究。     

Gene Xpert MTB/RIF检测在复治肺结核诊治中的应用

目的探讨利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(Gene Xpert MTB/RIF)在复治肺结核诊断及治疗中的应用价值。方法回顾性分析2016年1月至2017年6月期间广州市胸科医院住院病人中238名疑似结核复发患者的Gene Xpert MTB/RIF、痰或支气管灌洗液培养及传统药敏试验、涂片结果,并进行对比分析。结果 238名患者中其中诊断为肺结核复发80例,非活动性肺结核158例,其中22例合并非结核分枝杆菌感染。应用Gene Xpert MTB/RIF诊断肺结核复发的敏感度为86. 25%,特异性为91. 12%,较传统涂片法有更高的敏感度。但特异性低于培养法,有8. 87%非活动性肺结核患者Xpert检测仍为阳性。63例结核培养阳性患者的药敏结果显示,Gene Xpert MTB/RIF检测利福平耐药性与传统药敏结果一致率达95. 31%,差异无统计学意义(P <0. 05),一致性比较Kappa值=0. 90。结论 Gene Xpert MTB/RIF作为判断结核复发诊断标准其敏感度优于涂片法,但存在假阳性及死菌干扰可能,作为单一确诊结核复发依据需谨慎。对于判断利福平耐药性与传统药敏试验效果相当,但检测过程更简单、快捷,有利于复治肺结核患者的早期发现及耐药性判断、指导治疗。