稳定干扰长链非编码RNA LINC01224结直肠癌细胞株的建立及其对细胞凋亡的影响

目的 建立稳定干扰长链非编码RNA(lncRNA) LINC01224表达的结直肠癌LoVo和SW620细胞株,并探讨下调LINC01224表达对结直肠癌细胞凋亡的影响。方法 使用GEPIA2数据库分析LINC01224在结直肠癌组织中的表达情况;qPCR法检测LINC01224在10种人结直肠癌细胞中的表达水平。3种不同的LINC01224 siRNA分别转染人结直肠癌LoVo细胞,取抑制LINC01224表达效果最显著的siRNA序列构建LINC01224 shRNA慢病毒载体。在HEK293T细胞内包装成重组慢病毒颗粒,再感染LoVo和SW620细胞,经嘌呤霉素筛选后以有限稀释法获得稳定干扰LINC01224的单克隆细胞。MTS法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 LINC01224在结直肠癌组织中的表达高于正常结直肠组织,其在10种结直肠癌细胞中的表达也高于正常结直肠上皮细胞HCOEPic。siRNA-3对LoVo细胞内LINC01224表达的抑制率高于siRNA-1和siRNA-2。故选择siRNA-3设计LINC01224 shRNA。与对照组(sh-NC组)...     

调控CIAPIN1基因表达对食管癌细胞生长及侵袭性的影响

目的 采用重组慢病毒CIAPIN1表达载体和CIAPIN1沉默载体感染食管癌EC9706细胞,观察调控CIAPIN1基因表达对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及体外侵袭转移的影响.方法 构建CIAPIN1表达慢病毒载体和CIAPIN1 siRNA慢病毒载体,包装得到重组慢病毒;分别感染食管癌EC9706细胞,筛选得到稳定C...     

Down-regulation of VEGF-C Expression in MCF-7 Breast Cancer Cells With Lentivirus-mediated Small Interfering RNA Vectors and Its Effect on Cell Proliferation

目的 研究慢病毒载体介导的siRNA对乳腺癌MCF-7细胞系血管内皮生长因子(VEGF-C)表达的敲减作用及对乳腺癌增殖和凋亡的影响.方法 构建慢病毒VEGF-C/siRNA载体,转染乳腺癌MCF-7细胞,观察其转染效率,采用实时定量PCR检测MCF-7细胞在转染前后VEGF-C的mRNA表达,计算VEGF-C敲减率,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡.结果 慢病毒VEGF-C/siRNA转染效率超过80%,VEGF-C的mRNA表达敲减率达50%,MTT结果提示慢病毒VEGF-C/siRNA能有效抑制细胞增殖,流式细胞学实验结果提示VEGF-C/siRNA干扰后S期细胞明显减少,G0/G1期细胞显著增加,细胞凋亡增加.结论 慢病毒VEGF-C/siRNA转染率高,能有效敲减VEGF-C的mRNA表达,使细胞增殖受到抑制,凋亡增加.     

siRNA干扰乳腺癌MCF-7细胞VEGF-C表达及对细胞增殖影响的研究

目的研究慢病毒载体介导的siRNA对乳腺癌MCF-7细胞系血管内皮生长因子(VEGF-C)表达的敲减作用及对乳腺癌增殖和凋亡的影响。方法构建慢病毒VEGF-C/siRNA载体,转染乳腺癌MCF-7细胞,观察其转染效率,采用实时定量PCR检测MCF-7细胞在转染前后VEGF-C的mRNA表达,计算VEGF-C敲减率,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡。结果慢病毒VEGF-C/siRNA转染效率超过80%,VEGF-C的mRNA表达敲减率达50%,MTT结果提示慢病毒VEGF-C/siRNA能有效抑制细胞增殖,流式细胞学实验结果提示VEGF-C/siRNA干扰后S期细胞明显减少,G0/G1期细胞显著增加,细胞凋亡增加。结论慢病毒VEGF-C/siRNA转染率高,能有效敲减VEGF-C的mRNA表达,使细胞增殖受到抑制,凋亡增加。     

人全长PLCγ1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCγ1基因真核表达载体,以便进一步研究PLCγ1的作用及其机制。方法自行设计一对带有HindⅢ和NotⅠ酶切位点的引物,采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCγ1cDNA(3878bp),纯化后,经HindⅢ-NotⅠ酶切,插入真核表达载体pLNCX2中,构建重组质粒pLNCX2/PLCγ1。通过PCR,限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后,利用RT-PCR及Westernblotting转染后LoVo细胞中PLCγ1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经HindⅢ-NotⅠ酶切后,得到3878bp(PLCγ1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段,同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后,得到约1300bp及约8500bp两个片段,与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westernblot分析证实转染pLNCX2/PLCγ1的LoVo细胞中PLCγ1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCγ1基因真核表达载体pLNCX2/PLCγ1,为进一步研究PLCγ1的作用奠定了基础。     

Mdm2 siRNA诱导LoVo细胞凋亡的研究

目的研究mdm2 siRNA (small interfering RNA)在诱导结直肠癌LoVo细胞凋亡的作用.方法将mdm2 siRNA转染入LoVo中,通过RT-PCR和Western blot技术检测mdm2 mRNA及MDM2蛋白表达水平,应用生长曲线、流式细胞技术、TUNEL技术及MTT来检测mdm2 siRNA诱导LoVo细胞凋亡的效应.结果转染mdm2 siRNA后的LoVo细胞中mdm2基因mRNA水平及MDM2蛋白表达水平明显减低;细胞的增殖受到明显的抑制;mdm2 siRNA在凋亡早期及晚期中均可发挥明显诱导作用;MTT观察可见药物顺铂对对照组细胞的半数抑制浓度是联合应用mdm2 siRNA后的5.33倍.结论 mdm2 siRNA能够有效的抑制mdm2基因的表达进而诱导结直肠癌LoVo细胞的凋亡,并且增加了LoVo细胞对细胞毒药物顺铂的敏感性.     

调控CIAPIN1基因表达对食管癌细胞生长及侵袭性的影响

目的 采用重组慢病毒CIAPIN1表达载体和CIAPIN1沉默载体感染食管癌EC9706细胞,观察调控CIAPIN1基因表达对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡及体外侵袭转移的影响。 方法 构建CIAPIN1表达慢病毒载体和CIAPIN1 siRNA慢病毒载体,包装得到重组慢病毒;分别感染食管癌EC9706细胞,筛选得到稳定CIAPIN1基因高表达和低表达的细胞。实验分为CIAPIN1表达组、CIAPIN1 siRNA组、无关siRNA对照组和空白对照组。采用RT-PCR和蛋白质印迹法分析CIAPIN1基因和蛋白的表达,MTT实验检测细胞增殖,流式细胞术(FCM)分析细胞周期及细胞凋亡的变化, Boyden小室检测细胞侵袭转移。 结果 与空白对照组、无关siRNA对照组和CIAPIN1 siRNA组比较,CIAPIN1高表达组细胞生长受到抑制(P<0.05);S和G₂/M期细胞比例减少,G₀/G₁期细胞比例增加(P<0.05);平均细胞凋亡率增加(P<0.05),穿透Matrigel的平均细胞数减少(P<0.05)。 结论 以慢病毒为载体介导的CIAPIN1基因高表达可有效抑制食管癌EC9706细胞增殖、促进细胞凋亡和降低细胞侵袭迁移能力。     

沉默PHF8重组慢病毒的制备及其对食管鳞癌细胞增生的影响

目的 制备锌指蛋白8（plant homeodomain finger protein 8,PHF8）RNA干扰（RNA interference,RNAi）重组慢病毒（lentivirus）颗粒,建立PHF8表达沉默的人食管鳞癌（esophageal squamous-cell carcinoma,ESCC）稳定细胞系并观察PHF8对细胞增生的影响.方法将目的 基因或阴性对照短发卡RNA（short hairpin RNA,shRNA）载体与包装载体共转染病毒包装细胞293T,收集并浓缩上清液获得重组慢病毒;测定病毒滴度后用于感染食管鳞癌细胞;通过荧光显微镜及流式细胞仪观察感染效率,嘌呤霉素筛选法建立稳定细胞系;定量PCR及Western Blotting检测PHF8的表达沉默;MTS法检测细胞的增生特性.结果成功制备了沉默PHF8的重组慢病毒;应用重组病毒感染食管鳞癌细胞后,PHF8 mRNA 和蛋白的表达水平显著降低,细胞的增生明显下降.结论慢病毒介导的shRNA干扰能有效抑制食管鳞癌细胞的PHF8表达及细胞增生.     

慢病毒介导的FLOT2基因沉默影响结肠癌细胞生物学功能的影响及机制

目的 构建干扰FLOT2表达的慢病毒载体,探讨抑制FLOT2表达对结肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响及机制.方法 通过qRT-PCR检测结直肠癌组织及人结肠癌LoVo、SW480及HT29细胞FLOT2的表达水平,Western blot检测结肠癌细胞FLOT2表达.将含FLOT2 siRNA的慢病毒载体转染结肠癌...     

慢病毒载体介导HIF1α稳定表达A549细胞系构建

目的 利用慢病毒载体系统构建稳定表达HIF1α的A549细胞系.方法 以NCBI人HIF1α基因编码序列为模板,设计并合成引物,PCR法扩增HIF1α.酶切回收的HIF1α片段与制备的慢病毒载体HBLV-RFP-Puro重组反应.PCR和基因测序鉴定重组质粒.重组质粒和辅助质粒共转染293T细胞.包装好的病毒经过滤、浓缩后,利用稀释计数法测定病毒滴度.制备好的慢病毒感染A549细胞,采用药物筛选稳定转染细胞系.荧光显微镜及Western blot检测观察转染及筛选效果.结果 PCR扩增HIF1α片段经鉴定成功,重组质粒经PCR、基因测序鉴定构建成功.成功包装获得高滴度LV-HIF1α.LV-HIF1α感染A549细胞后经药物筛选,荧光显微镜下细胞带有红色荧光,Western blot结果显示LV-HIF1α组HIF1α的表达水平明显高于对照组.结论 慢病毒载体介导HIF1α稳定表达的A549细胞系构建成功.     

PUMA在奥沙利铂治疗大肠癌中作用机制的实验研究

目的：研究凋亡相关基因PUMA在奥沙利铂（oxaliplatin）治疗大肠癌药物机制中的作用,为更好地发挥奥沙利铂的抗肿瘤作用提供实验基础。方法：蛋白印迹法检测在大肠癌LoVo细胞株中奥沙利铂对PUMA蛋白表达的诱导作用;构建稳定表达反义PUMA基因的重组质粒及细胞系;流式细胞术检测细胞凋亡,MTT法测定细胞增殖。结果：成功构建表达反义PUMA基因的重组质粒及细胞系;在大肠癌LoVo细胞株中,奥沙利铂可以诱导PUMA的表达,并在一定范围内呈时间和剂量依赖关系;在PUMA的表达受抑制后,奥沙利铂诱导大肠癌细胞凋亡的作用明显减弱。结论：PUMA的表达在奥沙利铂诱导LoVo细胞凋亡的过程中具有重要作用,PUMA表达的抑制会降低大肠癌LoVo细胞对奥沙利铂治疗的敏感性。     

Smo siRNA对LoVO细胞Smo基因表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的 研究Smoothened (Smo)小干扰RNA(siRNA)对结直肠癌LoVo细胞Smo基因表达,以及LoVo细胞增殖与凋亡的影响.方法 设计针对目标基因的siRNA.阳性脂质体介导转染LoVo细胞,半定量RT-PCR检测转染后LoVo细胞的Smo mRNA水平,MTT法和流式细胞术检测转染后LoVo细胞的增殖水平及细胞凋亡率.结果 siRNA-1、siRNA-2均能抑制LoVo细胞Smo基因的表达,siRNA-1抑制作用最明显,达63.56%,siRNA-2抑制作用为46.54%,两组与隐性对照组相比.差异均具有显著性.siRNA-1转染LoVo细胞后,细胞增殖水平较隐性对照组显著降低(P＜0.05);转染48 h后,细胞凋亡率较隐性对照组显著升高(P＜0.05).结论 Smo siRNA能有效地抑制结直肠癌LoVo细胞Smo基因表达,可以降低LoVo细胞的增殖水平,诱导细胞的凋亡.     

慢病毒介导RNA干扰Clusterin基因表达载体的构建及其在肾癌786-O与ACHN细胞系中的表达

目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,建立Clusterin(CLU)基因稳定干扰的人肾癌细胞系,为CLU基因的功能研究奠定基础.方法:以人CLU mRNA编码序列作为干扰靶点,与pGCSIL-GFP载体连接真核表达载体.另外构建不针对任何已知mRNA的阴性对照shRNA表达质粒.利用包装细胞293T获得重组慢病毒,分别感染人肾癌786-O细胞株及ACHN细胞株.应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别CLU表达的变化.结果:成功构建CLU shRNA慢病毒载体CLU-RNAi-LV并获得相应的慢病毒,病毒悬液滴度＞4×1011TU/L.Real Time-PCR、Western blot结果显示干扰组CLU mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低.结论:慢病毒介导的CLU基因干扰能稳定有效地表达于肾癌细胞,筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株.     

靶向血管内皮生长因子受体3基因的小干扰RNA表达载体构建及其生物学效应

目的构建靶向血管内皮生长因子受体3（VEGFR-3）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体（psiRNA-VEGFR-3）,并观察其抑制人结肠癌细胞株LoVo细胞中VEGFR-3基因表达的效果及生物学效应。方法设计并合成1对VEGFR-3编码基因的反向重复序列,定向克隆至载体pSUPER,构建siRNA真核表达载体,利用脂质体2000将构建的psiRNA-VEGFR-3载体转入LoVo细胞中,应用半定量RT-PCR检测基因转染前后VEGFR-3mRNA表达水平的变化,四甲基偶氮唑蓝法观察细胞生长变化、凋亡率及细胞周期的变化。结果成功构建针对VEGFR-3基因的siRNA表达载体。psiRNA-VEGFR-3可显著抑制LoVo细胞中VEGFR-3基因的表达（P〈0．01）;转染psiRNA-VEGFR-3后能够诱导LoVo细胞发生明显凋亡。结论psiRNA-VEGFR-3载体能够在LoVo细胞中引发RNA干扰效应,通过下调VEGFR-3基因表达可以抑制细胞增殖,诱导LoVo细胞发生明显凋亡。     

精氨酸甲基转移酶CARM1 shRNA慢病毒表达质粒的构建及稳定敲低CARM1的小鼠畸胎瘤P19细胞系的建立

目的 构建慢病毒表达小鼠CARM1基因shRNA的质粒,观察其在小鼠畸胎瘤P19细胞中对CARM1的表达抑制效率.验证CARM1 shRNA慢病毒表达质粒,进一步筛选得到稳定敲低CARM1的小鼠畸胎瘤P19细胞系.方法 设计并且合成针对小鼠CARM1 mRNA不同部位的4组shRNA序列,以Age Ⅰ和EcoR Ⅰ克隆入pLKO.1慢病毒载体中,得到含shRNA的慢病毒表达质粒.氨苄青霉素筛选后,DNA测序鉴定结果.鉴定正确的质粒大量制备后,与慢病毒包装辅助质粒psPAX2、pMD2.G共同转染HEK293T细胞,包装得到具有感染能力的慢病毒.将含病毒的培养基上清感染P19细胞后,经嘌呤霉素筛选获得CARM1稳定敲低的P19细胞系,并用Western blot法和实时荧光定量PCR进行鉴定.结果 测序鉴定表明4组CARM1 shRNA慢病毒表达质粒构建成功.Western blot法检测和实时荧光定量PCR分析结果显示4组CARM1 shRNA慢病毒表达载体中的2组可有效地抑制小鼠畸胎瘤P19细胞中CARM1基因的表达,即pLKO.1/CARM1 shRNA2、pLKO.1/CARM1 shRNA3有明显的抑制效果.结论 成功构建了针对CARM1基因的shRNA的慢病毒表达质粒并筛选得到稳定敲低CARM1表达的P19细胞系,为进一步研究CARM1基因的功能奠定了基础.     

靶向蛋白酪氨酸磷酸酶1B小分子干扰RNA对结肠癌LoVo细胞增殖和成瘤能力的影响

目的:探讨沉默蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因的RNA干扰对人结肠癌LoVo细胞增殖和成瘤能力的影响。方法:应用小分子干扰RNA(siRNA)技术沉默PTP1B的表达(shRNA-PTP1B),采用逆转录聚合酶链反应和Western Blot分别在mRNA和蛋白水平检测抑制效果。CCK-8被用于检测沉默PTP1B表达对肿瘤细胞增殖的影响。在体外实验的基础上建立裸鼠模型,建立稳定表达干扰RNA细胞系,观察干扰RNA稳定表达对人结肠癌裸鼠移植成瘤的影响。结果:shRNA-PTP1B有效沉默LoVo细胞PTP1B mRNA及蛋白的表达,成功筛选shRNA-PTP1B稳定表达细胞株LoVo/shRNA细胞。在体外试验中与对照组比较LoVo/shRNA细胞的增殖能力明显下降。LoVo/shRNA细胞裸鼠移植成瘤体积,明显减小(P均<0.05)。结论:shRNA-PTP1B可以沉默人结肠癌PTP1B基因的表达,显著抑制LoVo细胞的增殖,降低LoVo细胞的成瘤能力。     

慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

慢病毒载体的构建及低表达和过表达CEA EC9706细胞株的建立

目的:构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒siRNA和表达载体并包装成感染性病毒颗粒,获得稳定低表达和过表达CEA的EC9706细胞.方法:构建CEA siRNA载体:依据siRNA靶序列设计原则,针对人CEA的cDNA序列,设计并合成编码siRNA的3对寡核苷酸序列,克隆入siRNA载体(pRNAT-U6.2/Lenti)中构建3个重组体pRNAT-U6.2-SCEA.构建CEA表达载体:以人CEA的测序质粒为模板,PCR扩增CEA全长,装入pLentiGFP转移质粒,经过测序证实其序列与标准序列完全一致.然后进行重组慢病毒分剐感染EC9706细胞,G418筛选得到稳定感染细胞株.分别用荧光定量Real-time RT-PCR和Western blot检测EC9706细胞中CEA基因表达抑制或增强的效果.结果:EC9706病毒感染48 h后荧光显微镜观察CEA慢病毒载体在细胞中高效表达.经过RTPCR和Western-blot验证:得到3株稳定CEA低表达的EC9706细胞株,其中一个CEA的表达几乎得到完全抑制,1株稳定CEA过表达的EC9706细胞株(EC9706-CEA).结论:建立了稳定低表达和过表达CEA的EC9706细胞株,成功调控食管癌EC9706细胞中CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.     

靶向Bi-1基因的重组慢病毒载体构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 慢病毒载体技术已被广泛应用于基因功能分析、信号转导通路和基因治疗的研究.文中应用慢病毒系统构建凋亡抑制基因Bi-1的慢病毒表达载体并检测其在NIH3T3细胞中的表达,为后续的以Bi-1基因为靶点的肿瘤基因治疗研究奠定基础. 方法 根据慢病毒表达载体酶切位点的特征序列设计PCR扩增引物并扩增人Bi-1cDNA,并采用DNA重组技术定向克隆至pLCMV-IG质粒中,构建重组慢病毒载体质粒pLCMV-IG-Bi-1,经PCR、双酶切和测序鉴定后,包装慢病毒感染至小鼠成纤维细胞株NIH3T3中,RT-PCR及Western-blot 分别检测NIH3T3细胞中Bi-1基因和蛋白的表达. 结果 PCR、酶切及测序结果 表明重组慢病毒载体构建成功;NIH3T3细胞感染重组载体包装的慢病毒后出现明显的Bi-1基因高表达. 结论 成功构建靶向Bi-1基因的重组慢病毒载体,为进一步研究Bi-1基因对细胞生长转化的影响提供了实验依据.     

稳定表达GFP-C-Daam1的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系的建立

目的:构建稳定表达GFP和GFP-C-Daam1的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,以便进一步研究Daam1对乳腺癌细胞迁移能力的影响。方法:构建表达GFP和GFP-C-Daam1的慢病毒载体,通过慢病毒感染获取稳定表达目的基因的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系。用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞系,Western blot确定重组蛋白表达,并用Boyden chamber小室实验检测细胞运动能力的改变。结果:通过慢病毒感染,建立了稳定表达GFP-C-Daam1的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,该细胞系具备更强的内在运动能力,表明目的基因的表达产物功能正常。结论:用慢病毒载体可以构建稳定表达GFP-C-Daam1的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,从而得到研究活化的Daam1的可靠细胞膜型。