在大肠杆菌表达体系中以包涵体形式存在的真核生物蛋白质的分离…

在大肠杆菌中表达的含义二硫键真核生物的重组蛋白，往往以包涵体的形式存在，存在于包涵体的重组蛋白，因分子内及分子间二硫键的错配，而常常导致重组蛋白无生物活性，着重介绍了一些从包涵体中分离在正确配对的二硫键重组蛋白新的技术条件，总结了含有二硫键真核生物重组蛋白的不同分离和复性步骤及方法，并对重组蛋白在体外折叠的机理进行了探讨。     

包涵体蛋白质的复性研究进展

外源基因在大肠杆菌中高效表达时,通常会形成不溶性、无活性的蛋白聚集体——包涵体。包涵体中富含表达的重组蛋白质,它们经分离、洗涤、变性溶解以及复性等过程才能得到具有生物活性的蛋白质。近年来,随着对包涵体体外复性机制的深入研究,从包涵体中复性重组蛋白质已经有了很多的策略和方法。文章就有关工作的进展进行了综述。     

重组人血管抑素(rhAGN)包涵体变性与复性初探

在优化的培养条件下，进行rhAGN 5L罐发酵-菌体干重由原摇瓶发酵的3．02g／L增加到8.06g／L，表达量依然稳定在35％；对所产生的包涵体进行溶解变性研究，确定较佳变性缓冲液组成为8mol／L，尿素50mmol／L Tris-HCl，20mmol／LDTT，pH值8．0；凝胶过滤色谱复性效果相对较好，蛋白浓度4．28μg/ml(IC50)时对HEMC细胞的抑制活性达50．1％。     

重组人血管生长素包涵体复性条件研究

目的摸索重组人血管生长素(rhANG)复性影响条件,以提高rhANG的复性效率。方法超声波破碎菌体,变性萃取rhANG包涵体。分析rhANG包涵体起始浓度、氧化型、还原型谷胱甘肽比例、盐酸胍和添加精氨酸对复性的影响。结果在0.1 mol/L Tris-HCl pH 7~8,还原型、氧化型谷胱甘肽比率为5,盐酸胍为0.2~0.5 mol/L,起始蛋白质浓度0.1~0.2 mg/mL时,rhANG蛋白复性率为60%;0.5 mol/LL-精氨酸有助于复性。结论初步优化rhANG包涵体复性参数,为rhANG的放大制备创造了条件。     

从EDTA处理的重组E.coil中分离纯化重组人SOD包涵体

以金属离子螯合剂乙胺四乙酸(EDTA)代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放,并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体,纯度为65%.采用透析法复性包涵体,经凝胶色谱纯化后,目的蛋白纯度约为90%,酶比活力为5400 u/(mg蛋白).     

从EDTA处理的重组E.coli中分离纯化重组人SOD包涵体

以金属离子螯合剂乙二胺四乙酸（EDTA）代替超声法使重组大肠杆菌菌体释放,并提取重组人超氧化物歧化酶包涵体,纯度为65％。采用透析法复性包涵体,经凝胶色谱纯化后,目的蛋白纯度约为90％,酶比活力为5400u／（mg蛋白）。     

重组人超氧化物歧化酶包涵体的复性和纯化

当工程菌接种量为3％～5％，菌体密度（D600）达0．4～0．6，并于42℃诱导3～5h时，目的蛋白表达量约为总蛋白的30％。采用透析法使包涵体复性，经金属螯合亲和色谱和凝胶色谱两步纯化后，获得了纯度约为90％、比活力达7300u／（mg蛋白）的重组人超氧化物歧化酶。     

以包涵体形式存在的重组蛋白的纯化和体外折叠

基因工程技术已使许多有重要意义的生物活性蛋白质的基因在原核生物中得到表达,为人们欲获得具有潜在临床和工业应用价值的大量蛋白质提供了丰富的来源.但是许多重组蛋白质是以包涵体形式在大肠杆菌中产生,它们的理化性质与天然蛋白质有许多不同之处,故从包涵体中获得高纯的重组蛋白质,进而对变性的重组蛋白质进行构象重折叠,即复性得到具有生物活性的蛋白质,是得到遗传工程产品的重要途径.     

人粒细胞集落刺激因子包涵体的提取及其复性研究

研究人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）包涵体的复性方法。方法：采用我室发明的包涵体提纯新方法。结果：复性回收率可达９０％以上,生物活性达天然比活的８０％以上。结论：对ｒｈＧ－ＣＳ Ｆ包涵体提纯和复性的研究,建立了ｒｈＧ－ＣＳＦ的复性新方法。     

基因工程药物中包含体复性的研究进展

以大肠杆菌作为表达系统生产基因工程药物时,药物蛋白通常会形成无活性的蛋白聚体即包含体,它们的一级结构即氨基酸序列是正确的,但空间结构错误,没有生物学活性。需要一个复性过程才能得到生物活性蛋白。近年来,发展了许多策略来从包含体中复性重组蛋白,包括利用层析复性以及用一些低分子量的添加剂等来提高活性蛋白的产率。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

重组人白细胞介素-18的高浓度复性、纯化和活性检测

目的摸索大规模生产重组人白细胞介素 18(rhIL 18)高效简便、成本低廉的生产工艺。优化rhIL 18高浓度下最优复性、纯化方案 ,建立快速准确的活性检测方法。方法采用液相色谱和光谱学方法检测复性效率 ,筛选确定rhIL 18最优复性条件 ,再用SepheroseFFANX阴离子交换柱结合分子筛HiPrepSephacrylS 10 0进行纯化。采用3 H 掺入法检测rhIL 18产品对人外周血单个核细胞的促增殖作用 ,用流式细胞术检测其促γ 干扰素生成能力。结果建立了一套rhIL 18复性、纯化、活性检测方案。结论液相色谱和光谱学方法相结合 ,可用于检测rhIL 18的复性效率 ,流式细胞术也可用于检测rhIL 18的生物活性。     

重组人肝细胞生长因子-β链的高效表达及包涵体纯化研究

目的　构建重组人肝细胞生长因子 - β链 (rh HGF- β)的表达体系。筛选高效表达工程菌株 ,分离纯化 rh HGF- β。方法　用工程菌诱导培养技术筛选 rh HGF- β的高效表达菌株。从诱导起始时间、诱导时间、温度、p H值、培养基组分等方面优化 rh HGF-β的表达体系。进一步对 rh HGF-β进行粗纯化 ,采用超声波破菌 ,溶菌酶破菌 ,高速离心反复洗涤获得包涵体。采用凝胶过滤层析纯化 rh HGF-β。结果　经十二烷基硫酸钠 -多丙烯酰胺冻胶电泳 (SDS- PAGE)及扫描分析目的蛋白的表达量达 3 0 % ,经纯化后可获得纯度在 90 %以上的 rh HGF-β。结论　建立了高效稳定的 rh HGF- β表达体系 ,获得实验室水平 rh HGF- β的分离纯化工艺方案     

关于医学微生物学中包涵体滥用问题的历史溯源和分析

随着对包涵体滥用问题的深入分析,在查阅人民卫生出版社出版的旧版《医学微生物学》有关包涵体是否滥用的过程之中,令人惊奇地发现在各种旧版《医学微生物学》里包涵体滥用的问题同样存在,而简单地将所有旧版《医学微生物学》中有关包涵体滥用都定性为错误,这是不可取和不正确的.故以辩证唯物观、历史唯物观为出发点,以事物普遍联系和发展的学说为根本,对问题的形成进行深入的剖析、溯源.只有在充分认识问题的基础上,才能真正解决包涵体滥用后导致的医学微生物学及相应医学学科构筑的矛盾,纠正包涵体滥用形成的不合理观念,从而避免广大医学同仁的误读、误识.     

P253R突变型FGFR2Ⅲc胞外段的表达、复性及活性研究(英文)

成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)具有促进细胞增殖,诱导新生血管形成等重要生理作用,与肿瘤的发生及发展也有十分密切的关系。P253R是Apert综合症中发现的一种突变,可使FGFR2IIIc与FGF2亲和力大大增加,从而导致过度自分泌和旁分泌活性,引起骨骼发育异常。从人胎盘组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到野生型FGFR2IIIc胞外段基因片段(wsFGFR2);再利用重叠延伸法以wsFGFR2基因片段为模板扩增得到P253R突变型FGFR2IIIc胞外段基因片段(msFGFR2,P253R是Apert综合征中发现的一种突变,可使FGFR2与FGF2亲和力大大增加)。msFGFR2基因克隆到pET3c载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式表达。经凝胶层析复性和肝素亲和层析纯化得到复性成功的活性蛋白,复性率为12%,纯度大于95%。MTT结果表明,msFGFR2能显著抑制FGF2促NIH3T3细胞增殖能力,并抑制前列腺癌DU145细胞的增殖,提示msFGFR2能有效阻断FGFs的细胞内信号通路,具有很好的产业化和临床应用前景。     

中心体相关蛋白55、睾丸表达基因14在结直肠癌组织中表达及其临床意义

目的 回顾性分析中心体相关蛋白55(CEP55)、睾丸表达基因14(TEX14)在结直肠癌组织中表达及其临床意义。方法选取2015年10月至2016年10月在南阳市中心医院行手术治疗的78例结直肠癌病人癌组织及其癌旁组织为研究对象。利用Ualcan数据库分析CEP55和TEX14在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测CEP55和TEX14 mRNA表达；免疫组化染色法检测CEP55和TEX14蛋白表达；分析CEP55和TEX14蛋白表达与病人临床病理特征的关系；对病人随访5年，使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，分析CEP55和TEX14蛋白表达与结直肠癌病人5年生存率的关系；使用Cox回归模型分析影响结直肠癌病人预后的因素。结果 Ualcan数据库分析结果显示，结直肠癌组织中CEP55和TEX14表达量均明显高于癌旁组织（P<0.05）。结直肠癌组织中CEP55、TEX14 mRNA水平（2.34±0.70比1.00±0.26、1.57±0.44比0.98±0.25）及蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织（P<0.05）。CE...     

B36-12 重组人可溶性Fas配基在大肠杆菌中的表达、纯化、重折叠和表征Sun KH等

Fas配基(FasL)是一种Ⅱ型膜蛋白，通过基质金属蛋白酶切割可获得具生物学活性的可溶性形式(sFasL)。sFasL会诱导耐Fas细胞的凋亡，而这一特殊的生物学活性也许可用于癌症治疗。然而，蛋白的三聚体形式使重组sFasL很难获得。本研究将sFasL DNA融合在硫氧还蛋白基因的氨基端，在羧基端加上His标签，在大肠杆菌中过表达。为了限制后继重折叠过程的自由度，将重组sFasL溶于6mol／L尿素，在变性条件下固定于镍树脂。通过逐步稀释法将固定的重组sFasL与过量的变性sFasL共同温育进行重折叠。     

C反应蛋白和D-二聚体在不同严重程度脓毒症的表达及临床意义

目的探讨C反应蛋白(CRP)和D-二聚体(D-D)在不同严重程度脓毒症的关系及临床意义。方法回顾性收集我科2016年1月至2017年6月,可疑脓毒症的患者178例,剔除不符合研究的25例,根据sepsis 3.0的诊断标准对剩余的153例进行分组,脓毒症休克组(59例)、脓毒症组(51例)、单纯感染组(43例),分别对3组患者的死亡情况、CRP、D-D指标变化情况进行比较和分析。结果①单纯感染组、脓毒症组、脓毒症休克组的患者病死率分别为0、37%、85%,三者之间差异有统计学意义(P<0.05);②与单纯感染组相比,D-D在脓毒症组、脓毒症休克组表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与脓毒症组相比,在脓毒症休克组CRP升高,差异有统计学意义;与单纯感染组相比,CRP、D-D在脓毒症休克组中表达变化明显,差异均有统计学意义(P<0.05);③不同严重程度的脓毒症与CRP、D-D指标存在相关性。结论 CRP、D-D变化程度与脓毒症患者病情的严重程度密切相关,CRP、D-D的检测对评估脓毒症的病情及预后具有重要意义。