基因打靶技术及其在生物医学中的应用

一、基因打靶的概念 利用细胞染色体ＤＮＡ可与外源性ＤＮＡ同源序列发生同源重组的性质,以定向修饰改造染色体上某一基因的技术叫基因打靶（ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）。它是 ８０年代后半期发展起来的一门按预期方式精细改造生物遗传信息的实验手段。基因打靶最常用的一种策略是通过同源重组使特定靶基因失活,以研究该基因的功能,称基因敲除（ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）;也可通过同源重组用一种基因替换另一种基因,以便在体内测定它们是否具有相同的功能,或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的,该…     

利用新型DNDF7和携带LoxP位点的LPL4质粒快速构建S-Sox5基因打靶载体

目的体外实验已证实S-SOX5蛋白转录调节运动纤毛基因Spag6,为进一步探索其在体内的作用,拟构建S-Sox5基因的敲除载体。方法利用新型DNDF-7和携带LoxP位点的LPL4载体,选择S-Sox5基因第1外显子作为条件性敲除目的片段,SV129系ES细胞DNA为模板分步扩增包括S-Sox5第1外显子的中间段(middle piece),上游同源左臂4.8kb(upper arm)及下游同源右臂2.5kb(down arm)的基因片段;构建upper-arm-DNDF7、down-armDNDF7和middle-piece-LPL4质粒,将middle-piece-LPL4的酶切产物LoxP-middle-piece-LoxP和down-arm-DNDF7酶切产物相连,形成携带LoxP位点的middle-down-arms-DNDF7重组质粒,该质粒与upper-arm-DNDF7酶切产物相连,获得S-Sox5基因打靶载体。结果经酶切鉴定及测序证实,构建的upper-arm—DNDF7、middle-piece—LPL4、down-arm—DNDF7重组质粒和S-Sox5基因打靶载体结构正确,与设计相符。结论成功构建小鼠S-Sox5条件基因打靶载体,为进一步建立S-Sox5条件敲除小鼠,在体内研究其功能打下基础。     

《中国前列腺癌患者基因检测专家共识(2020年版)》解读

国内外前列腺癌的诊疗中,基于第二代测序(next generation sequencing,NGS)技术的基因检测及精准医学实践已经得到了广泛的应用.特别是胚系基因突变(如DNA同源重组修复基因BRCA1/2、ATM、前列腺癌易感基因HOXB13等)与前列腺癌的发生、发展、预后及治疗密切相关.《中国前列腺癌患者基因检...     

凋亡素基因重组腺病毒的构建

目的构建携凋亡素基因的腺病毒载体,为进一步研究凋亡素基因功能及其作用机制建立基础。方法Pmel酶切线性化已经构建好的含凋亡素基因的穿梭质粒pAdTrack-CMV-VP3,然后电转化到BJ5183-AD-1细胞中进行同源重组。PacⅠ酶切出含凋亡素基因的腺病毒DNA,然后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒,运用RT-PCR鉴定重组腺病毒。用氯化铯梯度离心纯化病毒。用物理和生物方法确定病毒的滴度。结果PacⅠ酶切证实同源重组成功。绿色荧光观察证实病毒包装成功并且具有感染力,RT-PCR证实了重组腺病毒具有凋亡素蛋白的编码。重组腺病毒的浓度为84.52×109VP/ml,滴度为6.561×109PFU/ml。结论成功构建含凋亡素基因的重组腺病毒,它的滴度足以满足体内外实验。     

下调TPH2重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建色氨酸羟化酶(TPH)-2基因小干涉RNA的重组慢病毒载体.方法 在TPH-2 mRNA序列中选择1个特异性靶序列,体外合成对应发卡样DNA片段,经退火后,将其定向克隆入siRNA载体,获得重组质粒pU6 -MCS-CMV-TPH2-shRNA,后者与慢病毒试剂共转染293细胞,同源重组产生Lentivirus-TPH2-siRNA.经聚合酶链反应(PCR)鉴定目的基因的表达并测定病毒滴度.结果 PCR表明Lentivirus-TPH2-siRNA构建正确,病毒滴度为3×108 TU/rnl.结论 获得的Lentivirus-TPH2-siRNA可以用于转基因瘙痒治疗的实验研究.     

CDglyTK双自杀基因腺病毒系统的构建及其对瘢痕疙瘩成纤维细胞的杀伤作用

胸腺嘧啶核苷激酶(thymidine kinase,TK)基因和胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)基因整合形成的双自杀基因CDglyTK,通过适当的载体导入靶细胞内,同时给予两种基因前体药物,前体药物在自杀基因表达产物作用下转化为有毒性的代谢产物,通过干扰DNA和RNA的合成抑制细胞增殖,促进靶细胞凋亡.我们利用改良细菌内同源重组法构建CDglyTK双自杀基因的腺病毒,并观察其对瘢痕疙瘩成纤维细胞的杀伤效应,为进一步研究重组CDglyTK双自杀基因对瘢痕疙瘩的治疗作用提供依据.     

Claudin-7基因敲除模型的建立

为研究Claudin-7在机体中的功能[1],我们建成Claudin-7基因敲除小鼠模型并分析其特点. 一、材料与方法 1.材料:利用DNA同源重组技术建立基因敲除小鼠,SPF级动物房饲养,兔抗COX-2、P-Histone H3多抗(cell signaling,USA),兔抗Claudin-7多抗购自日本IBL公司;鼠抗GAPDH单抗购自美国Calbiochem公司;抗兔和抗鼠辣根过氧化酶标记的二抗购自美国Promega公司.     

携带超抗原SEA基因的特异性溶瘤腺病毒载体的构建和鉴定

目的 构建携带超抗原SEA基因的肿瘤特异性溶瘤腺病毒表达载体.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中获得SEA全长基因序列,酶切后克隆入pCA13质粒,构建重组病毒质粒pCA13-SEA.将鉴定正确的pCA13-SEA与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-SEA.Ad-SEA在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度.结果 克隆得到771bpSEA全长基因.经PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,SEA基因成功克隆到溶瘤腺病毒载体中,可实现SEA基因的表达,且病毒滴度达6.5×109pfu/ml.结论 成功构建表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体.     

乙型肝炎病毒DNA疫苗的研究现状

乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)DNA疫苗是指通过克隆HBV抗原基因,并将其插入真核表达载体构建而成的重组DNA分子.通过皮下、肌肉注射或颗粒轰击技术将重组DNA分子导入体内,使目的基因在体内表达,从而诱导机体产生针对此种抗原的体液免疫和细胞免疫.……     

生物信息学(2):基因工程技术简介

基因工程的特点与基本步骤 基因工程通常称为重组DNA技术（recombinant DNA technique），又称为基因克隆fgene cloning）或分子克隆fmolecular cloning），是用人工方法将外源基因与DNA载体结合形成重组DNA．然后引入某一受体细胞中，使外源基因复制并产生相应的基因产物，从而获得生物新品种的一种崭新育种技术。     

MSX2基因与上皮间质化在肿瘤浸润转移的研究进展

同源(异型)框基因Msx(Msx)属于同源(异型)框基因Hox(homeobox)家族成员,Hox基因是一类高度保守的DNA序列,其共同特点是具有180个核苷酸长度的同源区,编码由印个氨基酸折叠成的3个α-螺旋结构~([1]),该结构被称为同源异型域(HD).     

X-盒结合蛋白1条件性基因敲除小鼠模型的建立

目的建立可进行条件性敲除X-盒结合蛋白1(Xbp1)基因的flox杂合子小鼠。 方法通过ET-clone的方法构建基于cre-loxp系统和FLP-frt系统的条件性基因打靶载体。载体线性化后电转JM8A3 ES细胞,经G418和Ganc筛选获得抗性ES细胞克隆。经长片段PCR鉴定获得正确同源重组的阳性克隆。阳性ES细胞经克隆扩增后,注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合鼠,筛选出高比例嵌合小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配后获得阳性F1代小鼠,并分别进行PCR和测序鉴定。 结果成功构建打靶载体,共获得144个抗性ES细胞,克隆经长片段PCR鉴定,共获得4个正确同源重组的阳性克隆。获得4只阳性F1代小鼠,经测序鉴定正确。Xbp1基因flox杂合子小鼠表型无明显异常。 结论成功构建了条件性敲除Xbp1基因的flox杂合子小鼠,为未来研究器官或组织特异性的Xbp1生物学作用奠定了基础。     

人脑胶质瘤组织中同源盒HOXA1-A4基因mRNA表达

同源盒基因是生物发育分化的主控基因,对DNA合成的转录过程起调控作用.目前,关于同源盒基因在胶质瘤组织中表达的报道尚少~([1]).本研究旨在观察人脑胶质瘤肿瘤组织中同源盒基因HOXA1、HOXA2、HOXA3和HOXA4基因mRNA表达. 一、材料与方法1.一般资料:2007年3至2008年8月收集吉林大学中日联谊医院神经外科28例胶质瘤标本,按2000年WHO神经系统肿瘤分类标准进行分级,其中WHOⅠ～Ⅱ级12例,为低恶组,WHOⅢ～Ⅳ16例,为高恶组.此外,9例取自外伤或癫痫脑叶切除患者的脑组织作为正常对照.     

雄激素调节的前列腺特异性同源框基因NKX3.1研究进展

同源框基因(Homeobox Genes)最早在果蝇中发现，是一大类编码同源域蛋白(Homeodomain Protein)调控胚胎发育分化的基因。同源域蛋白含有称为同源域(Homeodomai，HOM，在哺乳类称为Hox)的蛋白片断，同源域则是由同源框基因中所含的同源域序列所编码。同源域序列为含有183bp的高度保守序列，所编码的61个氨基酸的同源域蛋白片断进化上高度保守，有识别和结合特异性DNA序列的功能，是真核生物转录因子。     

骨形成蛋白2重组腺病毒的构建与鉴定

目的　通过构建骨形成蛋白 (BMP)重组腺病毒 ,为骨缺损的基因治疗提供可能。方法　应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)法克隆出BMP2全长基因 ,构建重组腺病毒载体 ,DNA 磷酸钙共沉法将辅助质粒PJM 17转染 2 93细胞 ,同源重组构建出重组腺病毒。测滴度并用氯化铯梯度离心纯化备用。结果　逆转录克隆出BMP2全长基因 1.2kb ,测序后连接于重组腺病毒载体 ,酶切鉴定后转染构建活病毒 ,再次感染 2 93细胞扩增 ,测滴度为× 10E10 pfu/ml ,并应用PCR法测定目的序列。结论　BMP2重组腺病毒的构建为骨缺损等疾病的基因治疗提供可能     

转基因技术综述

近年来,对于细胞内基因组成的认识已经有了很大的进步,这主要归功于基因实验技术的改进。此技术有两个重要特征:(1)确定相对小的DNA片段在宿主细胞的复制;(2)超越自然种系障碍,将基因从一个生物体转移到另一个非相关宿主细胞的能力。外源性DNA成功地插入媒介体即为DNA嵌合体,此结构是重组体DNA研究的基础,被命名为“分子克隆”。克隆一段外源性DNA要求:(1)必须分离、纯化和切取媒介体DNA;(2)外源性DNA插入开放的媒介体DNA以产生人工重组体;(3)DNA被连接和闭合;(4)能有效检测基因连接的方法;(5)此人工重组体能导入宿主细胞。将外源DNA导入哺乳动物细胞已有较好的方法,如通过化学和物理方法,后病毒媒介体研究有了较大发展,使得基因转移和表达率较高。这些方法包括:(1)磷酸钙转移法,是最常用的一种方法,尤其在确定细胞癌基因和细胞基因的数量上,不足之处是常常     

生长激素促分泌素受体基因敲除小鼠胚胎干细胞的建立

目的建立生长激素促分泌素受体（ghrelin receptor，GHS-R）基因敲除小鼠胚胎干细胞（ES细胞）杂合子模型，为研究GHS—R基因的功能奠定基础。方法用TK-neo置换原X-pPNT载体的PGK—neo构建目标载体。以小鼠基因组DNA为模板，用PCR方法扩增2条同源臂，将其按照一定方向装入含有TK—neo的X—pPNT载体，并测序鉴定。载体线性化及纯化后电穿孔转染小鼠ES细胞，用G418和更昔洛韦（Gancyclovir）对电穿孔转染后的ES细胞进行正、负筛选培养，得到双药抗性ES细胞，克隆后抽提基因组DNA，分别用PCR方法鉴定2条同源臂，并测序确定成功同源重组的ES细胞克隆。结果改建X—pPNT载体成功，PCR获得2条同源臂片段，测序正确，并按一定方向装入打靶载体，ES细胞转染后经双药筛选得到328个阳性ES细胞克隆，PCR及测序鉴定证实3个克隆发生同源重组。结论本研究成功获得了GHS-R（-／＋）杂合子小鼠ES细胞克隆，为进一步通过显微注射及杂交育种获得GHS—R基因敲除小鼠打下了基础。     

基因工程化小鼠模型在胃肠道肿瘤研究中的应用

基因敲除技术是以DNA同源重组技术和胚胎干细胞技术为基础．对特定基因位点进行修饰的实验方法,是揭示基因功能最直接的手段之一。小鼠和人的基因相似性达95％。小鼠培育简单、价格便宜、繁殖能力强、生命周期短,适用于疾病发生发展的全过程观察。利用基因操作技术改造小鼠基因便可产生模拟人类基因变异导致的表型效应．可为人类疾病模型的复制及疾病防治研究提供一种有效的实验手段。随着基因操作技术的不断开发与改进．基因工程化小鼠模型在胃癌研究中将扮演更加重要的角色。本文系统介绍了基因工程小鼠模型在胃肠道肿瘤研究中的应用。     

马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶基因的克隆、表达及纯化

目的 研究马尔尼菲青霉菌(PM)溶血磷脂酶(LysoPLs)基因的克隆、表达和纯化,为研究其致病机制奠定基础.方法 采用生物信息学方法,从PM酵母相全长 cDNA 文库中识别出PMLysoPLs基因的同源序列及其全长编码区.通过PCR方法 扩增PMLysoPLs基因的编码区序列,构建原核表达载体pET 30a(+)-PMLysoPLs,经DNA 序列测定鉴定其序列,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,重组产物采用His-镍蛋白纯化柱进行纯化.结果 PMLysoPLs基因长度为991 bp,其全长编码序列长度为732 bp,编码243个氨基酸,其编码蛋白理论分子量为26.8 kDa.重组表达载体经序列测定及酶切鉴定与理论推测结果 相符.经IPTG诱导,该基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中得到高效的可溶性上清表达,纯化后的重组蛋白分子量为25~35 kDa,其单一蛋白纯度达95%以上.结论 本研究成功构建了PMLysoPLs基因的pET 30a(+)原核重组质粒,获得的可溶性重组蛋白表达效率高,可用于进一步研究PM溶血磷脂酶的功能.