基因敲除动脉粥样硬化小鼠模型研究进展

基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型是目前较为认可的探讨动脉粥样硬化发病机制及寻找新药物靶点的关键工具,也应用于潜在抗动脉粥样硬化药物的药理和毒理研究。载脂蛋白E(ApoE)、低密度脂蛋白受体(LDLR)和B类Ⅰ型清道夫受体(SR-B1)等基因的表达促进机体脂质、胆固醇和低密度脂蛋白等转运和代谢,维持血管正常功能,敲除这些基因会引起脂质转运及代谢紊乱从而诱发动脉粥样硬化及并发症的发生发展。常见的基因敲除小鼠有ApoE基因敲除、LDLR基因敲除及其改良品系,这些模型小鼠能够客观反映敲除基因对动脉粥样硬化发生的影响,且广泛应用于动脉粥样硬化的非临床研究。本文阐述了当前基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型的机制、应用和优缺点,以期为动脉粥样硬化发病机制研究及抗动脉粥样硬化药物筛选提供参考。     

凝血因子Ⅺ作为抗栓防治新靶点的研究进展

出血是目前临床抗栓药物防治最主要、最常见的并发症。近年来,有关凝血因子XI(FXI)与血栓性疾病发生相关的临床资料、FXI基因敲除动物或抑制FXI的抗栓实验均表明FXI是出血风险小的抗栓防治新靶点,针对FXI靶点的抗栓药物出血副作用小。     

尿素通道蛋白作为利尿和治疗高血压潜在药物靶点的确认和相关药物研发

利尿药是世界卫生组织推荐的一线抗高血压药物。但是,目前利尿药长期较大剂量应用可能引起电解质紊乱和血尿酸增高,糖、脂代谢紊乱,新发糖尿病增加等不良反应。因此,研发新型抗高血压药物是当前迫切需要。尿素通道(UT)是特异性通透尿素的跨膜蛋白,在肾脏尿浓缩机制中发挥重要作用。对不同UT敲除小鼠模型的表型研究结果提示"尿素通道蛋白可作为新的利尿药作用靶点,其抑制剂可研发成为新型利尿药"。目前已经发现,UT的抑制剂具有利尿的活性,并且不影响机体的电解质代谢。研究还发现,UT-B敲除小鼠的血压明显低于野生型小鼠,其机制与L-arginine-e NOS-NO通路上调密切相关;UT-B参与细胞内L-arginine-eNOS-NO和L-arginine-arginase-urea之间的相互调节。本文仅就尿素通道蛋白作为利尿和治疗高血压潜在药物靶点的确认和相关药物研发的研究进展进行较为系统的综述,以期为开发新型利尿药物和/或降压药物提供新的靶点。     

蛋白酪氨酸磷酸酶：治疗前景

蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）大家族，是信号转导途径中的重要调节因子。最近的小鼠基因敲除实验发现，PTP1B极有希望成为开发抗糖尿病／肥胖症药物的作用靶点。PTP也参与体内包括癌症在内的多种疾病的病理过程。特异抑制单个PTP同工酶活性的小分子物质得以鉴定，并取得重要进展。本文概述PTP的基本结构、作用特征及其在信号转导途径中的地位，并对其小分子抑制剂的治疗用途作一展望。     

基因敲除小鼠在药物依赖性研究中的应用

基因敲除 ( ｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔ)是８０年代初出现的一项新的基因工程技术 ,是制备转基因动物的重要技术之一。利用该技术可以培育先天缺陷某一特定基因的动物 ,以此研究该特定基因的生理功能或在疾病发生发展中的意义。近年来基因敲除小鼠在药物依赖性研究中也得到广泛的应用。在传统的药物依赖性研究中 ,往往选取特异性的受体配体来研究该受体在依赖性中的作用 ,但这种特异性往往是相对的 ,剂量改变就可能影响其它受体的功能 ,所以难以真正确定该受体的作用。而基因敲除技术在这方面具有独特的优点 ,因为利用基因敲除技术可以选择性…     

广角

POKEMON——新的癌症基因2005年1月20日的《自然》杂志上刊登了一项最新研究:Memorial Sloan-Kettering癌症中心(MSKCC)的研究人员最近确定出了一种新的对癌症形成至关重要的POK红系髓性致癌因子(POKErythroid Myeloid Ontogenic factor),简称“波克曼”(POKEMON)基因。POKEMON能够控制正常细胞变成癌细胞所需的途径。研究人员发现,当将小鼠的POKEMON基因敲除时,这种转变过程就被抑制,因此细胞也不会发生癌变。能够抑制这种蛋白功能的药物将可能成为一种强有力的抗癌剂。研究人员通过将这种癌基因插入小鼠的试验证实了PO…     

肝脏特异性Nampt基因敲除对缺血性脑卒中的影响

目的烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt)是缺血性脑卒中的治疗新靶点。本研究旨在阐明肝脏来源的Nampt是否对缺血性脑卒中具有保护作用。方法运用Cre/loxP系统制备肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠。将Nampt^loxP/loxP小鼠与肝脏特异性表达Cre重组酶小鼠(Alb-Cre)进行杂交,采用聚合酶链反应方法鉴定子代基因型。测定基因敲除小鼠和同窝对照小鼠的体重。蛋白免疫印迹法检测小鼠肝脏和脑中Nampt蛋白的表达。采用电凝法对肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠和对照小鼠制备大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)脑卒中模型,造模24 h后对各组小鼠进行神经功能损伤评分,TTC染色测定脑梗死体积,ELISA法检测各组小鼠血浆Nampt水平。结果成功构建肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠,其基因型为Nampt^loxP/loxP Alb-Cre。肝脏特异性Nampt基因敲除组肝脏Nampt蛋白表达与对照组相比下降74.2%...     

利用细胞培养基或动物血浆中的荧光标记产物测定鞘磷脂合酶活性

鞘磷脂合酶（SMS）催化神经酰胺（ceramide,Cer．）转变为鞘磷脂（sphingomyelin,SM）。近来的研究表明神经酰胺和鞘磷脂参与了代谢综合征的过程,因而鞘磷脂合酶被认为是开发抗代谢综合征药物的潜在靶点。鞘磷脂合酶有两个同工酶,分别称为鞘磷脂合酶1（SMS1）和鞘磷脂合酶2（SMS2）。这两种同工酶的亚细胞定位不同,在不同组织中的表达水平也有差异。到目前为止,已发表有多种方法测定组织和细胞匀浆中的总SMS活性,这些方法通过分析总反应体系或细胞内的酶促反应产物来衡量SMS活性。本文介绍一种测定SMS活性或筛选SMS抑制剂的新方法。我们将荧光标记的神经酰胺（NBD-Cer．）作为底物与细胞孵育,或者将该底物注射到小鼠体内,然后监测在细胞培养基或小鼠血浆中出现的荧光标记的鞘磷脂（NBD-SM）的含量。采用这种办法可有效检测出D609（一种鞘磷脂合酶抑制剂）对细胞和小鼠整体SMs活性的抑制作用。我们进一步采用该方法检测了SMS1基因敲除小鼠和sMs2基因敲除小鼠的SMS活性,结果发现注射底物后,SMS2基因敲除小鼠（而不是SMS1基因敲除小鼠）血浆中NBD-SM的堆积被明显阻断。因而该方法可用于检测生理或药理条件下在体或离体组织的SMS活性、筛选SMS抑制剂、甚至筛选SMS2特异性抑制剂。     

功能基因筛选方法的研究进展

功能基因的筛选研究可为深入了解疾病的发生和发展过程，药物作用机制，建立新的疾病诊断、预防、治疗策略奠定基础，因而正在成为当今药物及药物靶点发现的重要途径。该领域的迅速发展很大程度上借助于技术方法的不断提高和发展。本文对功能基因筛选研究策略及主要技术方法，如表达谱分析法、高通量细胞筛选技术、反义核酸技术、转基因／基因敲除技术等的研究进展及应用进行了综述。     

肝X受体激动剂猪去氧胆酸二甲酰胺抗疲劳作用研究

目的探讨肝X受体(LXR)激动剂猪去氧胆酸二甲酰胺的抗疲劳作用,推测人参活性成分抗疲劳作用靶点。方法采用ApoE基因单敲除小鼠和昆明白小鼠两种不同品系小鼠,实验组通过口服连续给予实验药物猪去氧胆酸二甲酰胺4周,剂量为200mg·kg-1·d-1,再分别进行跑步耐力和游泳力竭实验,采集实验组和对照组的运动时间数据。结果 LXR激动剂猪去氧胆酸二甲酰胺(200mg·kg-1·d-1)可以提高ApoE基因单敲除小鼠的跑步耐力、延长昆明白小鼠的游泳时间。结论猪去氧胆酸二甲酰胺具有一定的抗疲劳作用,LXR可能是人参皂苷作用靶点之一。     

RNA干扰类药物开发策略及临床研究进展

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的特异性基因表达沉默.利用RNAi技术可使某些与疾病发生有关的基因沉默或表达水平降低,从而有效治疗疾病.目前RNAi类药物的研究已在多种疾病治疗领域取得了较好进展.本文综述RNAi类药物的开发策略及其临床研究进展.     

大鼠CRH基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建针对大鼠促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体并进行鉴定。方法针对CRH基因设计4个RNAi靶点并分别构建入慢病毒骨架载体,测序鉴定。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T工具细胞后,用Western blot进行外源筛靶以确定有效靶序列。有效RNAi病毒质粒与辅助质粒通过Lipofectamine 2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后用孔稀释法测定病毒滴度。结果 Western blot外源筛靶显示3个靶点能有效敲减目的基因的表达。测定浓缩病毒悬液的滴度为1．5×109 T U／ml。结论成功构建了CRH基因的RNAi慢病毒载体,可用于CRH在应激反应中作用的研究。     

TLR9基因敲除小鼠的构建及表型初步鉴定

目的构建TLR9基因敲除小鼠模型,并对其表型进行初步鉴定。方法利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR9基因敲除小鼠;利用毛细管凝胶电泳技术鉴定敲除小鼠的基因型,并通过PCR产物测序分析对敲除效果进行鉴定;利用qRT-PCR和Western blot及免疫组织化学技术分别检测TLR9基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达情况;观察基因敲除小鼠的遗传性状、体重及血常规变化;并通过苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠组织的病理形态学变化。结果 PCR和测序结果表明TLR9基因敲除成功。敲除小鼠的脾、肝组织中TLR9基因mRNA及蛋白质水平表达显著低于野生型小鼠;TLR9基因敲除小鼠可正常生长繁殖,体重、外周血血常规各项指标均正常。TLR9基因敲除小鼠各组织形态学特征与野生型小鼠相比无明显差异。结论成功建立TLR9基因敲除小鼠模型,为研究TLR9基因的生物学功能和调控机制提供实验动物模型。     

特发性肺纤维化的炎症机制和新型分子靶标

目的研究肺泡巨噬细胞参与调控特发性肺纤维化的作用特点及关键药物作用靶标。方法在Akt2和PKC-δ基因敲除小鼠上,采用博来霉素诱导的特发性肺纤维化模型,比较敲除小鼠和野生型小鼠肺纤维化和肺部炎症变化情况,检测肺部炎症因子产生和炎性细胞浸润。利用巨噬细胞过继转移和细胞因子回复实验,考察巨噬细胞调控特发性肺纤维化的作用。体外分离小鼠骨髓来源巨噬细胞,比较巨噬细胞极化情况和信号通路变化。结果与野生型小鼠相比,PKC-δ基因敲除小鼠肺纤维化和炎症反应增强,与此相反,Akt2基因敲除小鼠肺纤维化和炎症反应减弱。Akt2和PKC-δ基因从正负2个方向调控巨噬细胞极化,进而影响肺部炎症微环境变化,调控肺纤维化进程。结论在特发性肺纤维化的炎性环境中,Akt2和PKC-δ基因从正反2条信号调控肺泡巨噬细胞的极化,通过影响肺部炎症微环境调节纤维化进程。提示PKC-δ和Akt2基因是治疗特发性肺纤维化的潜在药物作用靶标。     

RNA干扰对Survivin基因抑制效应的测定

目的利用RNAi技术沉默Survivin基因对其抑制效应进行测定。方法应用RNAi技术,以SurvivinsiRNA重组质粒为载体,通过RT-PCR和Western-blot法检测Survivin基因的表达。结果 Survivin基因的表达明显低于对照组,达到抑制效果;采用Western blot检测Survivin在基因表达水平上的抑制作用,同样达到了抑制效果。结论利用RNA干扰技术沉默Survivin基因抑制细胞生长,促进凋亡。表明Survivin基因参与了信号转导,有望成为基因治疗的新靶点。     

造血干细胞特异性敲除Foxo1促进NK细胞分化和增殖

目的研究转录因子Foxo1对自然杀伤细胞(NK)早期发育和谱系分化的调控作用和初步机制,以及Foxo1在NK细胞发育早期的相对高表达对后期增殖和成熟的影响。方法利用Vav1-iCre小鼠与Foxo1f/f小鼠杂交,实现在造血干细胞来源的所有免疫细胞中敲除Foxo1,包括造血干细胞、淋巴祖细胞、NK早期祖细胞、不成熟和成熟NK细胞等阶段,观察NK细胞的分化、增殖和成熟。结果前期利用Ncr1-iCre小鼠,在NK细胞中随着NKp46的表达开始特异性敲除Foxo1,发现Foxo1负向调控NK细胞的终末成熟和效应功能。发现造血干细胞特异性敲除Foxo1导致骨髓中淋巴祖细胞、NK前体细胞b以及NK细胞的比例和数量均显著增加,即Foxo1抑制NK细胞的谱系分化和早期发育。造血干细胞特异性敲除Foxo1促进Ki-67蛋白的表达,同时,体外IL-15刺激分选的NK细胞导致其扩增显著增加,即Foxo1以细胞内源性的方式抑制NK细胞增殖。机制研究发现,Foxo1能够直接结合到细胞周期抑制基因(如p21cip1,p27kip1,p130,Gadd45α和Ccng2)的启动子区域,从而可能促进其m RNA的表达,继而抑制NK增殖。此外,造血干细胞特异性敲除Foxo1同样能够导致NK细胞成熟增加,与既往研究结果一致。结论 Foxo1不仅能够抑制NK细胞谱系分化和增殖,同时能够抑制NK细胞终末成熟,进而负向调控NK分化、发育的全过程。     

基因敲除技术在胰岛素抵抗研究中的应用

基因敲除技术的发展与应用为胰岛素抵抗的研究提供了有效的手段。本文综述了近年来应用该技术对胰岛素信号通路及效应器中特异基因敲除后对胰岛素抵抗发生发展的影响．并为其治疗与药物的开发提供思路。     

RNAi基因治疗可阻止乳腺癌生长

美国得克萨斯大学Anderson癌症中心的研究人员采用RNA干扰(RNAi)基因治疗法成功地阻止小鼠中乳腺肿瘤的生长。他们的工作主要是针对STAT3蛋白的RNAi介导的基因敲减,这种蛋白可促使乳腺肿瘤和其他类型癌症中失控细胞的生长,还能阻止免疫细胞攻击肿瘤。研究人员用慢病毒载体将RNAi的编码基因插入肿瘤细胞。若成功,肿瘤会持续产生抗STAT3RNAi分子。体外用含RNAi的载体处理癌症细胞,结果3/4的细胞停止表达STAT3。这些细胞注入免疫功能正常的小鼠后,无论在注射部位还是远处部位都不生长出肿瘤。进一步研究提示,不仅STAT3受到抑制,…     

TDO2基因敲除小鼠模型的建立和初步表型研究

目的构建TDO2基因敲除的C57BL/6小鼠,初步研究其表型。方法根据CRISPR/Cas9技术原理,设计并体外转录sgRNA,用显微注射法将Cas9、sgRNA同时注射到小鼠的受精卵。经胚胎移植,获得可能出现多种基因型并存的F0代小鼠。利用PCR法进行基因型判定,获得阳性F0代小鼠。由阳性F0代小鼠与野生型小鼠回交得到F1代杂合子小鼠。阳性F1代杂合子小鼠之间配繁,得到F2代纯合子小鼠。观察和分析纯合子小鼠的生长特性,繁殖能力和子代存活率。Western blot验证TDO2基因敲除纯合子小鼠肝脏组织中TDO2的蛋白表达。结果成功繁育和鉴定出TDO2基因敲除小鼠,PCR法成功鉴别了子代鼠的基因型;Western blot结果表明,TDO2基因敲除小鼠的肝脏组织中TDO2蛋白不表达。TDO2基因敲除小鼠饮食、体质量等未发现异常改变。结论成功建立TDO2基因敲除小鼠,为研究TDO2基因的生物学功能和在疾病中的调控作用提供实验手段。