应用噬菌体随机十二肽库筛选hFGF 7相关模拟肽

目的应用噬菌体随机十二肽库生物淘选具有刺激表皮细胞增殖作用的人成纤维细胞生长因子 7(hFGF 7)噬菌体模拟肽。方法以hFGF 7单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选噬菌体随机十二肽库;随机挑取单克隆噬菌体,应用ELISA方法检测单克隆噬菌体的结合力,对结合力较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,并行序列分析。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,ELISA检测结果显示获得的一些噬菌体模拟肽具有较好的结合力,测序获得11个与促进细胞分裂、增殖或抑制细胞增殖有关的碱基序列。结论从噬菌体随机十二肽库中可淘选到与hFGF 7相关的噬菌体模拟肽,其中部分噬菌体模拟肽可能会促进表皮细胞增殖,期望将来可应用于促进创面愈合。     

从噬菌体肽库中筛选生长因子模拟肽的研究进展

生长因子通过膜受体可将胞外信号转导至胞内,现已发现一些小分子肽能够作为受体的配体模拟天然配体的生物学作用.以可溶性受体的纯化蛋白或转染了膜受体的完整细胞为靶标,人们从噬茵体肽库中筛选出多种模拟肽,对这些肽的序列和生物学功能进行分析,发现它们能够竞争受体与天然配体相结合,可作为生长因子受体的拮抗剂或激动剂.噬菌体展示技术的应用不仅为生物大分子间的结构和功能关系提供信息,而且为新药的研究提供了新思路.本文对从噬菌体肽库中筛选生长因子受体肽类拮抗剂或激动剂的研究进展作一综述.     

从噬菌体随机肽库中筛选及鉴定肺癌特异性多肽

目的 利用Phage display随机肽库筛选出与肺癌NCI-H1299细胞特异性结合的多肽,并通过ELISA和免疫组化鉴定其特异性和亲和力,为寻找肺癌早期诊断和治疗标志物打下基础.方法 以肺癌细胞NCI-H1299为靶细胞,肺二倍体成纤维细胞MRC-5为吸附细胞,在37℃下对噬菌体随机十二肤库进行四轮减性筛选,挑取单克隆、扩增纯化噬菌体、并经ELISA初步鉴定噬菌体克隆亲和力;对阳性克隆提取质粒,浏序后合成多肤,多肽标记荧光素FITC,以其在肺癌组织芯片上鉴定多肽的亲和力及特异性.结果 经ELISA初步鏊定,随机挑选的18个单克隆中,其中3号对NCI-H1299亲和力最高,将其命名为Phage ZL-3.细胞免疫荧光试验进一步证明,荧光素标记的多肽FITC-ZL-3对NCI-H1299具有高亲和力.结论 利用噬菌体随机十二肽成功筛选出与肺癌细胞具有较高亲和力的多肽ZL-3,为肺癌的早期诊断和靶向治疗奠定基础.     

从噬菌体展示随机肽库中筛选豌豆凝集素的结合肽

目的:从噬菌体展示随机肽库中筛选能与豌豆凝集素(PSA)特异结合的短肽.方法:①用豌豆凝集素(PSA)作为靶蛋白,对噬菌体展示的随机六肽库进行亲和筛选;②α-甲基-D-甘露糖苷对筛选出的噬菌体和PSA结合的影响实验(点印迹法); ③选择性地合成了3条6肽ARMWSF、RYDYSY、LRLRQL,用不同浓度的6肽对PSA、ConA与HRP的结合进行竞争抑制实验.结果:经过三轮筛选后,这些噬菌体展示肽有明显的富集,从第三轮挑选的22个克隆的插入氨基酸序列可分为三大类;点印迹结果表明,这些噬菌体展示肽能与PSA特异结合,而α-甲基-D-甘露糖苷不同程度地抑制这种结合; LRLRQL不溶于水,ARMWSF和RYDYSY对PSA和HRP的结合有抑制,而对ConA和HRP的结合没有明显抑制.结论:人工合成的2条6肽和PSA的结合部位与α-甲基-D-甘露糖苷和PSA结合的部位并非相同.     

应用噬菌体随机十二肽库筛选TGF-β1相关模拟肽的实验研究

目的应用噬菌体随机12肽库生物筛选获得转化生长因子-β1(TGF-β1)噬菌体模拟肽。方法以人TGF-β1单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选,随机挑取单克隆噬菌体,ELISA法检测单克隆噬菌体的结合力。对结合力较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,行序列分析。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,ELISA检测结果显示,获得的一些噬菌体模拟肽具有较好的结合力,测序获得10个与促进成纤维细胞增殖或抑制细胞增殖有关的碱基序列。结论从噬菌体随机十二肽库中可淘选到与TGF-β1相关的噬菌体模拟肽。     

从噬菌体随机肽库中筛选SARS病毒N蛋白表位模拟肽的研究

目的获得具有生物学活性的SARSN蛋白的模拟肽。方法以抗SARS病毒N蛋白的单克隆抗体作为固相筛选分子,免疫筛选噬菌体随机十二肽库,并采用夹心ELISA、竞争抑制试验鉴定阳性克隆。结果经噬菌体富集后,从随机筛选的各46个克隆中得到N蛋白的2个不同表位,即由ELISA鉴定出单克隆抗体C00835个阳性克隆,确定氨基酸序列GXLXTPXXXXGT为SARSN蛋白的一个表位;单克隆抗体C03941个阳性克隆,确定氨基酸序列TTLPXXXXAXXX为SARS病毒N蛋白的另一个表位。结论用噬菌体随机12肽库成功筛选得到SARSN蛋白的2个不同模拟表位,为用SARS表位去探索其病毒的结构及疫苗的研制创造了条件。     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

从噬菌体肽库中筛选并鉴定CD13特异性结合肽

目的 筛选并鉴定可和单核细胞表面CD13分子特异性结合的特异性短肽.方法 以CD13为靶分子,用噬菌体展示十二肽库进行筛选,通过亲和富集法筛选表达有特异性结合肽的噬菌体,ELISA鉴定所挑选噬菌体和CD13的亲和力,根据噬菌体基因序列推导出多肽序列.对筛选到的并经比对分析认为有生物学特性的多肽进行人工合成,通过免疫荧光技术检测多肽和THP-1细胞的结合情况、位置及WM15对多肽和细胞结合的阻断作用.结果 经过四轮筛选,与CD13特异性结合的噬菌体得到有效富集并最终接近饱和状态.第4轮筛选后回收率与第1轮相比,富集了30倍.挑取的20个噬菌体单克隆中,经ELISA鉴定有10个和CD13的亲和力较高,有阳性意义.经比对得到2个有生物学功能的多肽序列P9、P7,它们分别和人巨细胞病毒(HCMV)UL38、UL105基因编码的相应氨基酸序列有83%、100%相似性.免疫荧光检测可见多肽P9、P7和THP-1细胞的结合位于细胞膜表面.WM15可以不同程度的阻断多肽和细胞的结合.结论 成功筛选出了2条可和CD13特异性结合的短肽P9、P7,而且P9、P7可以和THP-1细胞膜表面的CD13分子特异性结合.     

利用噬菌体肽库筛选Survivin结合肽

目的：将纯化的Survivin蛋白作为诱饵,从噬菌体肽库中筛选出结合肽。方法：用纯化的Sur-vivin蛋白包被35 mm的塑料培养皿,加入随机12肽的噬菌体肽库,用靶分子溶液竞争性洗脱结合的噬菌体,通过测定噬菌体滴度检测Survivin蛋白的吸附、富集效果,筛选阳性噬菌斑,制作DNA测序模板进行测序。结果：经3轮筛选,噬菌体显示有良好的富集效果。从第3轮筛选产物中挑取8个蓝色噬菌斑（阳性克隆）进行测序,DNA测序结果表明,具有一致性序列GIANNFFTLKIS。结论：从噬菌体随机肽库中,筛选到能与Survivin蛋白特异性结合的一段短肽,为Survivin蛋白的进一步研究奠定基础。     

噬菌体随机肽库中B型钠尿肽结合肽的筛选及鉴定

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

从噬菌体表面展示环状7肽肽库中筛选葡萄球菌B型肠毒素抑制剂

目的:拟通过生物淘选从噬菌体表面展示环状7肽肽库中筛选出与葡萄球菌B型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)结合并能抑制该毒素毒性效应的特异性短肽.方法:采用Phage-ELISA来鉴定所得目的肽的亲和性;利用竞争ELISA研究合成肽与SEB mAb竞争结合SEB的情况;通过动物实验考察其抑制SEB的超抗原特性和肠毒活性情况.结果:筛选所得短肽在一定浓度范围内可以抑制SEB对鼠脾淋巴细胞的激活;合成肽与SEB质量比160:1下,合成肽可较好地抑制SEB对乳猫的肠毒活性,并对SEB引起的小鼠致死具有明显保护作用.结论:得到了能与SEB特异结合并能抑制SEB超抗原特性和肠毒活性的短肽.     

Screening and identification of mimotopes of LPS conservative epitope from random phage display peptide library

liPOpolysacchedde(ffe), or endototin, is a common component of the cell wall Of Grin negative bacterias, and is considered the initiative factor inducing endototic shock. The s~ture of LPS is so complicated thatthere is no ideal antagonist, anhbody or vaccine for thePunention and therapy of itS toxicity. Since LPS serotypesare abundant, the 'conservative anhgen epitopes includinglipid A and the inner core Oligosacchallde become the besttarget that may win a break~gh for developingnovel cr…     

Screening of TACE Peptide Inhibitors from Phage Display Peptide Library

Summary： To obtain the recombinant tumor necrosis factor-α converting enzyme （TACE） ectodomain and use it as a selective molecule for the screening of TACE peptide inhibitors, the cDNA coding catalytic domain （TS00） and full-length ectodomain （T1300） of TACE were amplified by RT-PCR, and the expres.sion plasmids were constructed by inserting T800 and T1300 into plasmid pET-28a and pET-28c respectively. The recombinant TS00 and T1300 were induced by IPTG, and SDS-PAGE and Western blotting analysis results revealed that TS00 and T1300 were highly expressed in the form of inclusion body. After Ni^2＋-NTA resin affinity chromatography, the recombinant proreins were used in the screening of TACE-binding peptides from phage display peptide library respectively. After 4 rounds of biopanning, the positive phage clones were analyzed by ELISA, competitive inhibition assay and DNA sequencing. A common amino acid sequence （TRWLVYFSRPYLVAT） was found and synthesized. The synthetic peptide could inhibit the TNF-α release from LPS-stimulated human peripheral blood mononuclear cells （PBMC） up to 60.3%. FACS analysis revealed that the peptide mediated the accumulation of TNF-α on the cell surface. These results demonstrate that the TACE binding peptide is an effective antagonist of TACE.     

人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)功能区表位。方法 应用差减筛选法,以抗hTERT多克隆抗体为靶筛选噬菌体12肽库,通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果 经3轮筛选,从随机挑取的24个噬菌体克隆中有13个克隆特异地与抗hTERT多抗结合,而不与正常小鼠IgG结合,其中11个克隆的氨基酸序列富含组氨酸(最高达41.6%)及亲水氨基酸(最高达91.67%)。结论 得到11个序列不同的hTERT表位,为研制针对hTERT的小分子抑制剂提供了实验依据。     

应用噬菌体肽库研究银屑病相关的角蛋白K14,K17模拟表位

目的：获得与银屑病相关的角蛋白K14和K17同源序列的模拟表位,评估含有此基序的短肽与银屑病发病的关系。方法：将1株抗角蛋白K14和K17同源序列的单克隆抗体（mAb）5G经亲和层析纯化后进行生物素标记,对噬菌体递呈的随机6肽库进行3轮淘洗并进行ELISA检测。挑取10个阳性克隆进行DNA测序,分析所获数据,并进行竞争阻断实验。结果：氨基酸序列 分析表明模拟短肽的基序为VL（x)AG,角蛋白K14、K17的同源序列及链球菌M蛋白均含有此基序。携有这些短肽的噬菌体可与mAb5G5特异结合,并可阻断单抗与角蛋白反应。结论：含有此基序的短肽可以模拟mAb5G5识别的与银屑病相关的角蛋白K14和17同源序列的抗原表位,为银屑病特异性短肽的研究提供了一个新短径,同时也为肽疫苗用于银屑病的治疗提供了崭新的思路。     

运用噬菌体展示随机肽库筛选与内毒素结合的高亲和性多肽

目的 从噬菌体展示随机肽库中筛选与内毒素结合的多肽序列,并进行鉴定.方法 以内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)为靶分子对噬菌体展示随机十二肽库进行4轮亲和筛选,获得与LPS结合的噬菌体克隆,应用结合实验和克隆斑抑制实验进一步确证.挑选结合力强的克隆进行DNA测序,推导出呈现的多肽序列,应用生物信息学软件进行多肽序列分析和同源性分析.结果 经4轮亲和筛选从噬菌体展示随机十二肽库中筛选获得了86个克隆,挑选12个结合力强的克隆进行DNA序列测序及生物信息学分析,结合本项目组的噬菌体展示随机七肽库筛选结果推导出呈现的多肽序列为HWQWPHWSPPP(命名为P11肽).检索相关数据库发现此肽序列未被申请专利,体内约908种蛋白与其结构相匹配,其中包含有与LPS相互作用的位点.结论 通过对噬菌体展示随机肽库的淘选,获得与LPS结合的高亲和性多肽,为进一步以这些多肽为先导物进行定向进化研究提供了实验依据和结构基础.     

噬菌体肽库筛选隐丹参酮高亲和性结合肽

通过噬菌体十二肽库,以隐丹参酮为靶分子,筛选与隐丹参酮具有高亲和性的结合短肽。经过噬菌体十二肽库的3轮淘选,获得阳性噬菌体克隆,挑选结合力强的克隆进行测序,得到隐丹参酮的高亲和性结合短肽序列,并进行生物信息学分析。本试验共筛选到10个隐丹参酮的高亲和性结合短肽序列,有614种蛋白质与其结构相匹配。多肽序列的核心序列为VILDFGEI。本研究获得了与隐丹参酮结合的高亲和性多肽,为深入研究隐丹参酮的作用靶点以及分子作用机制提供了实验依据和结构基础。     

用噬菌体随机12肽库筛选单纯疱疹病毒2型gD基因模拟抗原表位的研究

目的用针对HSV-2gD的单克隆抗体（McAb）从噬菌体展示随机12肽库中筛选HSV-2gD基因的抗原模拟表位，寻找更有效的小片段短肽作为HSV新型基因工程疫苗的候选抗原。方法利用HSV gD McAb淘筛噬菌体随机12肽库，经“吸附-洗脱-扩增”的4轮筛选，随机挑取噬菌体克隆经酶联免疫吸附实验（ELISA）进行鉴定，并对阳性克隆所携带的外源DNA片段进行序列测定和计算机辅助分析。结果经4轮生物淘筛后特异性噬菌体克隆得到了富集，对阳性克隆的分析结果表明P-PLW和PYH--H氨基酸序列是模拟妒基因抗原表住的骨架结构，携有此短肽的噬菌体可以与McAb特异结合。结论从噬菌体随机12肽库中筛选到的外源序列可以模拟HSV-2 gD McAb针对的抗原表位，可能是HSV-2gD一个抗原表住的替代抗原，为进一步研究HSV-2基因疫苗奠定了基础。     

噬菌体展示随机十五肽库的构建

为了满足药物筛选的需要,本实验以pCANTAB 5E噬菌粒为载体,构建表达于丝状噬菌体尾丝蛋白P3N末端的随机十五肽库。通过自行设计引物与模板,人工合成编码随机十五肽的寡核苷酸片段及含有酶切位点的引物。通过PCR技术进行模板扩增获得编码随机十五肽的基因。将扩增后的目的基因经过Sfi Ι,Not Ι两个限制性内切酶双酶切后,与经同样双酶切的5′去磷酸化的噬菌粒载体连接,将重组产物电转入大肠埃希菌TG1感受态细胞。集合菌落后进行库容和多样性检验。所建肽库库容可达5×10⁸。随机挑取20个克隆测序,其核苷酸序列及推断出的氨基酸序列均随机。成功构建了库容量与多样性都满足筛选要求的噬菌体展示随机十五肽库。     

噬菌体展示肽库技术应用的研究进展

噬菌体展示肽库技术是一种新的肿瘤筛选技术，它将随机多肽文库表达于丝状噬菌体的表面，使高通量筛选多肽配体变得容易些。该技术在研究蛋白质之间的相互作用、寻找肿瘤特异性抗原和治疗性靶肽以及在新型诊断试剂和疫苗研制中都有重要用途。