抗转化生长因子β1预防和治疗瘢痕疙瘩的研究

目的探讨anti-TGF-β1在体外及动物模型实验中对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及意义.方法用电镜观察anti-TGF-β1作用后体外培养及动物模型成纤维细胞的形态学变化,用MTT法和3H-脯氨酸掺入等方法,检测anti-TGF-β1对体外培养的成纤维细胞的增殖和胶原蛋白合成的影响;用免疫组化技术观测anti-TGF-β1对动物模型中瘢痕疙瘩Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的影响.结果 anti-TGF-β1能明显影响成纤维细胞的超微结构及抑制其增殖和胶原蛋白的合成(P＜0.01).抑制作用在10 μg/ml时最大,抑制率达72%.对动物模型中瘢痕疙瘩Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白有明显的抑制作用,胶原高表达率实验组为33.3%,对照组为88.9%(P＜0.01).结论在体外及动物模型实验中,anti-TGF-β1均能中和TGF-β1促进成纤维细胞增殖和胶原合成的作用,提示anti-TGF-β1将来可应用在临床预防治疗过度增生的瘢痕.     

抗转化生长因子β_1预防和治疗瘢痕疙瘩的研究

目的　探讨anti-TGF - β1在体外及动物模型实验中对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和胶原合成的影响及意义。方法　用电镜观察anti-TGF - β1作用后体外培养及动物模型成纤维细胞的形态学变化 ,用MTT法和3 H -脯氨酸掺入等方法 ,检测anti-TGF - β1对体外培养的成纤维细胞的增殖和胶原蛋白合成的影响 ;用免疫组化技术观测anti-TGF - β1对动物模型中瘢痕疙瘩Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的影响。结果　anti -TGF - β1能明显影响成纤维细胞的超微结构及抑制其增殖和胶原蛋白的合成 (P <0 .0 1)。抑制作用在 10 μg/ml时最大 ,抑制率达 72 %。对动物模型中瘢痕疙瘩Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白有明显的抑制作用 ,胶原高表达率实验组为 33.3% ,对照组为 88.9% (P <0 .0 1)。结论　在体外及动物模型实验中 ,anti-TGF - β1均能中和TGF - β1促进成纤维细胞增殖和胶原合成的作用 ,提示anti-TGF - β1将来可应用在临床预防治疗过度增生的瘢痕     

反义TGF-β1抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的研究

目的 应用反义技术抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞（KF）体外增殖,为应用基因治疗手段改善创伤愈合提供实验依据。方法 应用脂质体将反义TGF－β1转染至KF,通过细胞计数绘制细胞生长动力学曲线,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。结果 ①转染反义TGF－β1的KF体外增殖明显降低。②与未转染反义TGF－β1的KF相比,转染反义TGF－β1的KF凋 亡发生率明显增高（差异有显著性意义,P＜0．05）。结论 反义TGF－β1可抑制体外培养的KF增殖,并促进KF的凋亡。     

体外培养人成纤维细胞转化生长因子-β1自分泌规律的研究

目的　探讨体外培养人成纤维细胞转化生长因子 -β1 (TGF-β1 )的自分泌规律。方法　应用健康人包皮环切术所得包皮 ,通过体外成纤维细胞传代培养共 12代 ,运用 EL ISA法 ,分别检测不同代次成纤维细胞 TGF-β1 浓度 ,并测定第 6代成纤维细胞在不同时间培养上清液中 TGF-β1 的浓度。结果　自第 3代开始 ,成纤维细胞培养上清液可检测到 TGF-β1 ,并逐渐升高 ,至第 6代达分泌高峰 (45 0 ng/ L ) ,第 11、12代不能测到 ;而第 6代成纤维细胞 ,培养上清液中 TGF-β1 含量以第 5天的检测值最高 (6 80 ng/ L ) ,是第 1天检测值 (2 80 ng/ L )的 2 .5倍。结论　成纤维细胞 TGF-β1 自分泌能力 ,是由弱到强再逐渐减弱的过程 ,有自我调节能力     

白介素1β对增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中成纤维细胞的表皮生长因子、表皮生长因子受体及转移生长因子βR1的影响

目的　研究白介素 1β(interleukin 1,IL 1β)对正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的成纤维细胞的表皮生长因子 (EGF)、表皮生长因子受体 (EGFR)、转移生长因子 βR1(TGFβR1)的作用。方法　将体外培养 5代之内的 6例瘢痕疙瘩、6例增生性瘢痕及 6例正常皮肤的成纤维细胞分别置于含IL 1β( 2 0 0U/ml)的 10 %胎牛血清DMEM培养液中 ,孵育 3d ,免疫细胞化学染色显示EGF、EGFR、TGFβR1。结果　正常皮肤、增生性瘢痕、瘢痕疙瘩各组中成纤维细胞的EGF相对含量分别为 162 .0 0±2 0 .79;15 1.0 0± 2 6.45 ;147.5 0± 2 3 .61。EGFR含量分别为 148.3 4± 13 .72 ;13 6.67± 17.5 2 ;13 1.67±11.71。TGFβRI 含量 113 .5 2± 17.62 ;10 6.71± 2 1.43 ;10 7.5 4± 2 3 .5 2。三者成纤维细胞EGF、EGFR和TGFβRI 含量差异无显著性 (P >0 .0 5 )。加入IL 1β后 ,成纤维细胞EGF、EGFR和TGFβRI 相对含量 :正常皮肤为 2 2 4.0 0± 3 1.5 9、178.67± 2 7.86和 80 .3 4± 11.75 ;增生性瘢痕为 12 8.75± 18.3 1、10 5 .82± 2 1.61和 10 9.83± 2 5 .79;瘢痕疙瘩 113 .0 1± 2 4.71、93 .3 4± 3 0 .71和 118.75± 19.2 7。正常皮肤成纤维细胞EGF和EGFR相对含量明显高于增生性瘢痕和瘢痕疙瘩 (P <0 .0 5 ) ,正常皮肤     

转化生长因子-β1对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad3、7mRNA表达的影响

研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)Smad3、7mRNA表达的影响。方法：用RT-PCR法分别检测TGF-β1不同浓度(0，5，50，500pmol／1：Smad3 mRNA 24h，smad7 mRNA 90min)和TGF-β1(500pmol／1)作用不同时间(Smad3 mRNA：1，2，4，24，48h；Smad7 mRNA：0．5，1，1，5，2，4，24h)对Smad3、7mRNA表达的影响。结果：Smad3 mRNA水平随TGF-β1浓度的增加而呈浓度依赖性下降；5pmol／lTGF-β1就能使Smad7 mRNA水平明显地升高，并随TGF-β1浓度加大而略有改变；随作用时间延长，Smad3mRNA水平逐渐下降，在作用48h后下降到最低，呈时间依赖性。而Smad7 mRNA水平在细胞受到TGF-β1刺激后l20min即达到最高值。结论：TGF-β1能使KFB细胞Smad3 mRNA发生配体依赖性的下调，而使Smad7 mRNA表达迅速增加。     

阻断转化生长因子β1自分泌环对骨肉瘤细胞恶性表型的影响

[目的]观察阻断转化生长因子β1(TGFβ1)自分泌环对骨肉瘤细胞恶性表型的影响。[方法]将反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞MG-63,G418筛选14d后获得转染细胞系MG-TGFβ1(-)。取MTT法检测转染细胞增殖活性,并观察细胞软琼脂克隆形成数和裸鼠体内致瘤能力。[结果]与MG-63和空载体转染细胞MG-pcDNA3相比,MG-TGFβ1(-)细胞增殖活性明显受到抑制。MG-TGFβ1(-)的软琼脂克隆形成数(28·2±5·6)比MG-63组(48·6±8·1)和MG-pcDNA3组(45·2±4·7)明显减少,裸鼠体内形成肿瘤的体积(83·4±27·4)mm3也明显小于MG-63组(191·3±21·5)mm3和MG-pcDNA3组(204·2±30·7)mm3。[结论]反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞可以逆转肿瘤细胞的恶性表型,进一步的研究将有助于提高骨肉瘤的治疗效果。     

阻断转化生长因子-β1自分泌环对骨肉瘤细胞生物学活性和化疗药物敏感性的影响

目的　观察阻断转化生长因子 β1(TGF β1)自分泌环对肿瘤细胞增殖活性和化疗药物敏感性的影响。方法　将反义TGFβ1基因转染骨肉瘤细胞MG 63 ,采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法 (MTT)检测细胞增殖活性。以含 0、0 .2 5、0 .5 0、0 .75、1.0 0mg/L阿霉素 (ADR)的培养基培养转染细胞 48h后 ,采用3 H TdR掺入法检测细胞化疗药敏感性。结果　MG 63和空载体转染细胞增殖活性为 0 .197± 0 .0 15和 0 .195± 0 .0 2 1,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。反义TGF β1转染细胞增殖活性为 0 .162± 0 .0 17,生长明显缓慢 ,对ADR敏感性明显增强 ,与对照组比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。讨论　通过阻断TGF β1自分泌环以降低骨肉瘤表达TGF β1,可以抑制细胞增殖活性 ,增加细胞对化疗药敏感性     

转化生长因子-β1Ⅱ型受体基因在瘢痕疙瘩中改变的实验研究

目的通过检测瘢痕疙瘩中的转化生长因子-β1Ⅱ型受体（TβRⅡ）PolyA与CA重复序列两个基因突变热点的改变情况，论证瘢痕疙瘩是否与肿瘤具有相同的基因改变。方法选取瘢痕疙瘩标本20例、正常皮肤标本8例，提取标本中的DNA；在TβRⅡ基因PolyA位点和CA重复序列两个突变热点两侧设计并合成引物，利用PCR仪扩增，对PCR产物进行单链构象多态性分析（PCR—SSCP），PCR产物纯化后自动测序仪鉴定基因突变的位点和类型。结果PCR—SSCP显示，20例瘢痕疙瘩标本的TβRⅡPolyA位点有4例、CA重复序列有1例显示泳动条带较正常加快，且均缺失了1bp；基因测序发现，4例SSCP阳性的瘢痕疙瘩标本TβRⅡ PolyA位．点均出现一个A的缺失突变，正常皮肤基因序列正常；CA重复序列基因测序未见异常。结论瘢痕疙瘩组织中的TβRⅡ PolyA和CA重复序列位点表现出类似肿瘤中所发现的基因缺失突变。     

结缔组织生长因子介导转化生长因子β1促进瘢痕成纤维细胞转分化的研究

目的 了解结缔组织生长因子(CTGF)介导TGF-β1发挥促人增生性瘢痕Fb(HSFb)转分化的作用.方法 体外培养人HSFb,取5份细胞标本分别加入不同浓度TGF-β1(0、2.5、5.0、7.5、10.0 ng/mL),作用48 h后待测.余下标本分为:空白对照组;CTGF刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人CTGF;TGF-β1刺激组,培养液中加入终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1;CTGF反义寡脱氧核苷酸(ASODN)转染组,细胞转染CTGF ASODN后,加入培养液;CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组,细胞转染CTGF ASODN后2 h,加人含终浓度10.0 ng/mL重组人TGF-β1的培养液.蛋白质印迹法分析不同浓度TGF-β1刺激对细胞CTGF表达的影响,比较各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达变化;流式细胞仪检测α-SMA阳性细胞百分率.结果 TGF-β1浓度为10.0 ng/mL时,CTGF的表达明显高于未受刺激的细胞(P<0.05).CTGF刺激组与TGF-β1刺激组α-SMA表达明显高于空白对照组(P<0.01).CTGF ASODN转染组以及CTGF ASODN转染+TGF-β1刺激组α-SMA表达与空白对照组接近(P>0.05).上述各组细胞α-SMA阳性细胞百分率依次为(10.8±2.8)%、(29.1±4.0)%、(28.7±4.8)%、(10.7±2.3)%、(14.3±2.9)%,统计学分析结果类似于α-SMA表达.结论 CTGF是TGF-β1发挥促人HSFb转分化的重要下游效应分子之一.     

单发性与多发性瘢痕疙瘩转化生长因子-β1Ⅱ型受体Poly A位点基因突变研究

目的 检测瘢痕疙瘩组织转化生长因子-β1 Ⅱ型受体（transforming growth factor-β1 receptorⅡ，TβR Ⅱ）PolyA位点基因突变情况，探讨单发性与多发性瘢痕疙瘩发病机制差异。方法 瘢痕疙瘩标本20例，单发性14例，多发性6例，提取组织中DNA；在TβR Ⅱ基因PolyA位点两侧设计并合成引物，利用PCR仪扩增-TβRⅡ DNA；对PCR产物进行单链构象多态性分析（PCR—SSCP）；PCR产物纯化后，利用自动测序仪鉴定基因突变的类型。结果 瘢痕疙瘩组织中TβR ⅡR PolyA位点表现出基因缺失突变，其阳性率多发性瘢痕疙瘩为50％（3／6），单发性瘢痕疙瘩为7．1％（1／14），二者差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 多发性与单发性瘢痕疙瘩发病机制可能不同。     

转化生长因子-β_1Ⅱ型受体基因在瘢痕疙瘩中改变的实验研究

目的通过检测瘢痕疙瘩中的转化生长因子-β1Ⅱ型受体(TβRⅡ)PolyA与CA重复序列两个基因突变热点的改变情况,论证瘢痕疙瘩是否与肿瘤具有相同的基因改变。方法选取瘢痕疙瘩标本20例、正常皮肤标本8例,提取标本中的DNA;在TβRⅡ基因PolyA位点和CA重复序列两个突变热点两侧设计并合成引物,利用PCR仪扩增,对PCR产物进行单链构象多态性分析(PCR-SSCP),PCR产物纯化后自动测序仪鉴定基因突变的位点和类型。结果PCR-SSCP显示,20例瘢痕疙瘩标本的TβRⅡPolyA位点有4例、CA重复序列有1例显示泳动条带较正常加快,且均缺失了1bp;基因测序发现,4例SSCP阳性的瘢痕疙瘩标本TβRⅡPolyA位点均出现一个A的缺失突变,正常皮肤基因序列正常;CA重复序列基因测序未见异常。结论瘢痕疙瘩组织中的TβRⅡPolyA和CA重复序列位点表现出类似肿瘤中所发现的基因缺失突变。     

转化生长因子β在增生性瘢痕形成中的作用及其信号转导机制

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血小板源性生长因子受体-β在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达

目的 从细胞及组织水平检测血小板源性生长因子受体－β（ＰＤＧＦＲ－β）在正常皮肤及瘢痕疙瘩中的表达及分布,探讨ＰＤＧＦＲ－β在瘢痕疙瘩形成中的生物学作用。方法①应用免疫组织化学技术检测ＰＤＧＦＲ－β在正常和瘢痕疙瘩组织中的分布;②应用免疫荧光、流式细胞仪检测正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞群体的ＰＤＧＦＲ－β的表达;③应用免疫荧光、激光共聚焦显微镜检测ＰＤＧＦＲ－β的亚细胞分布。结果 ①免疫组织化学正     

γ干扰素对瘢痕疙瘩成纤维细胞转化生长因子β/Smad信号通路的作用

目的 了解γ干扰素(IFN-γ)对瘢痕疙瘩Fh(KFb)中TGF-β/Smad信号通路的作用,探讨IFN一γ治疗病理性搬痕的可能机制. 方法 切取3例患者的瘢痕组织,体外分离培养KFb,实验选用第3～5代细胞.(1)将KFb分为:对照组,加无血清DMEM培养;TGF-β_1组,用10 ng/mL的TGF-β_1单独作用;IFN-γ组,用100 ng/mL的IFN-γ单独作用;TGF-β_1+IFN-γ组,10 ng/mL的TGF-β_1与100 nS/mL的IFN-γ联合作用.采用实时荧光定量RT-PCR、蛋白质印迹法和免疫荧光细胞化学染色法,分别检测结缔组织生长因子(CTGF)的mRNA、蛋白表达,以及α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达与阳性细胞表达情况.(2)另取KFb,用10 ng/mL的IFN-γ作用,于作用前及作用后30 min和1、2、4、6、8 h通过实时荧光定量RT-PCR检测Smad 3和Smad 7的mRNA表达,于作用前及作用后1、2、4、6、8 h用蛋白质印迹法检测Smad 3和Smad 7的蛋白表达.(3)另取KFb,根据添加的IFN-γ终浓度不同分为1、10、100 ns/mL IFN-γ组,均作用4 h;设立未添加IFN-γ的KFb为对照组.同前检测各组Smad 3和Smad 7的mRNA及蛋白表达. 结果 (1)IFN-γ组KFb CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.017±0.009与1.198±0.004,较对照组(0.024±0.013与1.229±0.011)显著减少(P<0.05);TGF-β1+IFN-γ组CTGF的mRNA和蛋白表达量为0.634±0.138与1.204±0.010,较TGF-β_1组(1.331±0.298与1.727±0.004)显著减少(P<0.01).IFN-γ组KFb中,α-SMA阳性细胞荧光强度(0.922±0.059)和α-SMA蛋白表达量(0.3051±0.0031)较对照组(1.055±0.005与0.4513±0.0094)显著减少(P<0.01);TGF-β1+IFN-γ组SMA阳性KFb荧光强度(1.129±0.004)和SMA蛋白表达量(0.6734±0.0098)较TGF-β_1组(1.270±0.005与1.38420.0024)显著减少(P<0.01).(2)10 ng/mL IFN-γ作用后第1个时相点,Smad 3的mRNA和蛋白表达量均出现一过性增高,随后降低,mRNA表达量于作用后4 h降至最低点,随后缓慢上升,至作用后8 h仍低于作用前(P<0.01);其蛋白表达量于作用后2~8 h显著低于作用前(P<0.01).而Smad 7的mRNA和蛋白表达量在INF-γ作用后逐渐增高,分别于作用后2、4 h达峰值随后降低,至作用后8 h仍高于作用前(P<0.05).(3)与对照组比较,1、10、100 ng/mL IFN-γ组Smad 3的mRNA及蛋白表达量显著减少(P<0.05或P<0.01),Smad 7的mRNA及蛋白表达量显著增加(P<0.05或P<0.01),且随IFN-γ浓度升高,减少或增高幅度愈为显著. 结论 IFN-γ呈时间和剂量依赖方式下调Smad 3、上调Smad 7,降低基础状态下或经TGF-β_1诱导后KFb的CTGF和α-SMA表达量,表现出对TGF-β/Smad 信号通路的显著拮抗作用,这可能是IFN-γ治疗病理性瘢痕的重要机制.     

17—β雌二醇、孕酮对增生性瘢痕成纤维细胞转化生长因子—β1合成的影响

目的 研究雌激素、孕激素对增生性瘢痕形成的影响。方法 体外培养增生性瘢痕成纤维细胞（HSFB）,利用免疫组化及计算机图像分析系统测定转化生长因子（TGF－β1）含量。结果 较对照组,17－β雌二醇（17－βE2）各组的HSFB胞浆内阳性信号明显加强（P＜0．05）;而孕酮（P）各组均不明显（P＞0．05）。结论 在体外,17－βE2可以明显促进增生性瘢痕成纤维细胞的TGF－β1合成,而P的作用不明显。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞中转化生长因子 -βⅠ、Ⅱ型受体的表达及调控

目的：了解瘢痕疙瘩成纤维细胞中转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)－βⅠ、Ⅱ型受体的表达及TGF－β1,β3对其的影响。方法；体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFB）和正常皮肤成纤维细胞（NFB），利用免疫组化及计算机图像分析系统测定TGF-βⅠ、Ⅱ型受体含量。结果：KFB胞浆内阳性信号明显强于NFB（P＜0．05）；经TGF－β1,β3处理组胞浆内阳性信号差别均不明显（P＞0．05）。结论：KFB存在高表达的TGF－βⅠ、Ⅱ型受体；TGF－β1,β3均能促进KFB TGF－βⅠ、Ⅱ型受体的表达。     

阻断转化生长因子—β信号转导抑制成纤维细胞增殖和I型胶质合成

目的：研究阻断转化生长因子-β（TGF－β）受体的信号转导对正常皮肤成纤维细胞增殖和I型胶原合成的调控。方法：组织块法体外培养皮肤成纤维细胞，加入缩短型TGF－βⅡ型受体的重组腺病毒（实验组，50pfu/cell)或β－半乳糖苷酶重组腺病毒（对照组，50pfu/cell)，培养后行细胞计数和Western Blot检测细胞增殖率和I型胶原合成状况。结果：缩短型TGF－βⅡ型受体在皮肤成纤维细胞的过度表达能有效抑制细胞增殖达34％－50％，并显著减少I型胶原的合成。结论：过度表达缩短型TGF－βⅡ型受体可以通过阻断TGF－β的信号转导来抑制成纤维细胞的细胞增殖和I型胶原合成。     

转化生长因子β1在增生性瘢痕中的表达及临床意义

目的 探讨转化生长因子β1在增生性瘢痕中的表达及临来意义。方法 采用免疫组化技术检测了67例增生性瘢痕和11例正常皮肤对照组中转化生长因子β1的表达。结果 转化生长因子β1在增生性瘢痕中表达的阳性率为100%，且高表达为54例，低表达为13例。11例正常皮肤仅有3例为低表达，阳性率27．27%。统计学分析两组间有显著差异(P＜0．01)。结论 转化生长因子β1在增生性瘢痕中的表达增强，提示转化生长因子β1可能参与了增生性瘢痕的形成并起眷重要的作用，故在预防和治疗烧伤后增生性瘢痕中具有一定的临来意义。