大鼠锌指蛋白ZFP580的原核表达与分离纯化

【目的】构建ZFP580基因的原核表达质粒,转化大肠杆菌,诱导表达并分离纯化大鼠锌指蛋白ZFP580。【方法】根据ZFP580 cDNA序列的开放阅读框设计引物,利用PCR技术扩增ZFP580的开放阅读框cDNA序列,将PCR扩增的目的片段与载体pET30a分别双酶切、回收纯化后做定向连接,Nco I、Xho I双酶切电泳筛选、鉴定并测序。将构建的重组质粒pET30a-ZFP580转化大肠杆菌BL21(DE3),由异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化目的蛋白。【结果】成功扩增ZFP580基因并构建了表达质粒pET30a-ZFP580,测序结果表明与GeneBank公布的序列一致。含有该质粒的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导表达后,产物蛋白分子量约为19 kDa。【结论】成功表达并纯化了大鼠ZFP580蛋白,为进一步研究锌指蛋白ZFP580的功能奠定了基础。     

C57BL／6J亚系Nnt部分功能基因丢失的检测

目的介绍一种判定C57BL／6小鼠亚系中烟酰胺核苷酸转氢酶（Nnt）基因是否丢失的PCR检测方法。方法用PCR方法分别对5只购自杰克逊的C57BL／6J小鼠以及10只本公司C57BL／6背景的转基因小鼠基因组DNA进行扩增,对扩增产物进行分析。结果从杰克逊实验室购得的5只C57BL／6J小鼠基因组以及本公司抽取的3只C57BL／6小鼠Nnt部分功能基因丢失,本公司C57BL／6中有6只小鼠含有Nnt基因未丢失,另外还有1只小鼠为Nnt基因杂合小鼠。结论在选择C57BL／6作为代谢性实验的模型时,应考虑选择适当的亚系。     

Bal b／c小鼠甘露聚糖结合凝集素—C基因的克隆与鉴定

目的：获得小鼠甘露聚糖结合凝集素－C（MBL－C）基因的全长编码区cDNA。方法：利用RT－PCR方法，从Balb/c小鼠的肝细胞中分离出MBL－C基因cDNA片段，将其克隆入PUC－T载体并测序，对基因结构及其与人MBL基因的同源性进行比较分析。结果：扩增得到的Bal b/c小鼠MBL－C基因cDNA全长735bp，编码245个氨基酸残基，包含了完整的编码区基因序列，经核苷酸序列比较分析发现，扩增得到的Bal b/c小鼠BL－C基因与Genbank中发表的序列具有100％的同源性，与人的MBL基因的同源性为71．4％。结论：成功地克隆到完整的Bal b/c小鼠MBL－C编码区基因，为进一步在整体水平研究MBL分子的天然免疫功能提供了必要的条件。     

MAGE-12的新B细胞表位抗原肽的设计、合成及免疫原性研究

【目的】设计合成肿瘤抗原MAGE-12的B细胞表位并研究其免疫原性。【方法】在预测MAGE-12的B细胞表位序列为LEQRSQHCKPEE(3~14)、MAGE-1282-93(QSDEGSSNEEQE)的基础上,采用4分枝多重抗原肽结构设计合成抗原肽,免疫C-57BL/6小鼠,产生多克隆抗体,应用ELISA实验检测多克隆抗体是否为抗原肽的特异性抗体。【结果】免疫C-57BL/6小鼠后可产生MAGE-12的抗原特异性的多克隆抗体。【结论】证明所预测的表位LEQRSQHCKPEE(3~14)为MAGE-12的新B细胞表位。     

Balb／c 与 C57 BL／6小鼠海马皮层突触素表达的比较

目的：比较突触素在Balb／c 与C57BL／6小鼠海马各区中表达的差异。方法采用 Balb／c和C57 BL／6小鼠各10只,心脏灌注多聚甲醛固定后取脑,使用冰冻切片机切片,通过免疫组织化学染色,观察突触素在Balb／c和C57BL／6小鼠海马各区中的表达。结果突触素在Balb／c和C57BL／6小鼠海马皮层各区均有广泛表达,突触素在C57BL／6小鼠海马CA1区锥体细胞层中的表达强度高于在Balb／c小鼠相同区域的表达强度（ P＜0.05）,在Balb／c小鼠中CA3区锥体细胞层中的表达强度高于在C57BL／6小鼠相同区域的表达强度（P＜0.05）。结论突触素在Balb／c和C57BL／6小鼠海马各区表达的差异可能是其行为学差异的神经解剖学基础。     

恶性疟原虫肝期抗原1基因3′端的克隆及序列分析

【目的】克隆并测定恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)肝期抗原 1基因 (LSA 1) 3′端序列 ,比较FCC1/HN株与国外分离株LSA 13′端序列的差异。【方法】应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增LSA 13′端序列 ,用T A克隆法将其克隆入pMD18 T载体。阳性克隆的重组质粒经酶切及PCR扩增鉴定后 ,用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定。应用DNASTAR软件进行不同分离株LSA 13′端序列的同源性分析。【结果】PCR扩增得到特异的FCC1/HNLSA 13′端序列。酶切及PCR鉴定获得了正确的 pT LSA 1重组质粒。测序表明 ,所克隆的LSA 13′端大小为 795bp ,编码 2 6 4个氨基酸。序列分析表明 ,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的NF5 4、T9/ 96、KEN、PNG及BRA株LSA 13′端编码的氨基酸序列只在 3个位点存在不同。【结论】克隆了恶性疟原虫FCC1/HNLSA 13′端片段。序列测定及同源性分析表明 ,FCC1/HNLSA 13′端序列与其它分离株有高度的同源性。     

创伤反应早期BALB/C和C57BL/6小鼠肝组织基因表达谱比较研究

目的：探讨BALB/C和C57BL/6小鼠创伤反应差异性的分子遗传学机制。方法：利用基因芯片技术对BALB/C和C57BL/6小鼠在创伤后1h和6h肝组织基因表达谱进行比较研究。对在两种小鼠创伤反应早期差异表达的基因进行聚类分析。结果：对1327条差异表达的基因进行聚类分析后发现有两大族基因的表达在BALB/C小鼠和C57BL/6小鼠创伤后早期存在明显差异，BALB/C小鼠糖类代谢，脂类代谢和激素代谢活跃，细胞信号转导以G蛋白信号通路和Ca^2 信息通路激活为主，而且与组织损伤相关的基因也出现高表达，而C57BL/6小鼠急性时相反应和免疫反应被激活。细胞凋亡途径被抑制，细胞信号转导以酪氨酸蛋白激酶系统激活为主要特征，结论：BALB/C和C57BL/6小鼠的创伤反应差异性可能与它们在创伤后基因组的表达方式不同相关。     

HPV16型E6C真核表达质粒的构建及其免疫小鼠后对T细胞增殖的影响

目的研究HPV16型E6早期蛋白C端编码区基因片段(E6C)免疫小鼠的作用。方法利用基因重组技术构建含HPV16型E6C的真核表达质粒,用此质粒肌肉注射免疫C57BL／6小鼠,观察该疫苗对小鼠T细胞增殖的影响。结果实验组小鼠T细胞与对照组相比,增殖明显增强。结论应用该质粒能够诱导机体的细胞免疫反应增强,为乳头瘤病毒相关疾病的预防和治疗提供了思路。     

青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA的克隆与测序

【目的】克隆青蒿鲨烯合酶基因,为基因工程改造青蒿打下基础。【方法】采用聚合酶链反应(PCR)扩增、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增、扩增片段与T-载体连接和克隆片段的序列分析等方法。【结果】通过PCR扩增和RT-PCR扩增,分别获得3590bp及1257bp片段,克隆后经PCR和酶切反应进行了鉴定。初步测序结果与GenBank上已登录的青蒿鲨烯合酶基因序列同源性为99％,氨基酸序列同源性为100％。【结论】成功克隆了青蒿鲨烯合酶基因及其cDNA。     

A型流感病毒HA（H1N1）基因真核表达载体的构建及序列分析

【目的】构建A型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)基因真核表达载体，研究其作为DNA疫苗的免疫效果。【方法】从流感病人体内分离流感病毒(A／Guangdong／376／2001／HlNl)，提取RNA，用特异引物进行RT-PCR，扩增HA基因，先将其克隆到pMDl8-T Vector，进行序列测定和分析；然后将HA基因亚克隆到真核表达载体(pCI-neo)，进行鉴定。【结果】获得一个核苷酸长度为l698bp的基因，编码565个氨基酸；同源性比较结果表明：和A／Hong Kong／113l／98((GenBank／NCBI：AF386775)有98％同源，序列分析表明有10个氨基酸出现变异；酶切和序列测定表明肌基因正确插入pCI-neo载体(HA-pCIN)。【结论】 HA基因真核表达载体的成功构建，可以进一步研究其免疫功能。     

马兜铃酪氨酸脱羧酶基因克隆、测序及同源性分析

【目的】从中草药马兜铃中获得酪氨酸脱羧酶基因(tyrDC)互补DNA(cDNA)序列并进行同源性分析，以进一步达到敲除tyrDC，减轻该药肾毒性的目的。【方法】参照已知的植物酪氨酸脱羧酶的保守性氨基酸序列设计简并引物，并通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从马兜铃中扩增出cDNA片段。将扩增的cDNA序列克隆并测序，用以设计特异引物，并通过cDNA末端快速扩增(Rapid Ampli6cation of cDNA Ends，RACE)从马兜铃中扩增出全长tyrDC cCNA。【结果】该克隆的tyrDC cDNA的总长度为1678bp，包括一个编码516个氨基酸的1551bp开读框(ORF)和一段127bp的下游非翻译区(3’UTR)。序列比较结果表明，由马兜铃tyrDC核苷酸序列推导的氨基酸序列分别与已发布的罂粟酪氨酸脱羧酶和唐松草酪氨酸／多巴脱羧酶享有76％和79％的同源性。【结论】从马兜铃中扩增得到tyrDC cDNA全序列，且对酪氨酸脱羧酶的同源检索显示，不同植物的酪氨酸脱羧酶之间都存在普遍的序列相似性。为去除马兜铃肾毒性奠定了基础。     

浙贝母环阿屯醇合成酶基因5`-RACE快速扩增及序列分析

[目的]克隆浙贝母环阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase,CAS)5`末端cDNA序列。[方法]利用简并引物及RT-PCR方法获得CAS的核心基因,应用cDNA末端快速扩增(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术快速克隆5`末端片段,采用NCBI网站上的Protein Blast软件进行氨基酸同源性比对。[结果]从浙贝母叶片中成功地克隆出一条长691bp的CAS基因5`末端cDNA片段,含起始密码子及163bp的5`延伸区。对5`末端的150个氨基酸同源性分析表明,该片段与C.asiatica,G.glabra,A.thaliana,W.somnifera的CAS同源性分别达72%,66%,71%,71%。[结论]上述结果表明所克隆的片段为浙贝母CAS的5`末端序列,为下一步CAS全长基因的克隆及CAS在浙贝母次生代谢中的功能研究打下基础。     

流感病毒A/FM/47(H1N1)血凝素基因克隆、序列分析

目的对流感病毒A/Font Monmouth/47(H1N1)血凝素基因进行变异分析。方法用SPF鸡胚增殖毒株,提取病毒基因组总RNA,应用RT-PCR技术扩增该病毒株的HA基因,并克隆到pMD18-T载体上,测定HA基因核苷酸序列。结果该毒株的HA基因全长为1677bp,含有完整的阅读框架,编码545个氨基酸;BLAST序列比对结果显示,该毒株HA基因与其他H1基因核苷酸的同源性为98%。结论该毒株HA核苷酸序列发生了变异,出现多处碱基替换,可能是病毒毒力增强的原因。     

小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)原核表达载体pQE31-MIF的构建

目的 :获得小鼠巨噬细胞移动抑制因子(MIF)全长基因克隆 ,并构建重组表达载体pQE3 1 MIF。方法 :用RT PCR技术 ,以特异性寡核苷酸为引物 ,从小鼠脾脏总RNA中扩增MIF基因 ,插入pMD1 8 T载体 ,用限制性核酸内切酶和DNA序列分析鉴定重组克隆。构建并鉴定原核表达载体pQE3 1 MIF。结果 :成功克隆了小鼠MIF基因 ,构建了重组质粒pMD1 8 MIF及重组原核表达质粒。序列分析显示获得的MIF基因cD NA序列与文献报导一致。结论 :成功构建了重组表达质粒pQE3 1 MIF ,为进一步深入研究MIF蛋白的生物学活性奠定了基础     

Cloning of Mouse Enamel Matrix Serine Proteinase Encoding Mature Protein

目的 :克隆小鼠牙胚组织中釉基质丝氨酸蛋白酶 ( EMSP1 )成熟肽编码区基因。方法 :提取出生后 7d昆明种小白鼠切牙、磨牙牙胚总 RNA,逆转录为 c DNA,设计两对特异性引物 ,采用 Touchdown PCR和嵌套 PCR方法 ,扩增出小鼠 EMSP1起始密码子至终止密码子基因片段。将目的基因连入载体 p MD- 1 8T,转化入大肠杆菌 JM1 0 9,通过蓝白筛选 ,挑选阳性克隆培养扩增 ,纯化重组质粒进行限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定。结果 :限制性酶切图谱和核苷酸序列分析均表明所克隆 c DNA为小鼠 70 0 bp的 EMSP1成熟肽基因编码。结论 :成功地克隆了小鼠编码EMSP1成熟肽基因片段     

小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因表达检测及真核表达载体构建

目的 检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mCD99L2基因,构建真核表达载体。方法 设计寡核苷酸探针。应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mCD99L2基因含编码区全长cDNA,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR获取含mCD99L2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoRI和Xho I双酶切取所需目的片段．利用分子克隆技术与pcDNA3．1／MycHisC（＋）质粒重组,对产生的重组子进行PCR、双酶切鉴定,并经过测序证实。结果 原位杂交方法检测A20细胞中mCD99L2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mCD99L2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结果与GenBank提供的已知序列（NM—138309）比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3．1．mCD99L2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99L2基因相应序列比较,100％同源。结论 小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在mCD99L2基因,采用RT-PCR和T．A技术克隆了A20细胞的mCD99L2基因,成功构建了pcDNA3．1．mCD99L2真核表达载体,为下一步探索mCD99L2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。     

小鼠β趋化因子受体CCR5基因的克隆

目的：克隆小鼠β趋化因子相关的受体并研究其表达。方法：使用共同引物用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔巨噬细胞的Ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ＲＮＡ中扩增出一０．５ｋｂ ｃＤＮＡ，再根据其序列，设计一特异引物，用Ｍａｒａｔｈｏｎ ＰＣＲ法扩增得一２．８ｋｂ ｃＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｍ方法检测分析该ＡＤＬＤ，Ｎｒｔｈｅｒｎ方法分析其表达。结果：成功克隆出小鼠ＣＣＲ５ ｃＤＮＡ，其开放阅读框为１０６５ｂｐ，     

ZNF580基因原核表达载体的构建与鉴定

【目的】构建ZNF580基因原核表达载体,为获得大量重组ZNF580蛋白并制备其多克隆抗体奠定基础。【方法】根据ZNF580cDNA序列的开读框架设计上、下游引物,利用PCR技术扩增ZNF580开放阅读框cD-NA序列,将PCR扩增的目的片段与载体pET30a分别双酶切、回收纯化后做定向连接,EcoRI、XhoI双酶切电泳筛选、鉴定并测序。【结果】双酶切pET30a-ZNF580,电泳分析插入片段长度为524 bp,与预期的结果一致,经连接点两端进行测序,测序结果显示接头两端序列连接正确。【结论】成功构建原核表达载体pET30a-ZNF580。     

AdPPO4基因部分序列的cDNA克隆与序列分析

目的克隆大劣按蚊(An dirus)前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)基因部分序列.方法根据已报道的多种昆虫以及冈比亚按蚊PPO基因编码的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊幼虫总RNA为模板进行RT-PCR扩增,目的片段经TA克隆后测定其核苷酸序列,然后进行序列查询与比对.结果从大劣按蚊幼虫中获得的PPO4基因(AdPPO4)部分序列长597 bp,编码199个氨基酸;AdPPO4与冈比亚按蚊PPO4基因的核酸和氨基酸序列同源性分别达84%和90%.结论从大劣按蚊幼虫中成功地克隆出了AdPPO4基因的部分序列,与冈比亚按蚊PPO4基因具有很高的同源性.