Smad4 条件基因敲除小鼠前庭终器形态学研究

目的研究Smad4条件基因敲除小鼠前庭终器形忿改变，探讨Smad4基因对于前庭发育的作用。方法利用建立的Smad4条件基测敲除小鼠模型．通过光镜观察Smad4（＋／＋）、Smad4（＋／-）与Smad4（-／-）三种基因型小鼠（0．5、1．5月龄）的球囊及囊斑、椭圆囊及囊斑、半规管及壶腹嵴、前庭神经节、内淋巴管与囊的形态结构、毛细胞的形态及排列缺失情况。通过扫描电镜观察球囊斑、椭圆囊斑和壶腹嵴的形态结构、毛细胞及纤毛的排列缺失情况。结果Smad4（-／-）小鼠个体及内耳明显小于Smad4（＋／＋）和Smad4（＋／-），而后面二者区别不大。所有小鼠的球囊及囊斑、椭圆囊及囊斑、半规管、前庭神经节、内淋巴管与囊的大小和结构正常，淋巴囊腔饱满，囊斑处的感觉上皮、耳石、毛细胞及纤毛排列整齐，没有发现明显的病变．三个基因型间没有差异。Smad4（-／-）小鼠壶腹嵴囊性变多且严重、后半规管壶腹嵴出现明显的副嵴、偶尔可见壶腹嵴感觉上皮空泡样变。壶腹嵴的毛细胞和支持细胞排列整齐，形态无明显改变，未见缺失。扫描电镜示球囊斑、椭圆囊斑、后、外、上半规管壶腹嵴正常，三个基因型之间没有差异。结论Smad4（-／-）小鼠的前庭终器有轻微病理改变，Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）小鼠的前庭终器形态结构基本正常．表明Smad4对于前庭终器的发育影响可能不明显。     

Smad4 条件基因敲除小鼠听功能初步研究

目的对Smadd条件基因敲除后三种不同基因型小鼠野生型＋／＋、杂合子＋／-、纯合子-／-进行听功能检查。初步确定Smadd条件基因敲除后小鼠的听力学表型特征，、方法对Smad4条件基因敲除后同窝出生的三种不同基因型小鼠野生型＋／＋、杂合子＋／-、纯合子-／-分别进行听性脑干反应（ABR）和听神经复合动作电位（CAP）的检查，判断Smadd条件基困敲除后三种基因型小鼠是否有听力的改变；如果听力有所改变．再将两种方法相结合以综合判断听力改变可能的病理部位。结果各个月龄的Smadd条件基因敲除后的纯合子小鼠各频率的ABR阈值均在100dBSPL以上，有的甚至在最大给声刺激都无法引出可识别的波形。野生型和杂合子小鼠都可以诱发出可辨别、可重复的ABR波形。听神经动作电位的结果与脑干诱发电位结果相似，纯合型小鼠各个频率均未引出动作电位波形，另外两种基因型小鼠可以引出稳定的CAP波形。结论Smadd条件基因敲除后小鼠由于基因的缺陷而出现了重度感音神经性耳聋，纯合子小鼠出现全聋。     

Smad5 基因缺陷导致小鼠听力重度损失

目的 观察Smad5基因敲除小鼠听功能的变化及其特点.方法 50只Smad5基因敲除的杂合子小鼠与25只野生型小鼠分成5组2周、4周、8周、12周、24周组.分别行脑干诱发电位(ABR)检测,刺激声用click及tone burst(8 kHz,16 kHz,32 kHz).结果 Smad5基因敲除杂合子小鼠2周、4周、8周、12周、24周click刺激ABR平均听阈分别为93±2.78 dB SPL;38.7±2.58 dB SPL;64.8±3.78 dB SPL;81.5±2.48 dB SPL;95.7±4.78 dB SPL.野生型小鼠平均听阈分别为99±2.78 dB SPL;38±3.65 dB SPL;32±1.78 dB SPL;32±2.70 dB SPL;47±5.78 dB SPL.经统计学处理,除2周和4周组P＞0.05两者听阈差异无显著性外,其他时间段P＜0.01,说明基因敲除小鼠与野生型小鼠听阈差异有显著性.tone burst(8 kHz,16 kHz,32 kHz)结果与click刺激ABR听阈结果基本一致.结论 Smad5基因敲除导致小鼠随月龄增加而听力损失加重.     

Smad5 基因敲除小鼠耳蜗扫描电镜观察

目的观察Smad5基因敲除杂合（3月组2只小鼠4只耳蜗）子小鼠内耳形态学超微结构变化。方法野生型动物组：1个月组4只小鼠5只耳蜗，2个月组及3个月组各有2只小鼠4只耳蜗：杂合子动物组1个月组3只小鼠3只耳蜗，2个月组2只小鼠4只耳蜗，3个月组3只小鼠6只耳蜗。按常规方法制成标本作扫描电镜观察。结果Smad5基因敲除杂合子小鼠扫描电镜观察：1月组耳蜗中均观察到耳蜗第一和第二圈外毛细胞有不同程度的静纤毛融合，未见外毛细胞缺失，内毛细胞未见明显地病理变化。2月组耳蜗中观察到第一和第二圈均可见内外毛细胞静纤毛不同程度缺失，有的部位以内毛细胞静纤毛缺失为主，而有的部位以外毛细胞静纤毛缺失为主，有的以片状缺失为主，有的则以散在性缺失为主。3个月组3只小鼠6只耳蜗中均观察到不同程度第一和第二圈内外毛细胞静纤毛广泛性缺失，有外毛细胞缺失的部位多，以第一排外毛细胞的静纤毛缺失为主．第二和第三排外毛细胞静纤毛多以散在性缺失为主，有内毛细胞缺失的部位多伴有外毛细胞静纤毛的大片状缺失。野生型动物组扫描电镜观察：1个月组4只小鼠5只耳蜗，2个月组2只小鼠4只耳蜗均未观察到内外毛细胞缺失和静纤毛的变化，3月组有少量的外毛细胞缺失。结论野生型小鼠2个月以内耳蜗毛细胞无明显变化．杂合子小鼠随着月龄的增加内外毛细胞缺失的程度逐渐加重。     

Smad4基因敲除对小鼠听力和前庭功能的影响

目的研究Smad4基因敲除（Smad4＋/-）小鼠听力和前庭功能的改变.方法检测Smad4基因敲除小鼠（1、2、3、6月龄）与同种同月龄的野生型（Smad4＋/＋）小鼠的ABR阈值.按Steal的方法测定小鼠的平衡功能,包括游泳试验、空间姿势反射,以及一般行为观察.结果 2、3、6月龄Smad4＋/-小鼠听力较同种野生型小鼠明显下降,两种基因型小鼠听阈有显著性差异（P〈0.01）,但1月龄的不同基因型小鼠听力水平无统计学差异（P〉0.05）.Smad4基因敲除小鼠与野生型小鼠外观和体重无明显差异（P〉0.05）,生后至6月龄的Smad4＋/-小鼠与野生型小鼠均无前庭功能异常和行为异常.结论单倍体Smad4基因敲除小鼠听力明显障碍,但前庭功能基本正常.表明Smad4对内耳的听觉有重要作用,可能存在着单倍体功能不全性;而单倍体Smad4基因缺失对于前庭功能影响可能不明显.     

Smad4条件基因敲除小鼠内耳前庭的组织学变化

目的 观察Smad4条件基因敲除小鼠内耳前庭的组织学变化,探讨Smad4基因在内耳前庭发育中的作用.方法 应用冰冻切片、免疫荧光化学、激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜、透射电镜等技术,观察软骨组织Smad4条件基因敲除小鼠内耳前庭组织形态的变化.结果 Smad4 -/-小鼠内耳软骨囊Smad4免疫反应阴性,Smad4+/-小鼠阳性,Smad4+/+小鼠强阳性,而在前庭感觉上皮——壶腹嵴和囊斑里Smad4免疫反应均呈阳性,三个基因型间没有差别;通过扫描电镜和透射电镜以及神经丝免疫荧光染色观察,三个基因型小鼠内耳前庭均未发现病变.结论 Smad4条件基因敲除小鼠的内耳软骨囊里Smad4基因被有效剔除,但其对内耳前庭的组织结构和形态影响有限.     

溶酶体保护蛋白/组织蛋白酶A基因敲除小鼠听力和耳形态学初步研究

目的研究溶酶体保护蛋白/组织蛋白酶A(protective protein/cathepsin A,PPCA)基因敲除小鼠听功能和耳形态学改变,探讨半乳糖唾液酸沉积症听力损害的病理生理机制。方法应用听性脑干反应(ABR)测试和颞骨连续切片,观察1月和2月龄的PPCA基因敲除纯合子(PPCA-/-)小鼠ABR反应阈和光镜下外耳、中耳及内耳形态改变,并以野生型(PPCA / )小鼠作对照。结果1月龄PPCA-/-小鼠ABR反应阈和耳形态无明显改变;2月龄时,短声和短音8、163、2 kHz反应阈较PPCA / 提高40~45 dB SPL,中耳黏膜增厚、听骨细胞囊泡化、变形和关节腔融合,血管纹增厚、螺旋神经节细胞、螺旋缘纤维细胞、前庭膜、基底膜及沿前庭阶外淋巴隙的间皮细胞囊泡化,但Corti器毛细胞及支持细胞正常。结论溶酶体保护蛋白/组织蛋白酶A缺乏可导致听力损害、中耳及耳蜗形态改变、中耳炎、听骨改变以及耳蜗螺旋神经节、血管纹、螺旋缘、前庭膜和基底膜等细胞的溶酶体储积,可能分别是传导性聋和感觉神经性聋的形成机制。     

Smad5 基因敲除对小鼠前庭功能的影响

目的 观察Smad5基因敲除对小鼠前庭功能的影响,探讨Smad5基因是否为前庭功能相关基因.方法 参照Petrosini报告的动物失衡行为评分方法,观察28只实验小鼠的平衡状态.对头偏,躯干卷曲,肢体外展,强迫环形运动,头震等五项前庭失衡症状进行综合评分.20只Smad5基因缺陷小鼠(+/-)和15只野生鼠(+/+)进行颈髓硬膜表面短声诱发电位检测前庭功能.结果 动物失衡行为评分方法 进行综合评分,两组实验小鼠得分均为0分,表明两组动物在平衡功能粗测上无明显异常.颈髓硬膜表面短声诱发电位(CDM-CEP)检测Smad5(+/-)小鼠峰值潜伏期在85 dB SPL、95 dB SPL和105 dB SPL分别为6.85±0.23 ms、6.78±0.20 ms和6.70±0.43 ms.Smad5(+/+)小鼠峰值潜伏期在85 dB SPL、95 dB SPL和105 dB SPL分别为6.15±0.23 ms、6.12±0.20 ms和6.37±0.43 ms.结论 Smad5基因敲除导致CDM-CEP的潜伏期延长,表明Smad5基因敲除对小鼠的前庭功能有一定影响.     

Smad4 基因在野生型和基因缺陷小鼠耳蜗内的定位和分布

目的检测Smad4基因任成年小鼠耳蜗中是否有表达及表达部位的分布情况，以进一步研究Smad4基因在内耳发育以及听功能调控上的作用。方法动物由军事医学科学院发育和疾病遗传学研究室杨晓研究员提供．动物获取是在C57BL／6J和Blackswiss两种遗传背景的小鼠应用Cre—LoxP系统进行条件基因打靶，于小鼠胚胎早期在软骨细胞内将Smad4基因剔除，并生成同窝三种基因型小鼠-野生型Smad4＋/＋，杂合子Smad4＋／-，纯合子Smad4-／-用于本研究。对同窝三种不同基因型小鼠的耳蜗冰冻切片应用免疫组织化学方法染色观察．阴性对照为野生型小鼠耳蜗的冰冻切片并用PBS代替一抗．阳性对照为小鼠肾脏组织冰冻切片。结果Smad4在三种基因型小鼠耳蜗均有广泛表达，表达部位主要集中于血管纹、螺旋韧带、基底膜、盖膜、毛细胞、支持细胞、螺旋神经节细胞等处，其中血管纹和基底膜表达最为明显．Smad4在野生型和杂合型小鼠的耳蜗内表达情况基本一致，但纯合子小鼠耳蜗内表达与前两学相比为较低的水平．但未完全消失。结论Smad4在正常小鼠的耳蜗广泛存在，该基因是耳蜗中广泛表达的蛋白中的一种。作为Bmp4信号通路下游信号因子，它可能在骨性耳蜗的形成、内耳感觉细胞的分化成熟过程中起着重要的作用。     

溶酶体神经氨酸酶基因缺乏小鼠听觉和耳形态学改变初步研究

目的研究溶酶体神经氨酸酶基因（Neul）敲除小鼠听功能和耳形态学改变，探讨唾液酸沉积症听力损害的病理生理机制。方法应用听性脑干反应测试和常规颞骨连续切片观察3周、2个月和4个月龄的Neul敲除纯合子（Neul-／-）和野生型（Neul＋／＋）小鼠听阈和光镜下外耳、中耳及内耳形态。结果3周龄的Neul-／-小鼠，短声和短音8、16及32kHz听阈（声压级）较Neul＋／＋提高50—55dB；2个月和4个月龄小鼠听阈提高60—68dB。Neul-／-小鼠3周龄即有明显的中耳和内耳改变，特别是2个月和4个月龄有显著的外耳道堵塞和严重中耳炎，听小骨和耳蜗骨壁细胞、血管纹边缘层和中间层细胞、耳蜗螺旋神经节细胞、螺旋缘纤维细胞、前庭膜、基底膜及沿前庭阶外淋巴隙的间皮细胞明显囊泡化，但Corti器细胞正常。前庭神经节细胞、壶腹嵴及球囊毛细胞和支持细胞也呈现明显囊泡化。结论溶酶体神经氨酸酶的缺乏可导致较严重的听力损害和耳形态改变；外耳道阻塞或中耳炎和听骨改变可能引起传导性聋；耳蜗螺旋神经元、血管纹、螺旋缘、前庭膜和基底膜等细胞的溶酶体储积可能导致感音神经性聋。     

小鼠耳蜗胚胎发育过程中Smad4基因的表达

目的探讨小鼠内耳胚胎发育演变过程，检测Smad4基凶在小鼠耳蜗中的表达情况。方法选用耳廓反应灵敏、健康的C57BL／6小鼠作为种鼠交配，用观察阴栓方法获得适龄胎鼠，≤17天取胚胎头，≥18天在显微镜下取耳蜗，胚胎头水平冰冻切片，耳蜗平行于蜗轴冰冻切片，HE染色方法观察小鼠耳蜗发育形态演变过程，免疫组织化学方法检测Smad4蛋白在小鼠胚胎10～20天耳蜗巾的表达情况。结果胚胎10天，听泡发育．胚胎12天听泡下部有蜗管始基形成并开始发育．胚胎18天，蜗管发育2圈，形成了可以辨认的内、外毛细胞．血管纹开始分化。Smad4从胚胎15天才开始表达，最初表达部位为耳蜗底转将发育成蜗轴以及柱状上皮分化为感觉细胞及支持细胞的区域，但在胚胎早期表达较弱，后期在耳蜗内广泛表达，在螺旋器、血管纹、前庭膜均有表达，且表达逐渐增强，而在蜗轴部位的表达逐渐减弱。结论Smad4在小鼠内耳分化期有阳性表达，且表达具有明显的阶段性和区域性，说明其参与内耳听觉器官的发育过程并且可能存耳蜗的形成过程中起着重要的作用。     

遗传性出血性毛细血管扩张症Smad4基因的筛查

目的检查遗传性出血性毛细血管扩张症(HHT)患者中Smad4基因突变及听力情况。方法根据2000年Shovlin提出的临床诊断标准,对7例ENG和ACVRL1基因筛查均阴性的HHT患者进行Smad4基因筛查和听力检查。结果 7例患者smad4基因测序均未发现突变位点,2例患者除严重鼻出血外还伴肝脏血管畸形,7例患者均无听力障碍、胃肠出血者及肠息肉患者。结论 Smad4基因与HHT、耳聋的相关性值得进一步研究,为疾病诊疗提供新的思路。     

BMP4/Smad4在C57BL/6小鼠内耳前庭发育不同阶段的表达

目的探讨骨形态形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)和Smad4蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein 4)在C57BL/6小鼠内耳前庭发育不同阶段的表达。方法选择从胚胎第10天(E10)到胚胎第20天(E20)每天的孕鼠各两只(共22只),取E10～E17的胚胎头、E18～E20的胚胎内耳,通过冰冻连续切片、免疫组化或免疫荧光染色,观察小鼠胚胎内耳前庭发育过程中BMP4/Smad4的表达情况。结果 BMP4从E10开始,在间充质浓聚前就有表达;间充质一开始浓聚,BMP4在其中就有较丰富的表达;早期主要表达在前庭囊及前庭囊周围的间充质,在胚胎发育的后期,其在软骨囊及前庭上皮里有广泛阳性表达;Smad4在小鼠内耳前庭的表达情况与BMP4不一致,E10到E12的小鼠内耳Smad4表达阴性,E15时各个壶腹嵴、囊斑里才有较明显的Smad4表达,而内耳周围软骨囊到E16时才有明显的Smad4表达。结论 BMP4与小鼠内耳前庭形态形成及毛细胞分化发育、功能形成有关;Smad4与BMP4的表达时空特征不同,Smad4可能主要参与了小鼠内耳前庭发育后期的形态塑形和功能发育。