Smad4 条件基因敲除小鼠前庭终器形态学研究

目的研究Smad4条件基因敲除小鼠前庭终器形忿改变，探讨Smad4基因对于前庭发育的作用。方法利用建立的Smad4条件基测敲除小鼠模型．通过光镜观察Smad4（＋／＋）、Smad4（＋／-）与Smad4（-／-）三种基因型小鼠（0．5、1．5月龄）的球囊及囊斑、椭圆囊及囊斑、半规管及壶腹嵴、前庭神经节、内淋巴管与囊的形态结构、毛细胞的形态及排列缺失情况。通过扫描电镜观察球囊斑、椭圆囊斑和壶腹嵴的形态结构、毛细胞及纤毛的排列缺失情况。结果Smad4（-／-）小鼠个体及内耳明显小于Smad4（＋／＋）和Smad4（＋／-），而后面二者区别不大。所有小鼠的球囊及囊斑、椭圆囊及囊斑、半规管、前庭神经节、内淋巴管与囊的大小和结构正常，淋巴囊腔饱满，囊斑处的感觉上皮、耳石、毛细胞及纤毛排列整齐，没有发现明显的病变．三个基因型间没有差异。Smad4（-／-）小鼠壶腹嵴囊性变多且严重、后半规管壶腹嵴出现明显的副嵴、偶尔可见壶腹嵴感觉上皮空泡样变。壶腹嵴的毛细胞和支持细胞排列整齐，形态无明显改变，未见缺失。扫描电镜示球囊斑、椭圆囊斑、后、外、上半规管壶腹嵴正常，三个基因型之间没有差异。结论Smad4（-／-）小鼠的前庭终器有轻微病理改变，Smad4（＋／＋）与Smad4（＋／-）小鼠的前庭终器形态结构基本正常．表明Smad4对于前庭终器的发育影响可能不明显。     

Smad5 基因敲除小鼠耳蜗扫描电镜观察

目的观察Smad5基因敲除杂合（3月组2只小鼠4只耳蜗）子小鼠内耳形态学超微结构变化。方法野生型动物组：1个月组4只小鼠5只耳蜗，2个月组及3个月组各有2只小鼠4只耳蜗：杂合子动物组1个月组3只小鼠3只耳蜗，2个月组2只小鼠4只耳蜗，3个月组3只小鼠6只耳蜗。按常规方法制成标本作扫描电镜观察。结果Smad5基因敲除杂合子小鼠扫描电镜观察：1月组耳蜗中均观察到耳蜗第一和第二圈外毛细胞有不同程度的静纤毛融合，未见外毛细胞缺失，内毛细胞未见明显地病理变化。2月组耳蜗中观察到第一和第二圈均可见内外毛细胞静纤毛不同程度缺失，有的部位以内毛细胞静纤毛缺失为主，而有的部位以外毛细胞静纤毛缺失为主，有的以片状缺失为主，有的则以散在性缺失为主。3个月组3只小鼠6只耳蜗中均观察到不同程度第一和第二圈内外毛细胞静纤毛广泛性缺失，有外毛细胞缺失的部位多，以第一排外毛细胞的静纤毛缺失为主．第二和第三排外毛细胞静纤毛多以散在性缺失为主，有内毛细胞缺失的部位多伴有外毛细胞静纤毛的大片状缺失。野生型动物组扫描电镜观察：1个月组4只小鼠5只耳蜗，2个月组2只小鼠4只耳蜗均未观察到内外毛细胞缺失和静纤毛的变化，3月组有少量的外毛细胞缺失。结论野生型小鼠2个月以内耳蜗毛细胞无明显变化．杂合子小鼠随着月龄的增加内外毛细胞缺失的程度逐渐加重。     

溶酶体神经氨酸酶基因缺乏小鼠听觉和耳形态学改变初步研究

目的研究溶酶体神经氨酸酶基因（Neul）敲除小鼠听功能和耳形态学改变，探讨唾液酸沉积症听力损害的病理生理机制。方法应用听性脑干反应测试和常规颞骨连续切片观察3周、2个月和4个月龄的Neul敲除纯合子（Neul-／-）和野生型（Neul＋／＋）小鼠听阈和光镜下外耳、中耳及内耳形态。结果3周龄的Neul-／-小鼠，短声和短音8、16及32kHz听阈（声压级）较Neul＋／＋提高50—55dB；2个月和4个月龄小鼠听阈提高60—68dB。Neul-／-小鼠3周龄即有明显的中耳和内耳改变，特别是2个月和4个月龄有显著的外耳道堵塞和严重中耳炎，听小骨和耳蜗骨壁细胞、血管纹边缘层和中间层细胞、耳蜗螺旋神经节细胞、螺旋缘纤维细胞、前庭膜、基底膜及沿前庭阶外淋巴隙的间皮细胞明显囊泡化，但Corti器细胞正常。前庭神经节细胞、壶腹嵴及球囊毛细胞和支持细胞也呈现明显囊泡化。结论溶酶体神经氨酸酶的缺乏可导致较严重的听力损害和耳形态改变；外耳道阻塞或中耳炎和听骨改变可能引起传导性聋；耳蜗螺旋神经元、血管纹、螺旋缘、前庭膜和基底膜等细胞的溶酶体储积可能导致感音神经性聋。     

GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗外毛细胞凋亡时程观察

目的探讨GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗毛细胞缺失方式和具体时间。方法 GJB2基因条件敲除小鼠cCx26loxp/loxp-Pax2-Cre(cCx26)由转基因小鼠Cx26loxp/loxp与Cx26loxp/--Pax2-Cre小鼠杂交获得,分别选取P8、P14、P18和P21四个发育阶段各6只小鼠进行实验。野生型BALB/c小鼠作为正常对照。常规解剖出耳蜗基底膜,鬼笔环肽-FITC及碘化丙啶(PI)分别染色、铺片,激光共聚焦显微镜观察、拍照。结果与野生型小鼠相比,cCx26小鼠P8时耳蜗外毛细胞纤毛、细胞核形态均未见明显异常改变;P14时,鬼笔环肽染色显示耳蜗中回表皮板疏松,外毛细胞纤毛染色开始不规则,PI染色外毛细胞核排列极性欠佳,细胞核着色不均匀,可见深染的胞核,尚未见明显的外毛细胞缺失;P18时,鬼笔环肽染色显示表皮板出现区域性的模糊和单个外毛细胞纤毛的消失,外毛细胞核出现皱缩、片断化,甚至缺失,这一改变以中回最为明显,底回次之,顶回改变最轻微;P21时,表皮板出现了片状缺失,外毛细胞丢失明显,残余细胞排列紊乱。与野生型小鼠相比,cCx26ko小鼠各阶段内毛细胞纤毛染色不规则,深浅不一,细胞核未见明显形态异常及缺失。结论 GJB2基因缺失可引起小鼠耳蜗Corti器表皮板破损以及外毛细胞的凋亡,表皮板及外毛细胞纤毛的变化开始于P14,P18时外毛细胞出现典型的凋亡表现。     

Smad4 基因在野生型和基因缺陷小鼠耳蜗内的定位和分布

目的检测Smad4基因任成年小鼠耳蜗中是否有表达及表达部位的分布情况，以进一步研究Smad4基因在内耳发育以及听功能调控上的作用。方法动物由军事医学科学院发育和疾病遗传学研究室杨晓研究员提供．动物获取是在C57BL／6J和Blackswiss两种遗传背景的小鼠应用Cre—LoxP系统进行条件基因打靶，于小鼠胚胎早期在软骨细胞内将Smad4基因剔除，并生成同窝三种基因型小鼠-野生型Smad4＋/＋，杂合子Smad4＋／-，纯合子Smad4-／-用于本研究。对同窝三种不同基因型小鼠的耳蜗冰冻切片应用免疫组织化学方法染色观察．阴性对照为野生型小鼠耳蜗的冰冻切片并用PBS代替一抗．阳性对照为小鼠肾脏组织冰冻切片。结果Smad4在三种基因型小鼠耳蜗均有广泛表达，表达部位主要集中于血管纹、螺旋韧带、基底膜、盖膜、毛细胞、支持细胞、螺旋神经节细胞等处，其中血管纹和基底膜表达最为明显．Smad4在野生型和杂合型小鼠的耳蜗内表达情况基本一致，但纯合子小鼠耳蜗内表达与前两学相比为较低的水平．但未完全消失。结论Smad4在正常小鼠的耳蜗广泛存在，该基因是耳蜗中广泛表达的蛋白中的一种。作为Bmp4信号通路下游信号因子，它可能在骨性耳蜗的形成、内耳感觉细胞的分化成熟过程中起着重要的作用。     

C57BL/10J小鼠内耳形态学观察

目的 探讨不同月龄C57BL／10J小鼠内耳形态学变化。方法 取C57BL/10J小鼠2月龄3只（6耳）、8月龄3只（6耳）、12月龄2只（4耳）、27月龄2只（4耳），采用耳蜗铺片和耳蜗图技术，观察耳蜗和前庭毛细胞的变化。结果 2月龄鼠在耳蜗底回和顶回可见有少量的外毛细胞缺失，内毛细胞正常。8月龄鼠外毛细胞缺失主要由耳蜗底回向顶回发展，少量内毛细胞缺失主要在耳蜗底回，对应于20kHz的基底膜区域显示外毛细胞缺失在20％左右。12月龄鼠外毛细胞缺失明显加重，耳蜗底回部分几乎完全缺失，外毛细胞损失区域发展到基底膜中部，并且蜗尖区域外毛细胞缺失达到40％，耳蜗底回内毛细胞缺失达到60％～80％，蜗尖部分内毛细胞基本正常，对应于20kHz的基底膜区域显示外毛细胞缺失近80％，内毛细胞缺失近30％。27月龄鼠耳蜗外毛细胞从基底膜中部至底回完全缺失，顶回缺失60％～80％，内毛细胞缺失逐渐向蜗尖扩展，对应于20kHz的基底膜区域显示外毛细胞完全缺失，内毛细胞缺失超过50％。前庭选取球囊斑，椭圆囊斑和壶腹嵴三个部位进行观察，不同月龄的C57BL／10J鼠前庭毛细胞均正常。结论 本研究首次对C57BL／10J小鼠的内耳形态学进行观察，发现该鼠同C57BL／6J小鼠比较在外毛细胞缺失规律和时间上有明显的差别，明确了内耳毛细胞的变化规律；同时首次观察了前庭毛细胞，为C57BL／10J小鼠作为遗传性和老年性聋研究的动物模型提供了形态学理论依据。     

体外培养小鼠耳蜗Corti器对庆大霉素的吸收

目的 观察庆大霉素-德州红耦联物在体外培养小鼠耳蜗Corti器的分布情况,比较不同时间庆大霉素吸收的差异.方法 分离小鼠耳蜗Corti器,体外培养,培养液中加有庆大霉素-德州红耦联物,分别于培养后3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、3 d.4 d和7 d收集标本,荧光染色后行激光扫描共聚焦显微镜观察基底膜庆大霉素的分布情况.结果 小鼠耳蜗Corti器在培养3 h后即可见外毛细胞的纤毛和胞体两侧的胞膜有庆大霉素分布;随着培养时间的延长,庆大霉素在Corti器中的所有细胞均见分布,尤以外毛细胞明显,主要聚集在毛细胞顶端纤毛的下方;培养24 h后庆大霉素在外毛细胞的聚集达到最高峰,而在支持细胞未见明显的聚集;体外培养7 d后在毛细胞胞质中仍可见庆大霉素分布.结论 小鼠Corti器体外培养可用来动态检测庆大霉素在耳蜗细胞的吸收和聚集情况.     

Smad4基因敲除对小鼠听力和前庭功能的影响

目的研究Smad4基因敲除（Smad4＋/-）小鼠听力和前庭功能的改变.方法检测Smad4基因敲除小鼠（1、2、3、6月龄）与同种同月龄的野生型（Smad4＋/＋）小鼠的ABR阈值.按Steal的方法测定小鼠的平衡功能,包括游泳试验、空间姿势反射,以及一般行为观察.结果 2、3、6月龄Smad4＋/-小鼠听力较同种野生型小鼠明显下降,两种基因型小鼠听阈有显著性差异（P〈0.01）,但1月龄的不同基因型小鼠听力水平无统计学差异（P〉0.05）.Smad4基因敲除小鼠与野生型小鼠外观和体重无明显差异（P〉0.05）,生后至6月龄的Smad4＋/-小鼠与野生型小鼠均无前庭功能异常和行为异常.结论单倍体Smad4基因敲除小鼠听力明显障碍,但前庭功能基本正常.表明Smad4对内耳的听觉有重要作用,可能存在着单倍体功能不全性;而单倍体Smad4基因缺失对于前庭功能影响可能不明显.     

X-连锁低磷酸盐血症Pug小鼠的听力学和耳形态学研究

目的Phex基因点突变Pug小鼠是典型的人类X-连锁低磷酸盐血症小鼠模型。通过研究Pug小鼠的听力学表型,探讨Phex基因点突变对小鼠听觉功能与内耳形态的影响。方法运用听性脑干诱发电位（ABR）对4月龄Pug小鼠和野生型小鼠进行听功能测试,取小鼠耳蜗进行大体形态观察,运用石蜡切片观察小鼠耳蜗骨壁、前庭膜、血管纹、螺旋韧带、盖膜、Corti器、螺旋神经节等结构。运用扫描电镜观察小鼠耳蜗Corti器上的内、外毛细胞及其表皮板等结构。结果Pug小鼠的ABR在短声和8kHz、16kHz、32kHz短纯音刺激的反应阈值均有提高,在短声和16kHz、32kHz频率,其差异具有统计学意义（P〈0.05）。小鼠耳蜗骨壁增厚,骨质过度增长,有大量骨质矿化不完全区域;耳蜗底转部位螺旋神经节出现明显退化,神经元数目大量减少;耳蜗顶转到底转内、外毛细胞静纤毛散在性缺失,静纤毛形态异常。结论Phex基因点突变引起的基因功能缺失导致了Pug小鼠的听觉功能减退和耳蜗形态异常。     

内耳转基因表达的实验研究

目的 了解内耳转基因表达的可行性。方法 将人复制缺陷重组腺病毒基因(Adenoviruses，Ad，含大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因LacZ基因，Ad5．LacZ)经豚鼠耳蜗蜗窗接种到鼓阶外淋巴后，观察在不同时间、不同内耳组织中LacZ基因的表达(X-Gal染色)及Ad对豚鼠声反应(听性脑干反应)、听毛细胞(扫描电镜)的影响。结果 Ad介导的LacZ基因在内耳组织中的表达至少可持续4周，其中在螺旋神经节细胞表达稳定，Corti器、前庭囊斑、壶腹嵴的毛细胞等也有较强的表达。Ad未对豚鼠声反应(≤8000Hz)造成明显的损伤，除耳蜗底回外，其余各回未见明显的毛细胞缺失。结论 腺病毒载体可成功地将LacZ基因转导致豚鼠内耳组织中，并且未对豚鼠声反应(低、中频)及听毛细胞造成明显损伤，这对未来的内耳基因治疗研究可能具有重要的参考价值。