人胰岛素样生长因子1基因在海绵体平滑肌细胞中的表达及定位

目的观察人胰岛素样生长因子1基因在海绵体平滑肌细胞中的表达及定位情况,为阴茎勃起功能障碍的基因治疗提供理论和实验依据。方法采用Lipofectamine2000包裹PCDB-hIGF-1质粒和PCDB空载体,转染原代培养的大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,转染后24h分别采用RT-PCR法检测hIGF-1基因mRNA表达,Westernblot法检测hIGF-1蛋白表达,荧光免疫细胞化学法检测hIGF-1细胞定位及蛋白表达。结果RT-PCR检测到hIGF-1mRNA表达,Westernblot和荧光免疫细胞化学法均检测到hIGF-1蛋白表达,荧光免疫细胞化学法可见hIGF-1蛋白定位于阴茎海绵体细胞胞质中。结论PCDB-hIGF-1成功转染入大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞可表达hIGF-1基因,蛋白定位于胞质。     

hIGF-1基因治疗老龄大鼠勃起功能障碍的剂量及时效研究

目的:探讨阴茎海绵体内注射胰岛素样生长因子1(hIGF-1)基因提高老年性大鼠阴茎勃起功能的最佳剂量和作用实效。方法:4月龄SD雄性大鼠10只(青年组);24月龄SD雄性大鼠40只,随机分为5组,每组10只:PBS对照组、hIGF-1基因10μg注射组、100μg注射组和1000μg注射组,注射后在不同时间段4周和8周行电刺激检测大鼠阴茎海绵体内压(ICP)和平均动脉压(MAP)的测定,分析比较不同剂量和不同时间hIGF-1基因治疗的效果;RT-PCR检测hIGF-1基因mRNA的表达。结果:电刺激发现老年组较青年组ICP/MAP和总ICP明显降低(P<0.05)。4和8周的治疗之后,10μg注射组、100μg注射组和1000μg注射组较PBS对照组ICP/MAP和总ICP均明显提高(P<0.05);100μg注射组和1000μg注射组在4和8周时ICP/MAP和总ICP值和青年组相仿;10μg注射组虽然不能达到和青年组相仿的治疗效果,但仍然有治疗意义;所有hIGF-1基因治疗组均可检测到hIGF-1 mRNA的表达。结论:hIGF-1基因治疗能够提高老龄大鼠的勃起功能,100μg即可达到有效的治疗,hIGF-1基因治疗至少能够维持8周时间。     

IGF-1基因治疗提高老龄大鼠阴茎海绵体平滑肌密度的研究

目的 观察阴茎海绵体内注射胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)基因能否提高老年性大鼠阴茎勃起功能及其对阴茎海绵体平滑肌密度的影响,以探讨IGF-1基因治疗ED的机制.方法 4月龄SD雄性大鼠(青年组)10只;24月龄SD雄性大鼠(老龄组)20只,随机分为2组:PBS对照组、100 μg IGF-1质粒注射组.每组10只注射后8周行电刺激检测大鼠阴茎海绵体内压(ICP)和平均动脉压(MAP),分析比较IGF-1基因治疗的效果,Masson,s三色染色图文定量分析阴茎海绵体平滑肌在海绵体组织中含量的变化.结果 电刺激发现老龄组较青年组ICP/MAP和总ICP明显降低(P＜0.05).IGF-1基因治疗8周后,100 μg IGF-1质粒注射组较PBS对照组ICP/MAP和total ICP均明显提高(P＜0.05);阴茎海绵体平滑肌的含量在老龄组较青年组明显降低(P＜ 0.05);与PBS对照组比较,100μg IGF-1质粒注射组能够明显提高阴茎海绵体平滑肌的含量(P＜0.05).结论 I GF-1基因治疗能够改善老龄大鼠的勃起功能,其作用机制之一可能是通过提高阴茎海绵体平滑肌的含量.     

PDE_5基因特异性siRNA改善糖尿病性勃起功能障碍大鼠勃起功能的研究

目的 探讨人鼠PDEs基因siRNA对糖尿病性勃起功能障碍(DM ED)大鼠PDE,基因表达的抑制作用及其对DMED大鼠勃起功能的影响.方法 构建可同时表达2条针对大鼠PDEs基因的shRNA重组腺病毒;50只雄性SD大鼠随机取10只作为正常对照.其余建立DM ED人鼠模型,随机分为实验组、阴性对照组和空白对照组,分别将重组腺病毒rAd-rPDEs-shRNA、腺病毒rAd-mock及生理盐水注射于阴茎海绵体.注射后第7天,电刺激盆神经测定各组大鼠阴茎海绵体内压(ICP)及平均周围动脉压(MAP),然后取海绵体组织通过RT-PCR和Western blot分别检测PDE5基因mRNA及蛋白的表达.结果 ICP/MAP实验组和正常对照组显著高于阴性对照组和窄白对照组(P＜0.05),实验组和正常对照组间无显著性差异(P＞0.05);RT-PCR和Western blot 分析,实验组大鼠PDE5基因mRNA和蛋白表达均显著低于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05).结论 PDE5基因shRNA重组腺病毒转染可以改善DMED大鼠的勃起功能,为DMED治疗方法的探索提供了新的思路.     

血管活性肠多肽基因转导增强阴茎勃起功能

目的 探讨阴茎海绵体勃起神经递质血管活性肠多肽(VIP)基因转导入糖尿病大鼠阴茎海绵体并表达多量VIP以增强勃起功能的可行性.方法 将构建的重组质粒pcDNA3/VIPcDNA注射入链尿佐菌素诱导的糖尿病大鼠阴茎海绵体,在注射3 d后测定阴茎海绵体内压(ICP),分别以正常空白、空白、单纯注射缓冲液和单纯注射pcDNA3载体对照.Dot blot法测定阴茎组织中VIP mRNA表达水平.结果 糖尿病大鼠阴茎海绵体注射重组质粒后3 d,电刺激海绵体神经,ICP较对照组明显升高(P＜0.05);阴茎组织VIP mRNA表达增多(P＜0.05).结论 成功将重组质粒pcDNA3/VIP cDNA转导入糖尿病阴茎海绵体,VIP mRNA表达增加能增强糖尿病大鼠阴茎海绵体的勃起功能.     

细胞外信号调节激酶和蛋白激酶B在糖尿病大鼠阴茎海绵体的表达

目的 研究细胞外信号调节激酶(ERK1/2)和蛋白激酶B(PKB/Akt)在糖尿病大鼠阴茎海绵体中的表达,探讨糖尿病大鼠勃起功能障碍(ED)可能存在的发病机制.方法 20只8周龄雄性Wistar大鼠随机分成对照组(A组)和实验组(B组).实验组采用1%链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立I型糖尿病大鼠模型,对照组给予等量生理盐水腹腔注射,4周后采用免疫组化及RT-PCR技术检测ERK1/2和PKB/Akt在大鼠阴茎海绵体中的表达.结果 ERK1、ERK2的mRNA和ERK1/2蛋白的表达量在B组(0.7343±0.0820、0.7962±0.0730、0.1574±0.0350)较A组(0.3943±0.0900、0.4156±0.0590、0.1205±0.0360)显著升高,差异具统计学意义(P<0.05);PKB/Akt的mRNA和PKB/Akt蛋白的表达量在B组(0.9884±0.0460、0.1822±0.0470)与A组(0.9417±0.0540、0.1586±0.0220)差异无统计学意义(P>0.05).结论 ERK1/2和PKB/Akt在糖尿病大鼠阴茎海绵体中均有表达,糖尿病大鼠阴茎海绵体ERK1/2表达增强可能与糖尿病大鼠ED的发生有关.     

自发性高血压大鼠阴茎海绵体组织内皮型一氧化氮合酶的表达及意义

目的探讨自发性高血压大鼠(SHR)勃起功能的改变及其发病机制。方法20周龄雄性SHR大鼠及同系正常(WKY)大鼠各10只,夹尾法测量大鼠收缩压(SBP),皮下注射阿朴吗啡(APO)检测阴茎勃起功能,免疫组织化学染色和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法测定海绵体组织内eNOSmRNA的表达。结果SHR组及WKY组收缩压分别为(205.7±11.9)mmHg和(114.3±10.2)mmHg,阴茎勃起次数分别为(0.6±0.5)和(2.4±0.6),差异均具有显著性(P<0.01)。免疫组织化学染色显示eNOS蛋白在WKY大鼠阴茎海绵体组织中普遍表达,在SHR大鼠阴茎海绵体组织内的表达显著低于WKY大鼠(P<0.01)。RT-PCR结果与免疫组化结果相似。结论高血压严重影响阴茎勃起功能,海绵体组织内eNOS的降低可能是自发性高血压大鼠勃起功能下降的机制之一。     

中电导型钙依赖钾通道在糖尿病大鼠阴茎海绵体中的表达及意义

目的 探讨糖尿病对大鼠阴茎海绵体中电导钙激活性钾通道蛋白(IKCa)表达的影响以及意义.方法 选用SD雄性大鼠35只,随机选择25只用于制作糖尿病动物模型,剩余10只用于空白对照.造模成功后饲养8周,注射阿朴吗啡(APO),观察大鼠阴茎勃起,同时采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测IKCa mRNA和蛋白在大鼠海绵体的表达.结果 DM组大鼠阴茎勃起和IKCa mRNA及蛋白表达均显著低于STZ组和NDM组(P<0.05),STZ组和NDM组之间大鼠阴茎勃起情况和IKCa mRNA及蛋白表达无统计学意义(P>0.05).绪论糖尿病可降低大鼠阴茎勃起功能,IKCa在糖尿病大鼠海绵体表达明显降低.糖尿病对大鼠阴茎勃起功能的影响与阴茎海绵体IKCa表达减少密切相关.     

可分泌表达人降钙素基因相关肽重组腺相关病毒对糖尿病大鼠阴茎勃起的作用

目的:探讨重组腺相关病毒(rAAV)介导人降钙素基因相关肽(hCGRP)基因转移在糖尿病大鼠阴茎海绵体平滑肌分泌表达及其对阴茎勃起的作用。方法:建立链佐脲菌素(STZ)糖尿病大鼠模型,随机分为3组,分别将VssHGCMV-hCGRP、VssCMV-GFP和rAAV空病毒液注射于阴茎海绵体。在注射后5 d,采用SMUP-PC型生物信号处理系统检测阴茎背神经电刺激诱发的阴茎勃起反应及海绵体内压(ICP)变化。切取海绵体组织,通过免疫组化技术和激光共聚焦显微镜分别检测hCGRP和绿色荧光蛋白(GFP)表达,以放射免疫法检测组织中环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)变化。结果:在VssCMV-GFP转染后5 d,显示阴茎海绵体内几乎所有组织均有广泛的GFP表达,而rAAV空病毒转染的海绵体则无GFP表达。VssHGCMV-hCGRP转染STZ诱导的糖尿病大鼠后5d,电刺激阴茎背神经可诱发明显的阴茎勃起,监测ICP明显增高[(60.5±4.5)mm Hg,1 mm Hg=0.133kPa],而对rAAV空病毒转染的对照组STZ糖尿病大鼠以同样的参数电刺激阴茎背神经则无勃起反应,ICP无明显增加[(22.3±1.3)mm Hg],两组差异有显著性(P<0.01)。免疫组化观察显示在VssHGCMV-hCGRP转染的STZ糖尿病大鼠阴茎海绵体组织中hCGRP表达增强,同时当电刺激阴茎背神经诱发勃起反应时,海绵体内cAMP和cGMP水平均升高,分别为(48.4±6.5)nmol/L和(21.2±13.6)nmol/L,较rAAV空病毒组[(16.7±2.5)nmol/L和(0.42±0.12)nmol/L]明显增高(P<0.01)。结论:经阴茎海绵体内注射重组腺相关病毒VssHGCMV-hCGRP在糖尿病大鼠阴茎海绵体内获得了hCGRP转基因高效表达,其可增加阴茎背神经电刺激诱发的阴茎ICP和勃起反应。     

养精胶囊对老年大鼠阴茎海绵体P-Erk1和P-Akt1表达的影响

目的:通过观察养精胶囊对老年大鼠阴茎海绵体中P-Erk1和P-Akt1表达的影响,探讨其可能的作用机制。方法:将40只24月龄老年雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组,每组20只。用药前实验组和对照组各取10只用于eNOS表达测定。实验组(n=10)给予养精胶囊[0.5 g/(kg.d)]灌胃,对照组(n=10)给予等剂量的生理盐水灌胃。4周后,处死所有大鼠,留取大鼠阴茎海绵体组织,HE染色,采用RT-PCR和免疫组化方法检测eNOS、P-Erk1及P-Akt1在阴茎海绵体组织中的表达。结果:HE染色结果显示实验组老年大鼠阴茎海绵体组织血管较对照组明显充盈,管径明显增大。免疫组化结果显示,对照组大鼠阴茎海绵体组织中eNOS的表达干预前(19.35±1.50)和干预后(18.15±1.98)无显著性差异(P>0.05);实验组老年大鼠阴茎海绵体组织中eNOS的表达干预后(24.10±2.40)较干预前(18.80±2.04)显著增强(P<0.05);而干预后老年大鼠阴茎海绵体组织中eNOS的表达,实验组较对照组明显增强(P<0.05);大鼠阴茎海绵体组织中P-Erk1的表达,实验组明显低于对照组(实验组P-Erk1表达量为0.71±0.13,对照组P-Erk1的表达量为0.83±0.17,P<0.01)。而在同等内参GAPDH条件下,两组大鼠间P-Akt1的表达强度未见明显差异(实验组P-Akt1的表达量为0.58±0.17,对照组P-Akt1的表达量为0.48±0.13,P>0.05)。结论:P-Erk1和P-Akt1在老年大鼠阴茎海绵体组织中均有表达,养精胶囊能改善老年大鼠勃起功能,作用机制可能与阴茎海绵体中P-Erk1的低表达相关。