日本脑炎病毒E蛋白基因酵母双杂交表达载体的构建

日本脑炎病毒 (ＪＥＶ)为黄病毒属成员 ,基因组为单股正链ＲＮＡ ,长约 11ｋｂ ,编码 3个结构蛋白和7个非结构蛋白〔1〕。其中 3个结构蛋白分别为衣壳蛋白Ｃ、膜蛋白Ｍ和囊膜蛋白Ｅ。Ｅ蛋白为该病毒外部的糖蛋白 ,由 50 0个氨基酸组成 ,相对分子质量(Ｍｒ)约为 530 0 0 ,具有多种生物学功能 ,包括受体结合活性和膜融合作用等 ,与病毒的致病性及组织亲嗜性密切相关〔2〕。酵母双杂交技术 ,是一种新近发展的研究蛋白质之间相互作用的方法。为研究ＪＥＶ的受体 ,我们将编码ＪＥＶ中具有受体结合活性的Ｅ蛋白的基因(约 1.5ｋｂ)克隆入酵母表达载…     

口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的:构建口蹄疫病毒VP1基因的真核表达载体, 转染并筛选稳定表达VP1的树突状细胞(dendritic cell, DC).方法:将pMD-18-VP1克隆于pcDNA3.1(+)中, 构建重组质粒, 酶切鉴定, DNA测序证实序列正确后, 利用脂质体将重组质粒转染DC, 经含G418培养基筛选获得抗G418细胞克隆, 用Western blot鉴定FMDV VP1基因在DC中的表达.结果:构建的pcDNA3.1-VP1真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性, SDS-PAGE和Western blot结果显示G418筛选获得DC稳定表达VP1.结论:成功地构建了重组质粒pcDNA3.1- VP1真核表达载体, 并在DC中得到稳定表达.     

人CCL21基因真核表达载体的构建及表达

为了构建可在哺乳动物细胞内高效表达人次级淋巴组织趋化性细胞因子(hCCL21)的真核表达质粒pVAX1-hCCL21,以便用于hCCL21基因治疗研究。以BamHI和XhoI双酶切重组克隆pSK-hCCL21,胶回收约540bp的hCCL21目的基因片段,以亚克隆法构建于真核表达载体pVAX1的相应酶切位点,转化后进行菌落PCR分析和BamHI、XhoI双酶切鉴定。阳性克隆提取质粒,体外电穿孔法转染COS-7细胞,Westernblot法检测转染细胞中hCCL21的瞬时表达,趋化小室法检测表达产物对淋巴细胞的免疫趋化作用。结果显示,菌落PCR和酶切鉴定证实,目的基因hCCL21正确插入到真核表达载体pVAX1中,转染COS-7细胞后,细胞培养上清及裂解产物中可检测到重组蛋白hCCL21的表达,并且表达产物对人外周血单个核细胞有明显的趋化活性。已成功构建了可在哺乳动物细胞内高效表达hCCL21基因的真核表达质粒pVAX1-hCCL21,为进一步研究hCCL21基因治疗肿瘤奠定了基础。     

含日本脑炎病毒pre-M/E蛋白基因真核表达质粒的构建及免疫效果观察

本文作者将日本脑炎病毒（ＪＥＶ）的前膜蛋白和囊膜蛋白（ｐｒｅＭ／Ｅ）的基因插入到真核表达载体ｐＳＧ５中，构建了重组表达载体ｐＳＧＪＥ。用其体外转染地鼠肾细胞ＢＨＫ－２１，经间接免疫荧光法（ＩＦＡ）检测，证实了ＪＥＶ－Ｅ的瞬时表达。大量制备和纯化重组质粒，经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，结果显示该重组质粒可明显促进小鼠在受到ＪＥＶ活病毒攻击后特异性抗体的产生。     

含日本脑炎病毒pre—M／E蛋白基因真核表达质粒的构建及…

本文作者将日本脑炎病毒（ＪＥＶ）的前膜蛋白和囊膜蛋白（ｐｒｅＭ／Ｅ）的基因插入到真核表达载体ｐＳＧ５中，构建了重组表达载体ｐＳＧＪＥ。用其体外转染地鼠肾细胞ＢＨＫ－２１，经间接免疫荧光法（ＩＦＡ）检测，证实了ＪＥＶ－Ｅ的瞬时，大量制备和纯化重组质粒，经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，结果显示该重组质粒可明显促进小鼠在受到ＪＥＶ活病毒攻击中特异性抗体的产生。     

日本脑炎病毒和乙型肝炎病毒抗原真核表达载体的体外共表达

作者构建了日本脑炎病毒（Ｊａｐａｎｅｓｅｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓｖｉｒｕｓ，ＪＥＶ）前膜蛋白囊膜蛋白（ｐｒＭＥ）和乙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ，ＨＢＶ）前Ｓ蛋白（ｐｒｅＳ）的真核表达载体，分别命名为ｐｃＤＮＡ３Ｅ和ｐＳＧ５ｐｒｅＳ。等量混合这两种质粒，转染ＣＯＳ７细胞进行瞬间表达，应用单克隆抗本ＥＬＩＳＡ法检测特异性抗原。结果表明，单独及混合转染的细胞培养上清中均有特异性抗原表达。本项研究为进一步发展新型日本脑炎病毒和乙型肝炎病毒核酸疫苗打下了基础，也初步显示了核酸疫苗技术在联合疫苗研制中的应用前景     

Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白真核表达载体Salusin-a(pEG-FP-Salusin-a)的构建及在人胚胎肾细胞系293细胞(HEK293)中的表达。方法:提取人单核细胞系THP-1细胞Salusin-a的mRNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Salusin-a基因,克隆入pEGFP-N3载体,双酶切、菌落PCR及测序鉴定pEGFP-Salusin-a质粒。用脂质体转染pEGFP-Salusin-a入HEK293细胞,分为转染细胞组、质粒对照组和空白对照组,检测分析各组荧光蛋白和Salusin-a基因的表达。结果:成功构建pEGFP-Salusin-a质粒,并转染HEK293,细胞转染效率86%,转染细胞组和质粒对照组绿色荧光蛋白的表达明显高于空白对照组(P0.05);转染细胞组Salusin-amRNA的表达明显高于质粒对照组和空白对照组(P0.05)。结论:重组pEGFP-Salusin-a质粒能转染HEK293细胞并表达Salusin-a,为Salusin-a基因功能的进一步研究提供了实验基础。     

hdll1ext-Fc融合蛋白真核表达载体的构建及表达

目的：构建人dlll^ext(human delta-likel extraeellular region)-Fe融合蛋白的真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc，并在COS-7细胞中进行表达。方法：从人脑cDNA文库中PCR扩增人delta-likel胞外段，通过DNA重组构建真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fe。瞬时转染COS-7细胞，应用RT-PCR、细胞免疫荧光技术和双抗体夹心ELISA，检测融合蛋白的表达。结果：成功地构建了真核表达载体pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc。以重组载体转染COS-7细胞后，RT-PCR结果显示delta-likel胞外段与IgG1 Fe在mRNA水平正确拼接；细胞免疫荧光染色呈阳性反应；夹心ELISA法检测到细胞培养上清中有融合蛋白的表达。结论：成功地扩增了人delta-likel胞外段，构建了pEF-BOSneo-hdlll^ext-Fc真核表达载体，并在COS-7细胞中获得表达，为下一步研究奠定了基础。     

hCAP基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建hCAP真核表达载体并检测融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞CV-1的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hCAP基因的cDNA全长,并将其克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组载体进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot。最后利用激光共聚焦显微镜观察pEGFP-hCAP在NIH3T3成纤维细胞内的定位。结果:hCAP基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为3 879 bp,测序证实成功。Western blot检测GFP-hCAP融合蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为169 000。pEG-FP-hCAP在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-hCAP,融合蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。     

大鼠Akt1基因真核表达载体的构建及其在293细胞中的表达

目的构建Akt1基因真核表达载体pDC316-Akt1，观察其在293细胞（人胚肾母细胞）中的表达。方法采用RT-PCR方法自大鼠肝组织总RNA中克隆Akt1 DNA片段，测序鉴定正确后，插入真核表达载体pDC316的EcoRⅠ、HindⅢ的酶切位点，构建Akt1真核表达载体Akt—pDC316，脂质体介导法转染293细胞，36h后Western blot检测转染293细胞中Akt1的含量。结果经测序鉴定，构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符。将Akt-pDC316转入293细胞，可见55000位置有Akt1的表达。经Western blot检测，具有良好的表达浓度。结论构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分表达。     

乙型脑炎病毒E蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：用巴斯德毕赤酵母系统表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白。方法：将JEV E蛋白基因亚克隆人真核表达载体pPIC9K，以电穿孔法转化酵母SMD1168。用MD平板筛选重组子、G418筛选高拷贝转化子，经甲醇诱导表达后，SDS—PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果：由于糖基化不同，所表达产物的相对分子质量(Mr)约为113000和78000，表达量约为50mg/L。结论：在巴斯德比赤酵母中成功地表达了JEVE蛋白，为制备JEV的诊断抗原和基因工程重组疫苗打下基础。     

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景：体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。 目的：构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。 方法：采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72 cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。 结果与结论：重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72 cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。     

细胞周期蛋白E siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的构建细胞周期蛋白E(Cyclin E)小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,并检测其抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Cyclin E表达的效果。方法根据基因文库中Cyclin E的cDNA序列,设计并合成两段siRNA,分别转入到pGENESIL-1质粒中,并对重组质粒(命名为pGENESIL/Cyclin E-1和pGENESIL/Cyclin E-2)进行测序鉴定。脂质体介导下转染MCF-7细胞株,RT-PCR检测转染后Cyclin E的表达。结果Cyclin E siRNA真核表达载体构建成功,测序结果显示插入片段的方向和序列与预想一致。RT-PCR检测显示Cyclin E的表达显著降低。结论Cyclin E siRNA真核表达载体的成功构建为进一步研究以Cyclin E为靶位点对乳腺癌进行基因治疗奠定了重要的实验基础。     

1．3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bew0细胞中的表达

目的构建1．3倍乙型肝炎病毒（HBV）全基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）一HBV1．3。并观察其在Bewo细胞中的表达。方法以质粒pMD18T—HBV上的HBVDNA序列为模板,构建1-3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法（MEIA）和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBVDNA水平。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1．3倍HBV全基因表达载体．该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg。并可检测到高水平的HBVDNA。结论成功构建了1．3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）一HBV1．3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础。     

MAGE-3基因真核表达载体构建及在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的　扩增人黑色素瘤抗原 3(Melanomaantigen 3,MAGE 3)基因 ,构建真核表达载体 ,并在小鼠黑色素细胞瘤B16中进行表达。方法　采用PCR扩增MAGE 3基因 ,连接到真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,构建真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞。G4 18筛选阳性克隆 ,荧光显微镜和RT PCR分别检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白 (Enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)的表达和MAGE 3mRNA的表达。结果　从pUC19 MAGE 3重组质粒中扩增获得一条约 95 0bp的片段 ,成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆 ,可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光 ,RT PCR检测到MAGE 3mRNA的表达。结论　成功构建了真核表达载体pIRES2 EGFP MAGE 3,获得了稳定表达该载体的小鼠黑色素瘤B16细胞系 ,为研究MAGE 3在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。     

脂肪储存小滴蛋白5基因真核表达载体的构建及亚细胞定位

目的:构建pCMV5-HA与脂肪储存小滴蛋白5(LS-DP5)的融合基因真核表达载体,观察其在非洲绿猴肾成纤维细胞COS7中的表达,通过免疫荧光技术确定LSDP5的亚细胞定位。方法:采用NdeI和BamHI酶切pCMV5-HA质粒,用BglII和NdeI酶切pMD18-LSDP5质粒,克隆到pCMV5-HA载体,测序鉴定后,通过脂质体法转染COS7细胞,通过免疫荧光技术观察其在COS7细胞中的表达,并利用荧光染料Bodipy493/503定位脂滴,探讨LSDP5与脂滴之间的关系。结果:酶切及DNA测序证实重组质粒pCMV5-HA-LSDP5构建成功。荧光显微镜观察显示,pCMV5-HA-LSDP5融合蛋白定位于细胞质内,并定位于脂滴表面。结论:成功构建了重组质粒pCMV5-HA-LSDP5;融合蛋白分布于细胞质并与脂滴存在共定位关系。     

乙型肝炎病毒多表位抗原基因真核表达载体的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

将自行设计、合成的乙型肝炎病毒多表位抗原基因BPT ,克隆入真核表达载体pCDNA3 1,构建重组质粒pCDNA3 1/BPT。后者经脂质体法转染小鼠BALB/c 3T3细胞 ,G4 18加压筛选出阳性转染细胞 ,并用间接免疫荧光法鉴定其在小鼠BALB/c 3T3细胞的表达。该重组质粒经胫骨前肌注射小鼠 ,10 0 μg/次每只小鼠 ,间隔 2周加强一次 ,共 3次。免疫诱发了特异性抗体和淋巴细胞增殖反应 ,并用PCR法在小鼠的心脏、肝脏及肺组织中检测到pCDNA3 1/BPT ,这为研究HBV多表达抗原的核酸疫苗提供了初步的资料     

人SYNOVIOLIN基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建携EGFP的人SYNOVIOLIN基因真核表达载体。方法：应用基因重组技术,根据人SYNOVIOLIN基因序列和表达载体pIRES2-EGFP质粒上的多克隆位点设计引物,对含有SYNOVIOLIN基因的质粒pCDNA3-syno扩增,得到约1900 bp的目的片段,进行T-A克隆。SalⅠ/BamHⅠ双酶切测序正确的重组质粒,回收SYNOVIOLIN cDNA片段,将其亚克隆于pIRES2-EGFP载体的多克隆位点内得到质粒pIRES2-EGFP-syno。脂质体法转染HEK293细胞, 用激光共聚焦显微镜和Western blot检测EGFP和SYNOVIOLIN在HEK293细胞的表达。结果：PCR,酶切及测序结果表明pIRES2-EGFP-syno真核表达载体构建成功,激光共聚焦显微镜和Western blot显示EGFP和SYNOVIOLIN蛋白在HEK293细胞中成功表达。结论：成功构建pIRES2-EGFP-syno真核表达载体并在HEK293细胞表达,为抗肌腱粘连的　SYNOVIOLIN基因治疗研究奠定基础。