可溶性CD40L联合其他造血细胞生长因子体外扩增人脐血CD34+细胞

目的研究可溶性CD40L(sCD40L)对人脐血CD34 细胞体外扩增和集落形成的影响。方法用磁珠阳性分离纯化法分离脐血CD34 细胞;用造血干细胞体外悬浮培养、集落形成实验以及流式细胞仪检测等方法,观察应用sCD40L对脐血造血干细胞扩增、CD34 细胞增殖及造血集落形成的影响。结果sCD40L能显著增强干细胞因子(SCF)、白细胞介素3(IL-3)、促红细胞生成素(EPO)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对脐血干细胞总数和CD34 细胞的扩增作用,并能促进造血集落,尤其是粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)的形成。sCD40L联合其他造血细胞生长因子对脐血CD34 细胞的扩增作用在培养的第7d最显著,当sCD40L浓度为40μg/L时,CD34 细胞的扩增倍数达8.23±1.26。结论sCD40L与SCF、IL-3、EPO、GM-CSF联合应用,对人脐血造血干细胞的体外扩增更为有效。     

脐血间充质干细胞的分离扩增及向成骨及脂肪细胞的分化

目的探讨新生儿脐血间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）体外分离、纯化、扩增，以及向成骨及脂肪细胞定向诱导分化的方法与条件。方法无菌条件下收集新生儿脐血60～120ml，枸橼酸钠抗凝，以Ficoll—Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度法、沉降红细胞后密度梯度法及CD34^＋免疫磁珠负选法分离单个核细胞（mononuclear cells，MNCs）。分离获得的MNCs采用L—DMEM培养基或Mesencult^TM培养基／10％胎牛血清进行MSCs培养传代，获得第3代集落生长细胞作流式细胞仪表面抗原测定，并向成骨及脂肪细胞定向诱导分化，成骨细胞钙沉积经茜素红染色鉴定，脂肪细胞胞浆油滴经油红染色鉴定。结果经沉降红细胞后分离的MNCs，使用Mesencult^TM培养基／10％胎牛血清培养成功率高，第3代可出现明显的集落生长，而另两种方法分离培养的细胞则难以形成集落；集落细胞表面抗原测定表达CD29、CD59、CD71而不表达CD34、CD45及HLA—DR等分子。成骨定向诱导分化的集落细胞经茜素红染色胞浆中出现有大量的钙沉积；成脂肪定向诱导分化的集落细胞油红染色示胞浆充满油滴空泡。结论新生儿脐血中可分离出MSCs，并可在体外进行培养扩增。以甲基纤维素沉降红细胞后密度梯度离心分离的MNCs培养较为有效，集落细胞表达基质细胞表面抗原，能够向成骨细胞及成脂肪细胞定向诱导分化。     

人骨髓长时间培养中破骨细胞的形成

在粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）存在下，离体培养人骨髓单个核细胞３周，结果显示有大量具破骨细胞特性的多核细胞形成，细胞核３～２０余个不等，多数细胞显示抗酒石酸盐酸性磷酸酶强阳性反应，当与牙本质片共育３周，可在牙本质片上形成典型吸收陷窝，并可见具有破骨细胞形态样的细胞，提示此培养条件下有大量破骨细胞形成．     

人骨髓来源内皮祖细胞的分离培养及生物学特性的鉴定

目的建立人骨髓来源的内皮祖细胞（EPCs）分离、培养、诱导分化与鉴定的方法,并探讨其生物学特性。方法收集腰椎间盘退变性疾病患者的髂骨骨髓24例,密度梯度离心法分离的单个核细胞接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶,贴壁培养,EGM-2培养基诱导扩增EPCs。Dil-ac-LDL、FITC．UEA—I荧光双标、流式细胞术鉴定EPCs,计算纯度。透射电镜和管腔形成实验鉴定EPCs向血管内皮细胞（ECs）分化的能力。结果培养72h换液时可见贴壁细胞形成明显细胞克隆集落,第5天集落数增加,1周后细胞融合达80％,至第14天细胞呈铺路石样排列。培养至第7天细胞Dil-ac-LDL、FITC-UEA-I双荧光染色阳性率为（95．1±4．0）％,CD133、CD34、KDR、VE。Cadherin标记阳性率分别为（18．5±4．4）％、（45．4±7．8）％、（66．7±7．2）％、（20．5±5-3）％。培养第10天细胞透射电镜显示成熟血管ECs特有的Weibel-Palade小体。管腔形成实验表明,体外ECMatrix上培养7至12d的EPCs具有较强的管腔形成能力。结论采用密度梯度离心与贴壁培养法分离、培养的人髂骨骨髓来源的单个核细胞在特定诱导条件下可分化为EPCs,纯度较高,稳定性和重复性好。EPCs培养7至12d,具有良好的管腔形成能力。     

来氟米特抑制狼疮肾炎患者树突状细胞成熟的实验研究

目的：观察来氟米特活性代谢产物A771726处理前后狼疮。肾炎（1upus nephritis，LN）患者树突状细胞（DC）表面标志及功能的改变，探索来氟米特治疗LN的新途径。方法：分离LN患者外周血单个核细胞，用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）等细胞因子诱导DC成熟，来氟米特组再加入A771726培养。培养第9天收集DC细胞，流式细胞仪检测CD80、CD86和HLA-DR的表达。肌法检测DC刺激淋巴细胞增殖的能力，ELISA法检测混和淋巴细胞反应培养上清IL-10和IFN-γ水平。结果：A771726处理后的DC表达0380、cm86和HLA-DR百分数较对照组均明显降低[（62．80±1．67）vS（78．35±4．50），（64．50±13．06）vs（84．91±9．80），（71．44±11．56）vs（91．51±7．63）]，P均〈0．01；A771726处理后的DC与T细胞混合培养，其刺激T细胞增殖相应的OD值较对照组明显降低[DC：TC=1：10时，（0．295±0．069）vs（0．468±0．100）；DC：TC=1：50时，（0．196±0．044）vs（0．391±0．023）]，P均〈0．01。其混合培养的上清液中IL-10水平较无A771726处理的DC与T细胞的混合培养上清液明显降低[（205．0±35．8）pg／ml vs （443．6±93．2）pg／ml，P〈0．01]，而IFN-γ两者间无统计学差异[（89．3±11．9）pg／ml vs （99．9±15．7）pg／ml，P〉0．05]。结论：A771726在体外可抑制LN患者外周血DC的成熟，未成熟DC能抑制T细胞增殖及T细胞向Th2细胞转化。     

用IL-2和IFN-α2a体外净化急性髓细胞性白血病患者骨髓的实验研究

目的 为了减少自体骨髓移植的复发率而探索一种理想的骨髓净化方案。方法 用白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-α2a （IFN-α2a）分别净化15例急性髓细胞性白血病（AML）骨髓3d,检测净化前和净化后骨髓粒巨噬细胞集落（CFU-GM）、红系祖细胞集落（CFU-E）、红系爆式集落（BFU-E）、混合细胞集落（CFU-MIX）、白血病祖细胞集落（CFU-L）以及骨髓单个核细胞CD33、CD38、CD34的阳性表达率,并用MTT法测定IL-2、IFN-α2a对9例原代AML骨髓细胞的毒性作用,从而观察其对白血病细胞和正常干/祖细胞的影响。结果（1）IL-2、IFN-α2a在净化过程中对CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-MIX无影响;（2）IL-2、IFN-α2a均能明显降低CD33、CD38的阳性率,增加CD34的阳性率（P<0.05）,二者联合作用更强（P<0.01）;（3）在净化处理前,15例AML患者CFU-L（集落数/2×105MNC）为130.47±17.49,在净化处理后,IL-2组为14.32±6.24,IFN-α2a组为24.68±8.46,IL-2联合IFN-α2a净化组则没有培养出 CFU-L,未加细胞因子净化对照组为85.12±18.86,各净化组与对照组比较差异均有显著性（P<0.01）,二者联合作用更显著（P<0.01）;（4）IL-2、IFN-α2a对AML骨髓中原代白血病细胞的细胞毒作用（％）分别为50.2±8.4、32.41±5.6,二者联合应用则为72.4     

IFN-γ对胆囊癌荷瘤小鼠IL-10和单核-巨噬细胞的影响

目的探讨IFN-γ对胆囊癌小鼠模型中肿瘤内IL-10和单核-巨噬细胞的影响。方法20只BALB／C裸鼠通过皮下接种人胆囊癌细胞株GBC—SD构建胆囊癌小鼠模型,按照随机数字表法分为IFN-γ组和对照组（每组各10只）。IFN．叮组小鼠在肿瘤内注剃、鼠重组IFN-γ 0．1mL（1×10^5kU／L,生理盐水溶解）,对照组注射同等剂量的生理盐水,通过ELISA法检测肿瘤中鼠源性IL-10的表达情况,通过免疫组织化学染色法计数CDl4’细胞（单核-巨噬细胞）、CD64^＋细胞（M1型巨噬细胞）和CD206’细胞（M2型巨噬细胞）,并以Student’st检验对所得数据进行分析。结果接种肿瘤细胞1周后,裸鼠皮下全部成瘤,固定于左前肢腋下。IFN-γ组存活9只,对照组存活7只。IFN-γ组裸鼠肿瘤质量为（518±138）mg,对照组为（669±128）mg;IFN．1组肿瘤体积为（456±172）mm。,对照组为（505±146）mm。,两组裸鼠肿瘤质量和体积比较,差异无统计学意义（t=2．240,1．503,P〉0．05）。IFN-γ组裸鼠肿瘤中鼠源性IL-10浓度为（58±16）μg／g,显著低于对照组的（102±45）“g／g,两组比较,差异有统计学意义（t=2．796,P〈0．05）。IFN-γ组中单核-巨噬细胞计数为814-16,显著高于对照组的50-e21;M1型巨噬细胞计数为66±12,显著高于对照组的94-4;M2型巨噬细胞计数为154-4,显著低于对照组的40±14,两组细胞计数比较,差异均有统计学意义（t=3．214,13．127,6．914,P〈0．05）。结论IFN-γ能够降低肿瘤微环境中的IL-10浓度。IFN-γ能够诱导单核-巨噬细胞浸润至胆囊癌细胞问质中,主要分化为M1型巨噬细胞。     

MAPK途径磷酸化激活人前列腺癌雄激素受体的研究

目的研究粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）激活人激素非依赖性前列腺癌PC-3M细胞雄激素受体及其可能的信号转导途径。方法将人雄激素受体和雄激素受体激活报告基因氯霉素乙酰转移酶（CAT）转染至人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M,不同浓度的GM- CSF以及特异性Erk1／2磷酸化阻断剂PD98059作用后检测雄激素受体报告基因CAT表达量的变化和促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）途径：Erk1／2分子磷酸化的改变。结果20～100 nmol／L的GM-CSF均能激活PC-3M细胞的外源性雄激素受体,CAT的相应表达量为（0．58±0．16）～（3．80±0．89）ng／mg,CAT表达量与培养基中的GM-CSF浓度成正相关;同时检测到PC-3M细胞中Erk1／2分子磷酸化程度与培养基中的GM-CSF浓度相关,在终浓度50 mmol／L的PD98059阻断Erk1／2分子磷酸化后CAT表达量显著下降。结论GM-CSF能独立激活前列腺癌PC-3M细胞中的雄激素受体,Erk1／2分子磷酸化可能是GM-CSF旁路激活人前列腺癌细胞雄激素受体的机制。     

脂联素对高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞血管内皮生长因子表达的影响

目的探讨脂联素（adiponectin,ADPN）对高糖环境下大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowthfactor,VEGF）表达的影响。方法用含不同浓度葡萄糖的DMEM培养基体外培养NRK-52E细胞,随机分6组（每组5个样本,重复5次）：A组,含5．5mmol／L葡萄糖培养基对照组;B组,含5．5mmol／L葡萄糖＋甘露醇19．5mmol／L培养基组;C组,含25mmol／L葡萄糖培养基组;D组,含25mmol／L葡萄糖培养基＋脂联素1mg／L组：E组,含25mmol／L葡萄糖培养基＋脂联素2．5mg／L组;F组,含25mmol／L葡萄糖培养基＋脂联素5mc／L组,培养24h。以逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）检测VEGF的表达,免疫荧光检测不同浓度干预组VEGF蛋白的表达影响。结果A组细胞VEGFmRNA表达量为（0．367±0．028）;B组为（0．346±0．045）,与A组比较无统计学差异（P〉0．05）;C组为（0．692±0．053）,显著高于A组（P〈0．01）;D组为（0．562±0．049）,低于C组（P〈0．05）。E组为（0．381±0．035）,与A组相近,但无统计学差异（P〉0．05）;F组为（0．295±0．031）,低于A组（P〈0．01）。不同浓度脂联素各组间比较,有统计学差异（P〈0．05）。免疫荧光检测VEGF表达情况;B组与A组无差异;C组显著高于A组（P〈0．01）;D组低于C组（P〈0．05）。E组与A组相近,但无统计学差异（P〉0．05）;F组低于A组（P〈0．05）。不同浓度脂联素各组间比较有统计学差异（P〈0．05）。结论ADPN能通过减少肾小管上皮细胞VEGF的表达对肾小管间质起保护作用。     

转染甲氨蝶呤阿糖胞苷双耐药基因的小鼠骨髓细胞对大剂量化学治疗的保护作用

目的探讨同时导入人双突变的二氢叶酸还原酶基因（DHFR）和胞苷脱氨基酶基因（CD）小鼠骨髓细胞对大剂量甲氨蝶呤（MTX）和阿糖胞苷（Ara-C）的耐受性及骨髓耐受联合化疗的可行性。方法以反转录病毒为载体,将人双突变的DHFR和CD通过共培养转染人两只小鼠骨髓干细胞,观察共培养后的骨髓细胞经Ara-C、MTX、Ara-C＋MTX处理后,耐MTX及Ara-C粒-巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）生成情况;转基因小鼠骨髓细胞提取的DNA,用聚合酶链反应（PCR）检测转基因小鼠骨髓细胞耐药基因的表达。结果含有耐药基因（SFG-F／S-CD）的骨髓细胞均有耐药克隆的形成,耐Ara-C、MTX、Ara-C＋MTX克隆分别为56％、22％和14％,并明显增加了对MTX和Ara-C的耐受（P〈0．005）;转基因小鼠骨髓细胞经PCR检测,显示有F／S、CD基因表达;耐药基因转染后小鼠骨髓细胞对MTX和Ara-C的耐受明显增加。结论双耐药基因可以导入小鼠骨髓细胞并且获得表达,提高了造血细胞对MTX和Aar-C的耐药性。     

双链蛋白聚糖对胃癌细胞生长作用研究

目的:研究双链蛋白聚糖(biglycan,BGN)对人胃癌细胞系SGC-7901的细胞增殖、周期及凋亡等生长作用影响。方法:构建重组质粒pIRES2-EGFP/BGN,转染胃癌细胞株SGC-7901,获得胃癌稳转细胞株SGC-7901/BGN。通过细胞增殖实验(CCK-8法)、平板克隆实验、流式细胞技术,分别检察BGN过表达对SGC-7901细胞增殖、克隆形成、周期及凋亡的影响。结果:SGC-7901/BGN组胃癌细胞较SGC-7901/空载组生长明显抑制(P<0.01),细胞培养板形成的克隆数明显减少[(209.7±12.6)比(326.0±15.1)];同时过表达BGN可促进胃癌细胞的凋亡[(10.7±1.5)%比(5.3±1.1)%],且将细胞周期阻止在G1期[(55.7±2.1)%比(37.6±1.8)%]。结论:胃癌细胞过表达BGN可抑制胃癌细胞的增殖、克隆形成。BGN可能通过将细胞周期阻滞在G1期、诱导细胞凋亡,从而发挥其生长抑制的生物学效应。     

人脐血造血干/祖细胞的生物反应器大规模扩增及移植实验

目的 利用生物反应器大规模扩增人脐血造血干/祖细胞,并通过动物移植实验检验该方法的有效性.方法 采集抗凝脐血10份,分离出单个核细胞(MNC),分别进行生物反应器扩增培养和静态扩增培养.检测扩增前后细胞表面CD34、CD38、CD133、CD184和CD62L分子的表达,并进行造血干/祖细胞集落的培养.取非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠,以X射线照射后,分为4组,其中MNC组小鼠注射未经扩增培养的MNC;静态扩增组小鼠注射经过静态扩增培养的细胞;反应器扩增组小鼠注射经过生物反应器扩增培养的细胞;空白对照组小鼠注射生理盐水.移植后6周处死存活小鼠,收集骨髓细胞,检测其中CD45+、CD3+、CD19+和CD33+细胞的含量以及人特异的Cart-Ⅰ和Alu基因的表达.结果 生物反应器扩增前MNC为(1.2～2.8)×108个,扩增后为(3.7～12.6)×108个,扩增后的细胞数明显高于静态扩增培养者(P<0.01).经生物反应器扩增后所形成的红系集落形成单位、粒-巨噬细胞集落形成单位数明显高于经静态扩增者(P<0.05).移植6周后,空白对照组小鼠均死亡,MNC组存活率为35%,静态扩增组存活率为30%,反应器扩增组存活率为62.9%,后者明显高于前二者(P<0.05).各组存活小鼠骨髓细胞中均检测到Alu基因和Cart-Ⅰ基因的表达以及人源CD33+、CD45+、CD3+及CD19+细胞.结论 利用生物反应器可大规模扩增人脐血造血干/祖细胞,所得细胞能植入小鼠体内,并能获得造血功能重建.     

脐血铅浓度与新生儿端粒长度的相关性

目的研究脐血铅浓度与新生儿端粒长度的相关性。方法收集2010年7月～2013年4月青岛市市立医院产科孕期无急慢性疾病的足月顺产儿脐血78例,原子吸收光谱法测定脐血铅浓度,测得脐血铅浓度在11～89μg/L范围。将78例脐血分成A、B、C三组：A组脐血铅浓度〈30μg／L,共28例,B组脐血铅浓度30～60μg/L,共38例,C组脐血铅浓度〉60μg／L,共12例。采用全血提取基因组法提取脐血DNA,荧光定量PCR法测基因组DNA的端粒长度。各组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用q检验,相关性采用Spearman相关性研究。结果A组端粒长度为：1．152±0．716,B组端粒长度为0．614±0．407,C组端粒长度为0．546±0．339,从A组到C组端粒长度逐渐缩短,且差异有统计学意义（F=4．895,P〈0．05）。B组端粒长度低于A组,差异有统计学意义（P〈0．05）,C组端粒长度低于A组端粒长度,差异有统计学意义（P〈0．01）。B、C两组之间的差异没有统计学意义（P〉0．05）。三组端粒长度与脐血铅浓度呈负相关（r=-0．461,P〈0．01）。结论脐血铅可导致新生儿端粒长度的缩短,且随脐血铅浓度的升高,新生儿端粒长度进行性缩短,端粒长度缩短影响细胞分裂,决定细胞寿命。     

骨癌痛小鼠痛行为及脊髓背角磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白和脑源性神经营养因子表达的改变

目的 通过观察骨癌痛小鼠痛行为学的变化,磷酸化环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding protein,pCREB）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）在脊髓背角中表达的变化,探讨pCREB和BDNF在骨癌痛产生和维持中的作用. 方法 52只雄性C3H/HeJ小鼠,采用随机数字表法分为骨癌痛组（T组）和假手术组（S组）,每组26例.T组小鼠右侧股骨骨髓腔内注射含2×10^5个纤维肉瘤细胞的20μl最小必须培养基（α-minimal essence medium,α-MEM）,而S组注入不含肿瘤细胞的20μ1α-MEM,分别于接种肿瘤细胞前1d、接种后第4、7、10、14、21天测定自发抬足次数（spontaneous lifting times,SLTs）和机械缩足阈值（paw withdrawal mechanical threshold,PWMT）.按照分组在相应时间点处死小鼠,用免疫印迹法测定小鼠L3～5脊髓背角pCREB和BDNF的蛋白表达水平. 结果 与术前基础值和S组比较：接种后7、10、14、21d,T组小鼠SLTs[（4.43±0.91）,（7.10±1.03）,（11.27±1.35）,（13.03±0.58）次]显著增加（P＜0.05）;接种后10、14、21 d,T组小鼠PWMT[（0.63±0.20）、（0.32±0.12）、（0.24±0.12）g]明显下降（P＜0.05）,脊髓背角pCREB[（3.78±0.58）、（3.92±0.46）、（4.92±0.37）]和BDNF[（2.13±0.31）、（2.88±0.15）、（2.58±0.41）]的表达显著增加（P＜0.05）. 结论 骨癌痛小鼠脊髓背角pCREB和BDNF表达增加,并且与痛行为学的改变具有相关性,提示其可能参与了骨癌痛的产生和维持.     

人脐血造血干/祖细胞的磁力搅拌悬浮培养及移植实验

目的 探讨磁搅拌大规模培养体系对人脐血造血祖细胞的扩增效果以及扩增的人造血祖细胞植入动物体内后的造血重建情况.方法 从新鲜抗凝脐血中分离出单个核细胞(MNC),以添加干细胞因子、酪氨酸激酶受体3配基及血小板生成素的无血清培养体系进行培养.静态扩增组的细胞置于T25培养瓶中培养,磁搅拌悬浮扩增组(磁搅拌扩增组)的细胞采用Celstir装置进行培养,培养体系为50～100 ml.培养7 d后进行细胞计数、集落培养检测和细胞表面分子表达的测定.以不进行培养者为对照组.非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠在接受2.5 Gy的亚致死剂量X射线照射后分别从尾静脉输入上述静态扩增组、磁搅拌扩增组和对照组的MNC(5×106个),另设不移植的空白对照组.观察小鼠的存活情况,6周后处死存活小鼠,检测骨髓细胞中CD34+细胞、CD3+细胞、CD19+细胞、CD33+细胞及CD45+细胞的含量以及人特异的Cart-Ⅰ和Alu基因的表达.结果 经过7天的培养,磁搅拌扩增组的造血祖细胞扩增倍数为(2.8±0.45)倍,明显高于静态扩增组的(2.1±0.48)倍(P<0.01).磁搅拌扩增组形成的红系集落、粒-巨噬细胞集落数均明显高于静态扩增组(P<0.05).静态扩增组扩增后的CD34+细胞、CD34+CD38-细胞和CD133+细胞含量均高于磁搅拌扩增组(P<0.05),而CD184+细胞和CD62L+细胞含量低于磁搅拌扩增组(P<0.01).移植后6周,对照组、静态扩增组和磁搅拌扩增组分别有3、4、5只小鼠存活,三组间两两比较,6周存活率的差异无统计学意义(P>0.05).存活6周的小鼠,其骨髓中能检人特异性CD34+细胞,以及CD3+细胞、CD19+细胞、CD33+细胞及CD45+细胞,也检测到人Alu基因和Cart-Ⅰ基因的表达.结论 磁搅拌培养能大规模扩增脐带血造血祖细胞,扩增的细胞能植入x射线照射的NOD/SCID小鼠,并重建其多系造血.     

脐带间充质干细胞对创伤后早期急性肺损伤作用的研究

目的：探讨脐带间充质干细胞（UCMSC）对创伤后急性肺损伤（ALI）早期的作用.方法：采用撞击后静脉注射脂多糖的二次打击方法复制创伤后ALI家兔模型.24只家兔随机分为正常对照组（正常饲养）、ALI组（复制ALI模型）和UCMSC组（伤前30 min静脉注射UCMSC 1×106个）,每组8只.各组动物于伤后0、1.5、3和6 h测定血浆TNF-α含量;伤后6 h测定PaO2,支气管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α、补体C3a和C5a、白蛋白含量及中性粒细胞计数,肺湿/干重比值（W/D）,免疫组织化学法观察肺组织中TNF-α蛋白的表达,光镜下观察肺组织病理学变化.结果：与正常对照组比较,ALI组PaO2下降,其余各检测指标均明显升高,镜下见肺泡壁破坏,肺泡腔渗出和出血,肺组织TNF-α表达增强.伤前给予UCMSC能提高ALI动物的PaO2,不同程度降低外周血TNF-α及BALF中TNF-α[（0.72±0.70）μg/L比（1.82±0.60）μg/L]、C3a[（0.28±0.07）μg/L比（0.45±0.03）μg/L]、C5a[（0.08±0.01）μg/L比（0.19±0.03）μg/L]、白蛋白含量[（69.0±9.7）mg/L比（102.0±14.9）mg/L]和中性粒细胞计数[（229.0±21.4）×106/L比（298.0±36.8）×106/L],降低肺W/D,抑制肺组织TNF-α蛋白表达,减轻肺泡的损伤程度.结论：UCMSC能减少ALI时组织及血浆TNF-α的含量,减轻肺泡损伤程度,在一定程度上对早期创伤后急性肺损伤起保护作用.     

不同冻存液对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察不同冻存液对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC）冻存复苏后生物学特性的影响,优化冻存方法。方法脐带取自2011年1月至2011年12月在中山大学附属第三医院产科剖宫产的足月健康产妇。从脐带分离得到的hUC—MSC培养传代,取第3代细胞。根据冻存液不同分为3组,A组冻存液为二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）：胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）：低糖杜氏培养基（low glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium,LG—DMEM）为1：2：7,B组为DMSO：FBS：LG—DMEM为1：5：4,C组为DMSO：FBS为1：9,不含LG—DMEM。经冻存12个月,复苏细胞,以第3代未冻存细胞悬液作为对照组,采用台盼蓝染色法比较hUC—MSC的细胞存活率,采用噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTF）法比较细胞的生长情况绘制生长曲线,倒置显微镜下观察细胞的生长状况,采用流式细胞仪检测各组细胞的表面标记。结果A、B、C三组的细胞存活率分别为（20±4）％、（71±8）％和（85±7）％。与C组比较,A组和B组的细胞存活率降低,差异有统计学意义（均为P〈0．05）。细胞生长曲线显示,与对照组相比,C组hUC—MSC在各时间点细胞生长迅速,但差异无统计学意义（P〉0．05）;B组hUC—MSC在24h、48h、72h细胞生长差异无统计学意义（P〉0．05）,在96h时间点生长速率低于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;而A组hUC—MSC在各个时间点细胞生长减慢,差异有统计学意义（均为P〈0．05）。形态学观察显示,A组细胞胞体宽大多角,并且较多分支,B组和C组细胞饱满,折光性好,呈长梭形、纺锤形或多角形。A组细胞复苏后细胞数目过少无法进行表面标记,B组和C组hUC—MSC表面标记物CD31、CD34、CD45、人类白细胞抗原（HLA）-DR表达阴性,CD105、CD90、CIM4表达阳性。结论含高浓度血清的冻存液适合hUC—MSC的长期保存,含90％FBS的冻存液为hUC—MSC的最佳冻存保护液。     

甲型H1N1流感危重症患者淋巴细胞亚群和CD4~＋CD25~＋调节性T细胞的检测及其意义

目的观察甲型H1N1流感（甲流）危重症患者外周血白细胞（WBC）、淋巴细胞（L）、中性粒细胞（N）、淋巴细胞亚群及CD4＋CD25＋调节性T细胞的变化,探讨外周血淋巴细胞亚群及CD4＋CD25＋调节性T细胞在危重症甲流发病机制中的作用。方法对8例甲流危重症患者和10例健康对照外周血WBC进行检测,并用流式细胞术对其淋巴细胞亚群及CD4＋CD25＋调节性T细胞进行检测。结果患病初WBC正常者5例,降低者3例,以L降低为主,最低达0.60×109/L。病程中8例患者WBC和N均明显升高,WBC最高达36.42×109/L,N最高达33.27×109/L;甲流危重症患者CD3＋（55.13±16.16）%、CD4＋（27.25±9.51）%显著低于正常对照组（P〈0.05）;B细胞（CD19）、NK（CD16＋CD56＋）细胞、CD8＋及CD4/CD8比例较健康对照组下降,但差异无统计学意义;患者CD4＋CD25highCD127LowT细胞（1.81±1.25）%稍低于与健康对照组,差异无统计学意义（P〉0.05）;但8例甲流危重症中有6例孕妇,1例死亡患者的CD4＋CD25highCD127LowT细胞含量为本研究中最高。结论甲流危重症患者外周血CD3＋、CD4＋细胞数量显著降低、CD4＋CD25＋调节性T细胞及CD4/CD8下降,提示细胞免疫异常可能在甲流危重症的发病机制中起重要作用;淋巴细胞亚群及CD4＋CD25＋调节性T细胞数量的检测可作为监测甲流患者免疫功能的指标,对于患者的治疗和预后有重要的参考价值。     

抗CD54抗体对脓毒症小鼠的治疗作用

目的探讨应用抗CD54抗体保护脓毒症小鼠肺脏功能并改善其免疫功能状态的机制。方法24只C57／BL6小鼠按完全随机法分为4组：假手术组（Sham组）、盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）模型小鼠±生理盐水组（CLP组）、CLP±抗CD54抗体组（Anti-CD54组）和CLP±抗CD54抗体同型对照组（Isotype组）,每组6只。观察各组小鼠肺组织病理形态学改变,肺组织炎性因子肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF）mRNA、白介素（intedeukin,IL）-10和IL-6的mRNA表达水平,胸腺、脾脏和肺组织髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）活性,肺组织湿重／干重比值,外周血和腹腔灌洗液细菌清除率,胸腺和脾脏细胞凋亡情况。结果苏木精-伊红（hematoxvlin-eosin,HE）染色显示应用Anti-CD54组小鼠与CLP组和Isotype组小鼠比较,肺组织的损伤程度减轻,表现为间隔轻度增宽、无明显出血,少量炎性细胞浸润;Anti．D54组肺组织TNF-α（3．93±0．82）和IL-10（2．83±0．55）的mRNA水平,均显著低于CLP组[（8．22±2．34）、（6．05±1．52）]和Isotype组[（8．54±1．75）、（5．56±1．33）]（P〈0．05）;Anti-CD54组胸腺[（45±10）U／mg]、脾脏[（39±8）U／mg]和肺组织[（64±12）U／mg]匀浆MPO活性（P〈0．05）,均显著低于CLP组[（98±13）、（78±12）、（105_±10）U／mg]和Isotype组[（88±20）、（90±16）、（110±16）U／mg]（P〈0．05）;Anti-CD54组（4．03±0．18）肺组织湿重／干重比值,显著低于CLP组（4．95±0．18）和Isotype组（4．81±0．31）（P〈0．05）;Anti-CD54组血液（6±2）及腹腔灌洗液（5±2）细菌清除率显著高于CLP组[（76±18）、（72833±7176）]和Isotype组[（69±18）、（66532±143006）]（P〈0．001）;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal deoxynueleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）结果显示：Anti-CD54组胸腺（55±13）和脾脏（45±17）组织凋亡细胞百分比数显著少于CLP组[（127±30）、（130±25）]和Isotype组[（223±15）、（110±42）]（P〈0．05）。结论抗CD54抗体对脓毒症小鼠具有一定的治疗作用,可能与其改善小鼠肺功能状态,提高血液和腹腔清除率,抑制小鼠脾脏和胸腺凋亡有关。