PTEN cDNA重组腺病毒载体的构建

目的:应用同源重组法构建含野生型抑癌基因PTEN cDNA的腺病毒载体pAdPTEN cDNA,产生重组腺病毒AdPTEN.方法:将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN cDNA中切出,亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,产生重组PTEN cDNA的腺病毒载体pAdPTEN cDNA,通过脂质体介导将pAdPTEN cDNA转染至HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒AdPTEN,并测定其滴度.结果:产生具有感染能力的重组腺病毒AdPTEN,滴度约为5×109pfu/ml.结论:成功构建出含有PTEN cDNA的具有感染能力的腺病毒,并可获得较高的病毒滴度,为进一步研究PTEN基因的功能和相关肿瘤的基因治疗提供有效的基因转移载体.     

反向克隆法大鼠anti- ERK2腺病毒载体构建

目的正义基因反向克隆法构建大鼠anti-ERK2腺病毒载体.方法酶切质粒p3XFLAG-CMV7.1-ERK2,得到ERK2 cDNA片段,连接到T载体进行测序,经测序正确反向克隆法插入质粒pShuttle中,最后转入AdEasy(tm)XL Adenoviral Vector System系统中得到anti-ERK2基因腺病毒载体.结果DraI和NotI双酶切鉴定anti-ERK2基因腺病毒载体,发现插入的基因序列与插入方向均符合预期目标.结论成功构建了大鼠anti-ERK2腺病毒载体,为研究移植排斥中ERK2基因治疗的作用提供了良好工具.     

新型腺病毒载体的制备及其特性研究

目的：本研究在普通腺病毒载体（Adv）纤毛头节区插入了具有整合素特异性的RGD肽,制备了一种新型RGD-Adv,以克服Adv基因转导的柯萨奇腺病毒受体依赖性.方法：用体外连接法构建RGD-Adv,并考察其基因转效率、稳定性及体外、体内毒性.结果：RGD-Adv可有效地实现向受试细胞转导基因,其转导能力随病毒量的增加而加强.结论：具有av亲和性的RGD-Adv是一种安全高效的新型腺病毒载体,将在基因治疗及实验研究中发挥重要作用.     

HBsAg腺病毒疫苗载体的构建

目的:构建含HBsAg基因的重组复制缺陷型腺病毒疫苗载体.方法:以pEcob-6为模板,PCR扩增目的基因HBsAg,腺病毒穿梭载体PAd-track-cmv与HBsAg经T4连接酶连接,重组为PAd-track-cmv-HBs穿梭质粒;腺病毒骨架载体质粒PAd-Easy-1再与PAd-track-cmv-HBs在大肠杆菌BJ-5183中同源重组为PAd-Easy-1-HBs质粒.结果:PAd-track-cmv-HBs穿梭质粒经上海基康生物技术公司进行DNA测序,结果与预期结果相同,含有完整的HBsAg目的基因.PAd-Easy-1-HBs用Pac-1酶切,Pac-1能将载体切成两个片段,大片段约为30 kb,小片段约为3 kb.结论:HBsAg腺病毒疫苗载体构建成功,为进一步研究PAd-track-cmv-HBs诱发抗HBV免疫打下了基础.     

Ad-VEGI151对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的:研究以复制缺陷型重组腺病毒为载体的血管内皮细胞生长抑制因子基因(VEGI151)对静脉内皮细胞的增殖抑制作用.方法:利用腺病毒载体pCA13构建携带VEGI151基因的质粒,经293A细胞包装、扩增,Western印迹法检测病变细胞内基因的蛋白质表达.X-gal染色测定重组腺病毒载体系统的基因转移效率,结晶紫染色法检测细胞D570/630值,观察Ad-VEGI151对ECV304细胞增殖抑制作用的效果,免疫组织化学检测ECV304细胞内VEGI151基因的蛋白质表达.结果:应用细胞内质粒DNA同源重组法,将脂质体介导质粒pCA13-VEGI151与pJM17共转染293A细胞制备重组腺病毒,所获病毒滴度高,是一种制备重组腺病毒切实可行的方法.Ad-VEGI151在病变细胞内能成功表达蛋白,具有较高的基因转移效率,对静脉内皮细胞的增殖具有强烈的抑制作用,并能在靶细胞内表达有生物学活性的蛋白质.结论:以复制缺陷型重组腺病毒为载体的VEGI151基因能在靶细胞内表达具有生物学活性的蛋白质,抑制体外静脉内皮细胞的增殖,这为进一步肿瘤及新生血管性疾病的基因治疗提供了新的方法.     

含有CD基因的腺病毒载体的构建

目的 :构建携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体。方法 :先将真核表达载体质粒 pCI中的转录框架构建入腺病毒载体中 ,后再将CD和LacZ基因分别装配到框架的多克隆位点内。结果 :经过酶切鉴定成功地构建了分别携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体 ,对肿瘤的前药转换基因治疗有重要意义。     

hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体.方法:采用分子克隆技术,从PCR2.1-hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-hVEGFA,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠埃希菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-hVEGFA.鉴定后,将pAdeasy-1-hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞),获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAd-hVEGFA).反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度,荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达.结果:成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达,证明腺病毒载体rAd-hVEGFA 转染成功,通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒.结论:成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAd-hVEGFA,可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体.     

PPARγ2基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建携带PPARγ2基因的腺病毒载体.方法 采用PCR技术从pcDNA3质粒中扩增小鼠PPARγ2基因,将PPARγ2基因亚克隆至质粒穿梭载体pAd-Track-CMV.用脂质体(lipid body)转染法(infection protocol)将重组腺病毒pAd-Track-PPARγ2-CMV和pAdEas-1共转染293细胞,确定转染效率.结果 RT-PCR检测结果显示腺病毒Ad-PPARγ2PCR产物约为470bp;用抗PPARγ2单克隆抗体进行Western blot检测为阳性,感染的重组腺病毒载体在L02细胞中PPARγ2有较高的稳定表达.结论 成功构建携带小鼠PPARγ2基因的腺病毒载体.     

第三代腺病毒载体的改良与应用

腺病毒载体是一种非常有效的转基因载体,具有高效率、低致病性、高滴度及不整合入宿主细胞染色体等优点,广泛应用于基因治疗.第一、二代腺病毒载体仍有许多不足之处,在其基础上发展了第三代腺病毒载体.第三代腺病毒载体与前者相比,具有低免疫原性及高容量等优点,在基因治疗中表现出独特优势.然而,由于辅助病毒污染的存在及病毒产量有待提高,第三代腺病毒载体的临床应用仍面临一定困难.     

重组腺病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用

腺病毒载体转导目的基因具有效率高、滴度高、在体内不与宿主细胞染色体整合等优点,使腺病毒载体在肿瘤的基因治疗研究与实践方面得以广泛运用。本文就三代腺病毒载体的构建与改进,腺病毒载体介导的肿瘤基因治疗策略及其应用进展进行了简要地综述,并讨论了在肿瘤基因治疗中仍需解决的安全问题和面临的挑战。     

应用AdMax载体系统构建SCL基因重组腺病毒表达载体

目的 用AdMax载体系统构建人SCL基因重组腺病毒载体,为研究SCL基因对ICC样细胞功能恢复奠定基础.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1、3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.结果 PCR结果和Western blotting检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/mL.结论 AdMax载体系统可成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体.     

HBX基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建携HBX基因的腺病毒载体,为进一步研究HBX基因的功能,为阐明HBV感染导致肝癌的机制研究建立基础.方法:采用PCR技术从HBV全基因组DNA中扩增HBX基因;将HBX基因亚克隆至质粒pHAHA,构建质粒pHAHA-HBX,酶切pHAHA-HBX质粒,将HAHA-HBX片段克隆到腺病毒载体pAd-Track-CMV中,得到pAdTrack-CMV-HBX,同时与pAdEasy-1共转染293细胞,确定转染效率.检测培养上清病毒中HBX的存在.结果:将PCR扩增HBX片段成功克隆到腺病毒载体中,并经序列分析证实;建立了产病毒细胞株,证实重组病毒中含有HBX基因.结论:成功构建了携HBx基因的腺病毒载体.     

腺病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用

腺病毒载体目前广泛地应用于肿瘤的基因治疗。随着对腺病毒分子结构、功能以及感染机制的进一步深入了解,人们在降低其免疫原性,增强基因导入特异性,增强感染和表达效率等方面进行了许多探索,开发具有肿瘤靶向性的溶瘤腺病毒载体是其发展方向与研究热点。本文对腺病毒载体的生物学、构建策略及其在肿瘤基因治疗中的应用进行综述。     

不同基因载体系统对脐带血间充质干细胞转染效果的初步研究

 目的 比较慢病毒载体和腺病毒载体转染人脐带血间充质干细胞后,外源基因的表达。方法采用人脐带血分离培养间充质干细胞,制备表达GFP的慢病毒载体和腺病毒载体,用以转染间充质干细胞,观察其外源基因的表达。结果 脐带血间充质干细胞与骨髓中的类似,其外表呈纤维样;转染5周后,慢病毒载体转染的GFP阳性表达明显高于腺病毒载体。结论 慢病毒载体较腺病毒载体作为基因转导系统更有优势。     

带有荧光素酶报告基因的可调控重组腺病毒载体的构建及表达

目的:构建带有萤火虫荧光素酶报告基因的可调控腺病毒载体,并在SW620结肠癌细胞株中观察其调控表达.方法:将萤火虫荧光素酶luc基因和启动子,以及RU486调控系统构建成单一的穿梭载体PDC-RULUC,将其与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒共转染293细胞后,构建出可调控的重组腺病毒载体.扩增后用最终稀释法测定了其滴度,并在SW620细胞中检测了其基因调控效果,结果:成功地构建了携带有RU486调控系统的可调控腺病毒载体Ad-RULUC,病毒滴度达到5.2×1013pfu/L.当给予诱导剂RU486后,腺病毒载体可以诱导表达荧光索酶,并在一定范围内两者呈正比,而没有RU486时,几乎没有报告基因的表达.结论:腺病毒Ad-RULUC能调控外源基因的表达,为基因调控研究和基因治疗提供了良好的工具.     

HBV-TR重组腺病毒载体的构建

目的: 构建乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targeted ribonuclease, TR)基因的重组腺病毒载体. 方法: 将HBV-TR基因及其对照组基因分别克隆入质粒载体pDC316得到pDC316/TR等穿梭质粒,然后将所得的穿梭质粒和辅助质粒pBHGlox(delta)E1, 3Cre以磷酸钙法共转染HEK293细胞得到重组腺病毒Ad/TR及对照组重组病毒,并以空斑形成实验(Plaque Assay)测定病毒滴度. 结果: 成功构建了HBV-TR重组腺病毒载体Ad/TR及其对照组病毒并获得了高滴度的病毒颗粒. 结论: HBV-TR重组腺病毒载体成功构建.     

腺病毒载体疫苗研究进展

腺病毒不整合到宿主基因组、具有极低的插入突变风险,因此腺病毒载体广泛用作基因治疗载体。此外,腺病毒载体诱导机体产生免疫应答,有较高的热稳定性,使其成为极具潜力的疫苗载体。2019年新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)的暴发使人们更加关注腺病毒载体疫苗的应用。接种疫苗仍是预防、控制包括COVID-19在内传染病最经济有效的手段,目前已开发出多种基于腺病毒载体的疫苗。本文综述了腺病毒载体基本性质、免疫机制、临床应用以及研发进展。     

基因治疗病毒载体的研究进展

基因转移载体是基因治疗的重要组成部分,包括病毒载体和非病毒载体。目前应用的病毒载体主要有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。不同的病毒载体各有利弊。随着对病毒载体的不断改造完善,提高其基因转移效率和安全性,病毒载体将在基因治疗中继续发挥重要作用。     

腺病毒载体及其应用

随着疾病分子水平机理研究的不断深入,基因治疗已成为很多疾病防治及医学研究工作新的切入点。理想的基因治疗方案需具备有效性与安全性,因此安全有效的基因转导载体及技术是决定基因治疗成败的关键。在众多的基因转导载体中,重组腺病毒载体能利用病毒自身感染宿主细胞的特点,简便有效地将目的基因导入靶细胞,并使其有效表达。而且腺病毒为DNA病毒,极少发生插入突变,载体操作方便、宿主广泛、容易增殖,并具有携带外源基因容量大,可表达接近翻译后成熟水平蛋白质等特点,已被广泛用于多种疾病的基因治疗。本文拟就腺病毒载体的构建,载体效能…     

连环蛋白P120基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建携带HA—tag的连环蛋白P120（P120ctn）基因重组腺病毒载体,并观察腺病毒感染后P120ctn在HepG-2细胞中的表达情况。方法把HA-tag和P120ctn基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack—CMV中,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,获得腺病毒重组质粒。再将获取的腺病毒重组质粒转染入293细胞进行包装,获取P120ctn重组腺病毒并进一步感染HepG-2细胞株。结果P120ctn基因成功克隆到腺病毒载体中,该腺病毒可高效介导P120ctn在HepG-2细胞中表达。结论成功地构建了含P120ctn基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其功能奠定了基础。