Lipopolysaccharide induces RAW264.7 macrophageautophagy-related LC3B-GFP fluorescent aggregates formed

目的 构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒并转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,观察脂多糖(LPS)诱导其自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体形成的过程.方法 根据编码小鼠微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的开放读码框(ORF)设计引物,RT-PCR扩增小鼠LC3B的ORF,构建pEGFP-C1 /LC3B重组质粒;脂质体法转染并筛选稳定表达RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察及Western blot鉴定LC3B-GFP融合蛋白表达;LPS刺激稳定转染的RAW264.7细胞株,激光共聚焦显微镜检测不同时间绿色荧光聚集体的分布.结果 成功构建真核表达质粒pEGFP-C1 /LC3B,并获得稳定表达LC3B-GFP融合蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白分布,Western blot鉴定表达LC3B-GFP融合蛋白,激光共聚焦结果 显示LPS刺激前融合蛋白呈弥散性分布在胞浆中,而LPS刺激后细胞内有明显绿色荧光聚集体形成并呈时间依赖性逐渐增加.结论 成功构建pEGFP-C1/LC3B,转染RAW264.7细胞可正确表达LC3B-GFP融合蛋白,LPS刺激后显示绿色荧光聚集体形成.     

脂多糖诱导巨噬细胞自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体的形成

目的构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒并转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,观察脂多糖(LPS)诱导其自噬相关LC3B-GFP荧光聚集体形成的过程。方法根据编码小鼠微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的开放读码框(ORF)设计引物,RT-PCR扩增小鼠LC3B的ORF,构建pEGFP-C1/LC3B重组质粒;脂质体法转染并筛选稳定表达RAW264.7细胞株,荧光显微镜观察及Western blot鉴定LC3B-GFP融合蛋白表达;LPS刺激稳定转染的RAW264.7细胞株,激光共聚焦显微镜检测不同时间绿色荧光聚集体的分布。结果成功构建真核表达质粒pEGFP-C1/LC3B,并获得稳定表达LC3B-GFP融合蛋白的RAW264.7细胞株,荧光显微镜下可见细胞内有绿色荧光蛋白分布,Western blot鉴定表达LC3B-GFP融合蛋白,激光共聚焦结果显示LPS刺激前融合蛋白呈弥散性分布在胞浆中,而LPS刺激后细胞内有明显绿色荧光聚集体形成并呈时间依赖性逐渐增加。结论成功构建pEGFP-C1/LC3B,转染RAW264.7细胞可正确表达LC3B-GFP融合蛋白,LPS刺激后显示绿色荧光聚集体形成。     

稳定表达绿色荧光蛋白的COS7细胞系的筛选和鉴定

目的 构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的COS-7细胞系,为相关实验对照提供方便. 方法 常规方法培养COS-7细胞,将含pEGFP-N3基因的质粒转染COS-7细胞,G418抗性筛选,并用荧光显微镜进行跟踪检测,挑选耐药单细胞克隆并扩大培养至稳定细胞株. 结果 G418筛选的最适浓度为500 μg/mL.筛选到的COS7 -GFP克隆荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光,细胞的生物学性状保持稳定,通过Western blot能检测到GFP蛋白. 结论 成功筛选并建立了稳定表达的COS7 -GFP细胞系.     

稳定表达GlyRα1的HEK293细胞系的建立

目的:建立稳定表达甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)真核表达载体的人胚肾细胞(HEK293)细胞系.方法:构建pcDNA3.1-GlyRα1真核表达载体,应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入HEK293细胞,再用G418筛选表达稳定的细胞系.真核细胞中GlyRα1的表达分别用RT-PCR与Western blot方法检测.结果:在7株转染并经G418反复筛选的HEK293细胞系中,有4株细胞系明显表达GlyRα1的mRNA及其蛋白质,其余3株细胞表达较弱或者没有表达.结论:用pcDNA3.1-GlyRα1转染的HEK293细胞经G418筛选,可成功建立GlyRα1稳定表达系.     

Klf4基因在人神经胶质瘤细胞U251中的稳定表达

目的:建立稳定表达Klf4基因的神经胶质瘤细胞U251 ,为探讨该基因在神经胶质瘤细胞中的功能奠定基础.方法:以低表达Klf4基因的人胶质瘤细胞系U251为材料,以Klf4基因转染U251细胞系,G418筛选,获取G418抗性单克隆进行培养,扩增后分别用免疫荧光技术、免役印迹技术(Western blot)验证获得的表达细胞株.结果:经转染和G418筛选后,荧光显微镜下见有明显表达Klf4基因的细胞,Western blot检测到转染基因Klf4后细胞KLF4蛋白的表达增高,而作为对照的转空载体的细胞Klf4的表达较低.结论:该方法成功建立了稳定转染基因Klf4的人胶质瘤U251细胞系,为进一步探讨该基因在肿瘤细胞的功能奠定了一定基础.     

稳定转染pEGFP-4.1 N乳癌细胞系的筛选与鉴定

目的:建立真核表达载体pEGFP-4.1N稳定转染的乳癌MDA-MB-231细胞系,观察4.1N在MDA-MB-231细胞中的表达和定位.方法:真核表达载体pEGFP-4.1N转化到大肠杆菌中进行扩增,酶切鉴定插入片段后进行测序.脂质体法将重组质粒转染至MDA-MB-231细胞中,经G418筛选抗性克隆,利用倒置荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的定位,并用Western blot检测融合蛋白的表达.结果:真核表达载体pEGFP-4.1N的酶切片段经琼脂糖电泳和测序鉴定结果正确.G418筛选14 d后获得pEGFP-4.1 N稳定转染的MDA-MB-231抗性克隆.荧光显微镜下观察到融合蛋白在MDA-MB-231阳性克隆的细胞质中表达.核内不表达.Western blot亦检测到4.1N融合蛋白的表达.结论:成功建立了pEGFP-4.1N稳定转染的乳痛细胞系MDA-MB-231阳性克隆.     

过表达热休克因子1突变体对RAW264.7细胞的影响

目的建立稳定转染热休克因子1(HSF1)显性正性和显性负性突变体的细胞株,并探讨HSF1突变体过表达对细胞生长的影响。方法用脂质体将真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HSF1+和pcDNA3.1(+)-HSF1-分别转染RAW264.7细胞株,G418筛选阳性单克隆,Western blot鉴定高表达的克隆,流式细胞术检测稳定转染HSF1突变体的细胞与转空载体细胞的生长及凋亡情况。结果建立了稳定表达HSF1显性正性或显性负性突变体的细胞株,并发现转染HSF1突变体细胞能影响正常细胞增殖,但不引起细胞凋亡。结论HSF1突变体能影响RAW264.7细胞正常生长周期。     

稳定高表达人GPC3的SK-Hep-1细胞系的构建

目的获得稳定高表达人GPC3的SK-Hep-1细胞系。方法构建人GPC3真核表达载体pc DNA3. 1-GPC3,通过电穿孔的方法转染至SK-Hep-1细胞,利用G418进行细胞筛选,获得稳定高表达GPC3的细胞系。再利用Western blot和流式细胞术进行鉴定,分析稳定转染细胞表面GPC3蛋白的表达情况。结果成功构建的真核表达质粒pc DNA3. 1-GPC3,检测发现SK-Hep-1细胞G418最佳筛选浓度为700μg/m L,利用该浓度G418筛选转染SK-Hep-1细胞,获得了细胞表面能够稳定高表达人GPC3蛋白的SK-Hep-1细胞系。结论建立高表达人GPC3蛋白的SK-Hep-1稳定细胞系,为研究靶向GPC3肝癌抗体提供了物质基础。     

人肽脱甲酰基酶基因真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建人肽脱甲酰基酶(HsPDF)基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,研究HsPDF基因在真核细胞中的表达及功能.方法:通过RT-PCR从人宫颈癌细胞系HeLa中扩增获得HsPDF基因,克隆到真核表达栽体pcDNA3.1(一),利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,G418筛选建立稳定表达细胞系;RT-PCR检测转染后HsPDF基因的mRNA转录水平;MTT法测定转染后细胞增殖能力的变化;苏木精-伊红(HE)染色观察HsPDF对NIH3T3细胞形态的影响.结果:成功构建重组表达载体peDNA3.1(一)-HsPDF.该载体被转染入NIH3T3细胞后,外源HsPDF基因获得了有效的转录与稳定表达.HsPDF显著促进NIH3T3细胞的增殖,并使细胞呈现出一定的恶变特征.结论:HsPDF基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达并表现出明显的生物学功能,为深入研究奠定了基础. G418筛选建立稳定表达细胞系;RT-PCR检测转染后HsPDF基因的mRNA转录水平;MTT法测定转染后细胞增殖能力的变化;苏木精-伊红(HE)染色观察HsPDF对NIH3T3细胞形态的影响.结果:成功构建重组表达裁体peDNA3.1 一)-HsPDF.该载体被转染入NIH3T3细胞后,外源HsPDF基因获得了有效的转录与稳定表达.HsPDF显著促进NIH3T3细胞的增殖,并使细胞呈现出一定的恶变特征.结论:HsPDF基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达并表现出明     

人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的 构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测MCHR2的表达.结果 成功构建了pcDNA3.1( )/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因.结论 真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础.