短发夹核糖核酸沉默EZH2基因对人脑胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨短发夹核糖核酸（sh RNA）对高表达EZH2的人胶质瘤细胞株U251增殖和侵袭的影响。方法构建针对EZH2的sh RNA重组质粒,采用电穿孔的方法转染至U251细胞中,分为对照组、control-sh RNAGFP空载体转染组和EZH2-sh RNA重组质粒转染组。分别通过逆转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测各组细胞EZH2基因和蛋白的表达,以噻唑蓝法测各组细胞的增殖活性,蛋白质印迹法检测各组细胞的EZH2蛋白表达水平;Transwell小室检测细胞侵袭力。结果对照组、control-sh RNA-GFP空载体转染组、EZH2-sh RNA重组质粒转染组U251细胞EZH2基因的表达分别为1.13±0.05、1.15±0.05、0.19±0.02,U251细胞EZH2蛋白的表达分别为1.03±0.03、0.97±0.06、0.20±0.02,转染后24 h细胞增殖能力分别为100.00%±9.31%、100.03%±9.35%、60.13%±3.15%,转染后48 h细胞增殖能力分别为100.00%±9.13%、99.58%±9.27%、53.01%±3.14%,重组质粒转染组较另两组均明显下降,差异有统计学意义（P〈0.05）;重组质粒转染组转染48 h后细胞磷酸化蛋白激酶B和磷酸化叉头框蛋白O1水平降低、细胞周期蛋白D1表达减少、p27蛋白表达增多,差异有统计学意义（P〈0.05）。Transwell小室侵袭实验显示侵袭至Transwell小室滤膜下表面的细胞数在EZH2-sh RNA重组质粒转染组[（46.00±2.82）个]低于对照组[（60.67±5.71）个]和control-sh RNA-GFP空载体转染组[（61.00±2.48）个],差异有统计学意义（P〈0.01）。结论 EZH2基因沉默能有效抑制人胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力,为深入研究EZH2在胶质瘤中作用提供了研究基础。     

miR-577对胶质瘤细胞上皮-间质转化的调控作用及机制

目的探讨miR-577调控胶质瘤细胞上皮-间质转化活性的机制。方法将人源性胶质瘤细胞U87细胞分为miR-577类似物组、miR-577抑制物组和空白对照组,分别转染miR-577 mimic、miR-577 inhibitor和miR577-NC。转染24 h后,采用划痕实验检测各组细胞迁移距离,采用Transwell小室实验检测各组细胞侵袭细胞数,采用反转录PCR法检测各组细胞β-catenin mRNA表达水平,采用Western blot法检测各组细胞vimentin、E-cadherin蛋白相对表达量。结果 miR-577抑制物组、空白对照组、miR-577类似物组细胞迁移距离[(3.44±0.55)、(2.13±0.21)、(1.04±0.14)mm]、侵袭细胞数[(128.50±8.11)、(84.60±4.20)、(39.80±6.01)个]、细胞β-catenin mRNA相对表达量(0.80±0.06、0.61±0.04、0.45±0.06)和vimentin蛋白相对表达量(0.82±0.06、0.67±0.08、0.31±0.02)均依次降低(P0.05),E-cadherin蛋白相对表达量(0.44±0.04、0.76±0.05、0.89±0.08)依次增高(P0.05)。结论 miR-577可能作为抑癌基因,通过阻断Wnt/β-catenin信号通路的活性,降低人源性胶质瘤U87细胞上皮-间质转化活性,从而抑制肿瘤发展。     

分泌性白细胞蛋白酶抑制剂对结肠癌细胞侵袭的影响及机制

目的探讨分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI)对结肠癌细胞侵袭能力的影响及可能分子机制。方法取对数生长期人结肠癌SW480细胞,随机分为SLPI过表达组(转染SLPI过表达质粒pCMV6-SLPI)、空白组(转染空载质粒)、抑制剂组(转染pCMV6-SLPI及特异性Wnt/β-catenin信号通路抑制剂ICG-001);转染后培养24 h,采用流式细胞术检测3组SLPI阳性细胞率,采用Transwell小室法检测3组细胞侵袭能力,Western bolt法检测β-catenin、T细胞因子-4(T cell factor-4, TCF-4)蛋白相对表达量,ELISA法检测基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7, MMP-7)水平。结果转染后培养24 h,SLPI过表达组、抑制剂组SLPI阳性细胞率[(94.98±1.71)%、(93.88±2.43)%]均高于空白组[(25.70±2.39)%](P0.05),SLPI过表达组与抑制剂组比较差异无统计学意义(P0.05);SLPI过表达组侵袭细胞数[(133.75±14.85)个]高于空白组[(107.75±7.54)个]、抑制剂组[(46.13±6.81)个](P0.05),空白组高于抑制剂组(P0.05);转染后培养24 h,SLPI过表达组β-catenin相对表达量(0.90±0.22)、TCF-4相对表达量(0.81±0.25)及MMP-7[(1 716.29±459.82)ng/L]水平均高于空白组[0.51±0.06、0.50±0.04、(1 386.07±542.53)ng/L]、抑制剂组[0.25±0.02、0.18±0.02、(174.96±55.57)ng/L](P0.05),且空白组高于抑制剂组(P0.05)。结论 SLPI通过活化Wnt/β-catenin通路促进MMP-7表达,增强结肠癌细胞侵袭能力。     

miR-326靶向MAPK/MEK信号通路抑制食管鳞状细胞癌恶性生物学行为

目的探讨miR-326靶向MAPK/MEK信号通路对食管鳞状细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。方法 20例食管鳞状细胞癌患者,取手术切除食管癌组织和癌旁正常组织,采用实时荧光定量PCR法检测miR-326mRNA和MAPK mRNA相对表达量,采用免疫组织化学法检测MAPK蛋白表达。3种食管癌细胞系(KYSE150、EC9706、TE-9)和人正常食管上皮细胞系Het-1A,采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-326 mRNA和MAPK mRNA相对表达量,Western blot法检测细胞MAPK蛋白相对表达量。将对数生长期EC9706细胞随机分为miR-326组、转染对照组和空白对照组,miR-326组和转染对照组分别转染miR-326 mimic和mimic NC,空白对照组细胞不作任何处理,采用Western blot法检测细胞MAPK、p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量,克隆形成试验检测细胞克隆形成率,划痕试验检测细胞划痕闭合率,Transwell小室试验检测细胞侵袭,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,荧光素酶活性检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。结果食管癌组织miR-326 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织(P0.05),MAPK mRNA相对表达量高于癌旁正常组织(P0.05)。KYSE150、EC9706和TE-9细胞miR-326 mRNA相对表达量均低于Het-1A细胞(P0.05),MAPK mRNA和MAPK蛋白相对表达量高于Het-1A细胞(P0.05),且EC9706细胞MAPK蛋白相对表达量最高。miR-326组细胞MAPK 3'UTR WT荧光素酶活性(0.53±0.05)明显低于转染对照组(1.22±0.14)(P0.05),MAPK 3'UTR MUT荧光素酶活性(0.86±0.06)与转染对照组(0.91±0.11)比较差异无统计学意义(P0.05)。miR-326组细胞MAPK蛋白相对表达量(0.32±0.15)低于转染对照组(0.88±0.07)和空白对照组(0.91±0.06)(P0.05),细胞克隆形成率[(21.30±0.55)%]、划痕闭合率[(29.47±4.12)%]和侵袭细胞数[(113.86±3.15)个]低于转染对照组[(75.43±0.81)%、(80.52±2.51)%、(427.27±4.25)个]和空白对照组[(79.13±0.65)%、(83.44±1.87)%、(468.10±3.38)个](P0.05),G_0/G_1期细胞比率[(63.15±1.20)%]和细胞凋亡率[(18.54±0.60)%]高于转染对照组[(41.18±0.60)%、(5.28±1.30)%]和空白对照组[(45.11±0.80)%、(4.13±0.90)%],S期和G_2/M期细胞比率及p-MEK、p-ERK1、p-ERK2和p-C-Jun蛋白相对表达量低于转染对照组和空白对照组(P0.05),转染对照组与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论 miR-326靶向抑制MAPK/MEK信号通路的激活,影响食管鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡。     

慢病毒介导的Cullin3沉默对人胶质瘤细胞的影响

目的:探讨慢病毒介导特异性短发夹RNA(sh RNA)干扰Cullin3表达对人胶质瘤细胞的影响。方法:RT-q PCR及Western blot检测Cullin3在人胶质瘤细胞系SW1783,U251及U87MG中的表达;构建靶向Cullin3的sh RNA重组慢病毒,转染U251和U87MG细胞并测定转染效率。实验分为3组:Blank组(阴性对照组)、NC-sh RNA组(空载慢病毒组)及Cullin3-sh RNA组(慢病毒介导Cullin组)。MTT法和Brd U实验检测细胞活力和增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞周期的变化。结果:与正常人星形胶质细胞相比,Cullin3在人胶质瘤细胞系SW1783,U251及U87MG中高表达。Cullin3-sh RNA转染U251和U87MG细胞后,与Blank组及NC-sh RNA组相比,Cullin3-sh RNA组Cullin3表达水平下降(P<0.05),细胞活力和细胞增殖能力显著降低,侵袭能力下降,细胞周期被阻滞于G0/G1期。结论:Cullin3在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,提示Cullin3有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。     

敲低lncRNA DILC对胶质瘤细胞体外生物学特性的影响

目的探讨敲低长链非编码RNA(lncRNA)对胶质瘤细胞体外生物学特性的影响。方法胶质瘤细胞系LN382、U87MG分别分组为NC组和敲低组,其中NC组以negative siRNA转染,敲低组以DILC siRNA转染。转染前和转染后48 h,PCR检测IL-6、JAK2、STAT3表达水平,ELISA法检测离心细胞上清液中IL-6水平,Western Blot法检测p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白质表达水平。细胞转染后48 h,Transwell小室侵袭实验观察细胞的侵袭能力,划痕实验观察细胞的转移能力状况。结果细胞转染后48 h,与LN382、U87MG胶质瘤细胞的NC组比较,其相应敲低组的穿膜细胞数增加,细胞迁移距离亦增加(P<0.05)。与LN382、U87MG胶质瘤细胞的NC组比较,其相应敲低组的IL-6、JAK2、STAT3的mRNA相对表达量升高,细胞上清液中IL-6水平升高,p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白质表达水平亦相应升高(P<0.05)。结论敲低lncRNA DILC可促进胶质瘤细胞的侵袭转移,而激活IL-6/JAK2/STAT3信号通路可能为其作用机制。     

miR-200b对胶质瘤细胞的扩增和浸润的影响分析

目的 探究miR-200b对胶质瘤病理组织细胞扩增和浸润的影响。方法 培养人胶质瘤细胞，将所培养的细胞分为空白组和抑制组，空白组不做干预，抑制组转染miR-200b质粒，对两组细胞的侵袭能力、迁移能力、凋亡情况进行检测、比较。结果 Transwell实验显示，miR-200b质粒转染后U251与U87细胞计数均低于空白组（P<0.05）；细胞划痕实验显示，miR-200b质粒转染后U251与U87细胞其细胞划痕迁移距离更短；在U251细胞中，空白组、抑制组细胞的凋亡率分别为25.6±5.19、39.5±8.15；在U87细胞中，空白组、抑制组细胞的凋亡率分别为15.6±3.82、31.8±5.79。结论 miR-200b对于胶质瘤细胞的增殖、浸润有抑制作用，并能显著促进其凋亡。     

沉默p21活化激酶1表达对人黑素瘤A375细胞凋亡及侵袭能力的影响

目的探讨shRNA沉默p21活化激酶1(p21-activated kinase 1, PAK1)基因表达对人黑素瘤A375细胞凋亡、迁移及侵袭能力的影响。方法对数生长期人黑素瘤A375细胞随机分为转染组(转染PAK1特异性shRNA)、阴性对照组(转染NC-shRNA)、空白对照组(不进行转染)。转染后培养72 h,采用实时荧光定量PCR法检测A375细胞PAK1 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测A375细胞PAK1及p-PAK1蛋白相对表达量,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,采用Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力。结果转染后培养72 h,转染组PAK1 mRNA相对表达量(0.45±0.07)、PAK1蛋白相对表达量(0.53±0.01)、p-PAK1蛋白相对表达量(0.21±0.03)均低于阴性对照组(0.98±0.04、0.65±0.02、0.38±0.04)、空白对照组(1.00±0.08、0.67±0.51、0.36±0.02)(P0.05),细胞凋亡率[(11.20±0.21)%]高于阴性对照组[(5.86±0.51)%]、空白对照组[(5.43±0.03)%](P0.05),迁移细胞数[(47.00±2.23)个]、侵袭细胞数[(30.00±4.44)个]较阴性对照组[(76.00±4.85)、(54.00±3.67)个]、空白对照组[(77.90±4.97)、(56.00±4.12)个]少(P0.05),阴性对照组上述各指标与空白对照组比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论沉默PAK1基因表达可促进人黑素瘤A375细胞凋亡,降低其迁移及侵袭能力。     

营养缺乏自噬因子1对人脑胶质瘤U251细胞增殖侵袭能力的影响

目的探讨营养缺乏自噬因子1对人脑胶质瘤U251细胞增殖侵袭能力的影响。方法复苏培养人脑胶质瘤U251细胞,建立转染小干扰RNA(siRNA)的NAF1组(si-NAF1组)、阴性对照组(si-NC组)、未转染siRNA对照组(control组),采用CCK-8实验检测细胞增殖能力、平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力、细胞划痕实验检测各组细胞迁移能力、Transwell法观察各组细胞侵袭能力变化。结果与control组比较,NAF1-siRNA干预U251细胞后,si-NAF1组NAF1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P均<0.05),其增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达水平降低,细胞增殖能力下降,克隆形成能力明显减弱,迁移能力明显降低,穿过Transwell膜的细胞数量明显减少(P均<0.05)。si-NC组与control组各项结果比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论转染siRNA后NAF1表达下降,进而下调PCNA水平,抑制人脑胶质瘤U251细胞的增殖能力;同时MMP-9蛋白表达水平下降,抑制U251细胞的迁移和侵袭能力。     

MicroRNA-664对人脑胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的探究microRNA-664(miR-664)对人脑胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法采用Lipofectamine 2000脂质体法将miR-664模拟剂(miR-664 mimics)、miR-664抑制剂(miR-664 inhibitor)转染至人脑胶质瘤细胞U251中,并设置相应对照组(miR-NC、anti-NC);采用qRT-PCR检测各组细胞中miR-664的表达,MTT法检测各组细胞增殖情况,划痕实验及Tanswell小室法检测各组细胞迁移、侵袭能力,Western blotting法检测各组细胞中核蛋白(Ki67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及MMP-9的表达。结果与miR-NC相比,转染miR-664 mimics后明显上调U251细胞中miR-664的表达,并促进U251细胞增殖、迁移和侵袭能力,并显著上调细胞中Ki67、PCNA、MMP-2及MMP-9的表达(P 0. 05);与anti-NC相比,转染miR-664 inhibitor后明显下调U251细胞中miR-664的表达,并抑制U251细胞增殖、迁移和侵袭能力,并显著下调细胞中Ki67、PCNA、MMP-2及MMP-9的表达(P 0. 05)。结论 miR-664可能通过上调Ki67、PCNA、MMP-2及MMP-9的表达,促进人脑胶质瘤细胞U251细胞的增殖、迁移和侵袭,可作为潜在的肿瘤标志物。     

长链非编码RNA HOTAIR靶向miR-1对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响

目的探究长链非编码RNA (Long non-coding RNA,LncRNA)HOTAIR对胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移能力的作用及机制。方法 RT-PCR检测胶质瘤细胞株U87、U251、U118和LN18中HOTAIR的表达水平和shRNA HOTAIR (sh-HOTAIR)转染U251细胞细胞后HOTAIR和miR-1的表达水平。生物信息预测HOTAIR和miR-1的靶向关系,荧光素酶报告实验验证两者靶向关系。将细胞分为Control、sh-HOTAIR、miR-1inhibitor和sh-HOTAIR+inhibitor组,用sh-HOTAIR和miR-1inhibitor分别或同时转染细胞,CCK8检测各组细胞活性,流式检测细胞凋亡,Transwell和划痕实验分别检测细胞侵袭和迁移能力,免疫印迹检测Ki67、Bcl-2、Bax、基质金属蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和MMP-9的表达。结果 HOTAIR在U251细胞中表达水平最高,因此选择U251细胞进行后续实验;sh-HOTAIR能显著降低U251细胞HOTAIR的表达水平,升高miR-1的表达水平;miR-1mimic能显著降低HOTAIR野生质粒的荧光素酶活性;与Control组比较,sh-HOTAIR组细胞增殖速度、Ki67和Bcl-2表达水平明显降低,细胞凋亡水平和Bax表达水平明显升高;sh-HOTAIR组比较,sh-HOTAIR+inhibitor组细胞增殖速度、Ki67和Bcl-2表达水平明显升高,细胞凋亡水平和Bax表达水平明显降低;同时,sh-HOTAIR组侵袭细胞数与Control组比较明显减少,划痕闭合率明显降低;sh-HOTAIR+inhibitor侵袭细胞与sh-HOTAIR比较显著增多,划痕闭合率明显升高;此外,sh-HOTAIR能显著降低MMP-2和MMP-9的蛋白表达水平,miR-1inhibitor能显著减弱sh-HOTAIR对MMP-2和MMP-9表达的抑制作用。结论 HOTAIR能通过靶向抑制miR-1的表达促进胶质瘤U251细胞增殖、侵袭和迁移。     

DLC-3表达对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响

目的探讨外源性过表达DLC-3对乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移及凋亡活动的影响。方法对数生长期乳腺癌MCF-7细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组,实验组细胞转染DLC-3基因过表达质粒,阴性对照组细胞转染空白质粒,空白对照组细胞仅进行换液处理。3组采用实时PCR法检测细胞DLC-3 mRNA相对表达量;转染12、24 h后,采用细胞划痕实验检测细胞划痕愈合率;转染48 h后,采用CCK-8实验检测细胞增殖率,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果实验组DLC-3 mRNA相对表达量(17 563.57±2 880.85)高于空白对照组(0.56±0.43)和阴性对照组(1.00±0.00)(P0.05),空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染48 h后,实验组细胞增殖率[(31.47±5.57)%]低于阴性对照组[(36.27±3.71)%]和空白对照组[(37.90±5.70)%],但差异无统计学意义(P0.05);转染12、24 h后,实验组划痕愈合率[(32.769±4.349)%、(38.237±4.286)%]低于空白对照组[(37.506±1.836)%、(49.052±4.090)%](P0.05),阴性对照组[(35.659±3.970)%、(48.724±5.092)%]与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05);转染48 h后,实验组细胞凋亡率[(15.893±1.597)%]高于阴性对照组[(10.277±1.947)%]和空白对照组[(11.973±1.564)%](P0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论提高MCF-7细胞中DLC-3表达可降低细胞增殖水平,抑制其迁移能力,并促进细胞凋亡。     

卵泡抑素样蛋白5对HCCLM3细胞迁移和侵袭的影响

目的探讨卵泡抑素样蛋白5(follistatin-like 5,FSTL5)在不同肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞株中的表达及在HCCLM3细胞迁移、侵袭中的作用。方法取对数生长期HCC细胞(SMMC-7721、HepG2、HCCLM3、MHCC97H、PLC)和永生化正常肝上皮细胞LO2,采用实时荧光定量PCR法检测FSTL5mRNA相对表达量。将对数生长期HCCLM3细胞随机分为转染组和对照组,转染组转染FSTL5的表达质粒,对照组转染空白质粒;转染24h,采用实时荧光定量PCR法检测2组HCCLM3细胞FSTL5mRNA相对表达量,划痕愈合试验检测HCCLM3细胞迁移能力,Transwell小室法检测HCCLM3细胞侵袭能力,三维培养实验检测HCCLM3细胞伪足生长情况。结果FSTL5mRNA相对表达量在SMMC-7721(0.37±0.03)、HepG2(0.43±0.03)、HCCLM3(0.19±0.02)、MHCC97H(0.28±0.02)、PLC细胞(0.35±0.01)均低于LO2细胞(1.04±0.04)(P0.05),且在HCCLM3细胞表达量最低(P0.05);转染24h,转染组HCCLM3细胞FSTL5mRNA相对表达量(12.04±1.42)明显高于对照组(1.00±0.25)(P0.05),划痕愈合率[(24.7±2.4)%]、侵袭细胞数目[(11.7±2.3)%]均明显低于对照组[(86.7±3.7)%、(34.7±5.9)%](P0.05);三维培养实验结果显示,转染组HCCLM3细胞克隆球未见伪足生成,对照组可见少量伪足生成且延展性较好。结论 HCC细胞(SMMC-7721、HepG2、HCCLM3、MHCC97H、PLC)中FSTL5表达明显降低,过表达FSTL5可抑制HCCLM3细胞迁移和侵袭。     

神经突触核蛋白-γ质粒转染胶质瘤细胞及其过表达对紫杉醇耐药性的影响

目的探讨胶质瘤细胞U87中神经突触核蛋白-γ(synuclein-γ,SNGG)过度表达对紫杉醇耐药的影响。方法 U87/SNCG组采用pIRES2-EGFP-SNCG真核表达载体转染U87胶质瘤细胞,构建稳定转染SNCG的U87/SNCG细胞系,U87/neo对照组采用pIRES2-EGFP空载质粒转染U87胶质瘤细胞,构建U87/neo细胞系。采用G418选择培养稳定转染的U87/neo和U87/SNCG细胞系,采用反转录实时定量聚合酶链反应和免疫荧光染色技术鉴定成功后,2组分别于紫杉醇作用6、12、18、24h时检测细胞增殖抑制率,采用流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡细胞比例,采用免疫荧光染色法观察细胞形态学变化。结果成功构建U87/SNCG细胞系;U87/SNCG组SNCG mRNA表达较U87/neo对照组上调9.06倍;紫杉醇作用24h时,U87U/SNCG组细胞增殖抑制率[(25.49±2.44)%]和凋亡细胞比例[(7.02±0.26)%]明显低于U87/neo对照组[(34.36±2.95)%、(14.93±1.53)%](P<0.05);紫杉醇作用6h时,U87/SNCG组细胞G2/M期比例[(22.87±0.60)%]低于U87/neo对照组[(26.75±2.70)%](P<0.01);随着紫杉醇作用时间延长,与U87/SNCG组比较,U87/neo对照组细胞总数减少,细胞散落浮于培养液中,出现透明空泡、崩解细胞,并可见大量核固缩、核碎裂之凋亡现象。结论 SNCG过表达可降低抗微管药物诱导的U87细胞有丝分裂期阻滞,增强胶质瘤细胞的增殖能力和抗凋亡能力。     

重组腺病毒p53 上调凋亡调控因子通过凋亡通路增强胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性的体外研究

目的 探讨转染p53 上调凋亡调控因子(PUMA)的人脑胶质瘤细胞对替莫唑胺敏感性增强的作用机制.方法 将人脑胶质瘤细胞U87MG 分为正常对照组、空载体组和实验组进行培养,分别将感染复数(MOI) ＝50 的空载体腺病毒(Ad-△ BH3)和携带PUMA 的重组腺病毒(Ad-PUMA)转染U87MG 细胞,转染后用MTT 比色法测定各组细胞的存活率并计算替莫唑胺(TMZ)IC50,流式细胞仪检测细胞周期的变化,应用TUNEL 法检测细胞的凋亡情况.Western blot 检测凋亡相关蛋白p53、Bax 的表达.结果 外源性PUMA 基因在Ad-PUMA 转染U87MG 48 h 后,随着时间延长,PUMA 表达使U87MG 细胞的增殖能力降低并诱导凋亡,转染24 h、48 h、72 h 的生长抑制率分别为17.3%、35.6%、43.3%,凋亡率分别为20.3%、31.4%、45.4%.正常对照组、Ad-PUMA、Ad-△BH3 组细胞的TMZ IC50分别为(15.0 ±1.9)μmol/L、(2.3 ±0.1)μmol/L 和(14.4 ±1.6)μmol/L.PUMA 表达的U87MG 细胞DNA 合成受到抑制,周期阻滞在G2 期;Western blot 检测显示p53 表达在各组中差异无统计学意义(P ＞0.05)、PUMA 和Bax 在实验组中表达较对照组强,差异有统计学意义(P ＜0.01).结论 Ad-PU-MA 转染可有效增强人脑胶质瘤细胞U87MG 对TMZ 的敏感性,抑制人脑胶质瘤细胞U87MG 的增殖,通过诱导细胞G2 期阻滞促进其凋亡,促凋亡机制不依赖于p53.     

长链非编码RNA CCAT1调控MAPK信号通路对于胶质瘤细胞的影响

目的探讨长链非编码RNA CCAT1表达对人胶质瘤细胞U251增殖、侵袭能力的影响及其作用机制。方法选取人胶质瘤细胞U251进行转染实验,分为空白组、sh-NC组和sh-CCAT1组;利用实时荧光定量qRT-PCR检测抑制效果;采用MMT、Transwell试验检测下调CCAT1对于胶质瘤细胞增殖、侵袭能力的影响;利用Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关分子的表达变化。结果在转染48h后,sh-CCAT1组CCAT1的表达较NC组和sh-NC组显著降低(P0.05);CCAT1下调后,胶质瘤细胞U251的增殖、侵袭能力显著下降(P0.05),蛋白表达检测表明,CCAT1下调显著抑制MAPK信号通路分子的表达。结论 CCAT1可能通过MAPK通路抑制胶质瘤的增殖和侵袭。     

miR-153-3p调控神经突的生长

目的探讨miR-153-3p在大、小鼠神经突生长中的作用。方法对数生长期C57BL/6小鼠N2A细胞和Rattus norvegicus大鼠PC12细胞,随机分为miR-153-3p过表达组(转染miR-153-3p过表达试剂miR-153-3p mimic)、miR-153-3p抑制组(转染miR-153-3p表达抑制剂miR-153-3p inhibitor)、过表达对照组(转染miR-153-3p mimic空白对照试剂miR-153-3p mimic NC)、抑制剂对照组(转染miR-153-3p inhibitor空白对照试剂miR-153-3p inhibitor NC)。转染48 h,采用实时荧光定量PCR法检测4组细胞miR-153-3p mRNA相对表达量,免疫荧光法检测神经突生长情况。结果 miR-153-3p过表达组N2A细胞、PC12细胞miR-153-3p mRNA相对表达量(28.98±1.63、19.67±0.88)均高于miR-153-3p抑制组(0.94±0.19、0.89±0.05)、过表达对照组(0.99±0.08、1.00±0.09)、抑制剂对照组(1.00±0.04、1.00±0.14)(P0.05),miR-153-3p抑制组、过表达对照组、抑制剂对照组比较差异均无统计学意义(P0.05);miR-153-3p过表达组N2A细胞、PC12细胞神经突总长度[(31.13±3.85)、(38.08±2.12)μm]和最长神经轴突长度[(18.04±2.58)、17.48±1.75)μm]均较miR-153-3p抑制组[N2A细胞:(54.53±1.83)、(31.74±2.36)μm;PC12细胞:(64.46±12.85)、(29.46±7.36)μm]、过表达对照组[N2A细胞:(42.53±6.29)、(24.99±3.47)μm;PC12细胞:(53.58±4.88)、(25.31±3.66)μm]、抑制剂对照组[N2A细胞:(41.33±2.77)、(24.57±3.86)μm;PC12细胞:(44.44±7.59)、(23.04±4.31)μm]短(P0.05),且过表达对照组、抑制剂对照组PC12细胞、N2A细胞神经突总长度和最长神经轴突长度较miR-153-3p抑制组短(P0.05),过表达对照组、抑制剂对照组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论miR-153-3p可抑制小鼠N2A细胞、大鼠PC12细胞神经突生长。     

非小细胞肺癌患者血浆miR-451表达及对HCC827细胞生物学性质和放疗敏感性的影响

目的探讨miR-451在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者血浆中的表达及其对NSCLC细胞生物学性质及放疗敏感性的影响。方法 NSCLC患者69例为观察组,同期体检健康者53例为对照组,采用实时荧光定量PCR法检测2组血浆miR-451 mRNA相对表达量。将人NSCLC细胞株HCC827随机分为空白对照组、miR-451组和慢病毒组,空白对照组不作处理,miR-451组和慢病毒组分别转染包含miR-451、无意义核苷酸序列慢病毒;转染24、48、72 h,采用MTT法检测细胞增殖;转染72 h,采用Transwell小室试验检测细胞侵袭,采用划痕试验检测细胞迁移距离。再将3组细胞分为0、3、6、9 Gy 4个亚组,分别接受相应剂量的X线照射,采用MTT法检测细胞增殖和细胞存活。结果观察组血浆miR-451相对表达量(1.72±0.39)低于对照组(2.16±0.31)(P0.05)。miR-451组细胞miR-451相对表达量(4.17±0.82)高于空白对照组(1.32±0.37)和慢病毒组(1.26±0.33)(P0.05),空白对照组与慢病毒组比较差异无统计学意义(P0.05);转染24、48、72 h,miR-451组细胞增殖率均低于空白对照组和慢病毒组(P0.05);转染72 h,miR-451组侵袭细胞数[(123.7±26.4)个]较空白对照组[(247.6±39.7)个]和慢病毒组[(254.5±38.2)个]少,细胞迁移距离[(45.2±8.8)μm]较空白对照组[(73.2±11.7)μm]和慢病毒组[(68.9±10.4)μm]近(P0.05),空白对照组与慢病毒组比较差异无统计学意义(P0.05);miR-451组细胞在0、3、6、9 Gy剂量X线照射后的细胞增殖率和细胞存活率均低于空白对照组和慢病毒组(P0.05),空白对照组与慢病毒组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 miR-451在NSCLC患者血浆呈低表达;miR-451可抑制HCC827细胞增殖、侵袭与迁移,上调HCC927细胞对放疗的敏感性。     

磷酸酶及张力蛋白同源物基因对三阴性乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨上调磷酸酶及张力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromsometen,PTEN)基因表达对三阴性乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响及其作用机制。方法对数期人三阴性乳腺癌ZR-75-细胞株随机分为PTEN组、突变型PTEN(mutated PTEN,M-PTEN)组和对照组,PTEN组、M-PTEN组分别转染人野生型PTEN真核表达质粒(pBP-PTEN)、突变型PTEN质粒(pBP-M-PTEN),对照组未作处理。转染后24、48、72h,MTT法检测3组ZR-75-1细胞生长抑制率,转染后72h,Transwell法检测3组侵袭细胞比率,流式细胞仪检测细胞周期,Western blot法检测磷酸化局部黏着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase,P-FAK)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,P-Akt)表达水平。结果 PTEN组PTEN蛋白相对表达量(8.49±2.92)高于M-PTEN组(0.77±0.24)(P<0.05),对照组无PTEN蛋白表达;转染后24、48、72h,PTEN组细胞生长抑制率[(27.33±21.49)%、(37.20±11.48)%、(48.11±8.14)%]均高于M-PTEN组[(5.98±1.44)%、(6.98±2.84)%、(10.83±3.11)%]和对照组[(1.09±0.33)%、(2.10±0.83)%、(4.20±2.71)%](P<0.05),M-PTEN组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);转染后72h,PTEN组侵袭细胞数目[(24.29±5.82)%]低于M-PTEN组[(56.30±11.84)%]和对照组[(89.29±10.49)%](P<0.05),M-PTEN组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);PTEN组G1期细胞比率[(54.89±2.67)%]低于M-PTEN组[(57.02±1.33)%]和对照组[(63.98±1.09)%],S期细胞比率[(36.56±2.10)%]高于M-PTEN组[(35.98±2.67)%]和对照组[(30.78±0.99)%](P<0.05),G2/G1期细胞比率[(1.85±0.33)%]与M-PTEN组[(1.90±1.10)%]和对照组[(1.91±1.00)%]比较差异均无统计学意义(P>0.05),M-PTEN组G1、S、G2/G1细胞比率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);PTEN组P-FAK蛋白相对表达水平(0.75±0.12)低于M-PTEN组(2.19±0.82)与对照组(3.23±0.62)(P<0.05),P-Akt蛋白相对表达(2.11±0.42)与M-PTEN组(1.83±0.74)和对照组(1.94±0.53)比较差异均无统计学意义(P>0.05);M-PTEN组P-FAK、P-Akt蛋白相对表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PTEN抑癌基因可通过抑制乳腺癌细胞FAK磷酸化,抑制肿瘤细胞复制,进而抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭。     

N-myc下游调节基因2在子宫内膜癌组织中表达及意义

目的探讨N-myc下游调节基因2(N-myc downstream-regulatedgene 2,NDRG2)在子宫内膜癌组织中的表达,及对肿瘤细胞增殖、侵袭的影响。方法行根治性切除术子宫内膜癌患者77例,手术切除的肿瘤组织为子宫内膜癌组,癌旁正常组织为癌旁组,采用实时荧光定量PCR法检测2组NDRG2基因表达,并分析其表达与临床病理特征的关系。将对数生长期子宫内膜癌HEC-1A细胞随机分为NDRG2抑制组(转染NDRG2干扰序列)、NDRG2正常表达组(转染NDRG2干扰对照序列)、空白对照组(不作任何处理),采用实时荧光定量PCR法检测3组转染48 h NDRG2基因表达,CCK-8法检测3组转染48、96 h增殖活力,划痕试验检测3组转染后培养12、24 h迁移能力,Transwell小室法检测3组转染48 h侵袭能力。结果子宫内膜癌组NDRG2 mRNA相对表达量(1.30±0.11)低于癌旁组(1.95±0.15)(P<0.05);FIGO分期Ⅱ~Ⅳ期、中低分化、有淋巴结转移者NDRG2 mRNA相对表达量(1.16±0.07、1.14±0.10、1.24±0.07)低于FIGO分期Ⅰ期、高分化、无淋巴结转移者(1.52±0.13、1.56±0.17、1.48±0.12)(P<0.05);转染48 h,NDRG2抑制组NDRG2 mRNA相对表达量(0.48±0.11)低于NDRG2正常表达组(1.07±0.08)、空白对照组(1.09±0.16);转染48、96 h,NDRG2抑制组增殖活力吸光度(optical density,OD)值(0.47±0.06、0.76±0.03)高于NDRG2正常表达组(0.33±0.07、0.58±0.03)、空白对照组(0.36±0.08、0.61±0.02)(P<0.05);NDRG2正常表达组、空白对照组转染48 h,NDRG2 mRNA相对表达量及转染48、96 h增殖活力OD值比较差异均无统计学意义(P>0.05);NDRG2抑制组转染后培养12、24 h划痕愈合率[(14.32±2.17)%、(34.28±4.95)%]及侵袭细胞数[(122.91±8.87)个]均高于NDRG2正常表达组[(7.14±1.52)%、(12.73±3.02)%、(104.21±2.94)个]、空白对照组[(6.82±1.24)%、(11.64±2.86)%、(99.71±5.40)个](P<0.05),NDRG2正常表达组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论NDRG2在子宫内膜癌组织中呈低表达,下调NDRG2基因表达可促进子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、迁移和侵袭。