槲皮素联合顺铂调控PI3K/Akt信号通路对肺癌A549/DDP细胞增殖与凋亡的影响

目的 研究槲皮素联合顺铂对肺癌A549/DDP细胞增殖与凋亡的影响,并探讨磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路的作用机制.方法 将对数生长期人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP分为槲皮素+顺铂组(给予160μmol/L浓度的槲皮素和25μmol/L浓度的顺铂)、顺铂组(给予25μm...     

从耐顺铂肺腺癌A549/DDP细胞系分离和鉴定肺癌干细胞的研究

目的从耐顺铂肺腺癌A549/DDP细胞系中分离侧群细胞(SP)以观察其是否富含肺癌干细胞(CSCs)样细胞,以期为肺癌CSCs样细胞生物学研究和干预建立基础。方法将A549/DDP细胞经过流式细胞术分选获得SP细胞并检测纯度,经过体外克隆形成试验检验其体外克隆形成能力。通过比较接种A549/DDP SP细胞和A549/DDP non-SP细胞的NOD/SCID鼠成瘤和肿瘤生长情况,观察其体内成瘤能力。结果流式细胞分析发现A549/DDP细胞中存在10%～17%的SP细胞。分离获得的SP细胞纯度>95%(平均97%)。SP细胞的体外克隆形成能力和non-SP细胞相比有统计学差异(克隆形成率的对数,即lgCFE:1.544±0.150vs.0.301±0.082,P<0.05)。接种A549/DDP SP细胞的NOD/SCID鼠的成瘤率较对照组存在明显差异。接种SP细胞的小鼠只需要5×103个SP细胞便足以成瘤,而接种non-SP细胞的小鼠却需要超过5×106个non-SP细胞才能在体内成瘤。A549/DDP SP成瘤能力是non-SP细胞成瘤能力的1000倍。结论耐顺铂肺腺癌A549/DDP细胞系中分离的SP细胞比例高且富含肺癌CSCs样细胞,可以用于肺癌CSCs样细胞生物学和干预治疗的研究。     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷联合SAHA对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/DDP的逆转作用及其机制

目的:探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对耐顺铂(DDP)的人肺腺癌细胞系A549/DDP的逆转作用及其可能的机制.方法:以A549、A549/DDP细胞为研究对象,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选出5-Aza-CdR和SAHA对A549/DDP细胞的无毒浓度(即对细胞抑制率＜10％的药物浓度),并检测出顺铂与无毒浓度5-Aza-CdR和(或)SAHA联合对耐药细胞株的半数抑制浓度(IC50)和耐药指数;采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测48 h后各组细胞耐药相关基因MDR1、LRP mRNA的表达;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况.结果:5-Aza-CdR和SAHA对A549/DDP细胞的无毒浓度分别为5μmol/L和1μmol/L,两者均可使A549/DDP细胞对顺铂的IC50值下降,单独或联合应用时逆转倍数分别为1.6、1.8和4.6倍;经5-Aza-CdR和SAHA处理后各组细胞MDR1、LRP mRNA表达均明显减弱,凋亡明显增强,且两者联合具有协同作用(均P＜0.05).结论:5-Aza-CdR和SAHA可以逆转A549/DDP细胞的DDP耐药,且两者联合具有协同作用,其作用机制可能与下调耐药相关基因MDR1、LRPmRNA的表达,减弱肺癌细胞对化疗药物的外排作用有关.     

miR-25抑制剂对肺腺癌细胞A549/DDP作用的初步研究

目的研究mi R-25抑制剂对耐顺铂A549/DDP细胞增殖、凋亡和顺铂耐药性的影响及可能机制的探讨。方法培养人肺腺癌A549及耐顺铂A549/DDP细胞株,检测顺铂对两个细胞株的半数耐药浓度(IC50);转染mi R-25抑制剂至A549/DDP细胞内,提取细胞总RNA,并以q PCR法评估mi R-25抑制剂的转染效果;抑制剂转染A549/DDP细胞后,以CCK8法分别在转染24 h、48 h、72 h时测定转染组、阴性对照组及无处理组细胞的增殖抑制率,并以流式细胞仪检测转染mi R-25抑制剂72 h后三组细胞的凋亡率;设置转染抑制剂组及阴性对照组,以CCK8法检测顺铂作用于两组细胞的IC50;以细胞爬片免疫细胞化学及数字化病理扫描系统分析PTEN蛋白在转染抑制剂前后的表达情况。结果 A549细胞株的IC50为0.591μg/ml,95%可信区间为0.436~0.753μg/ml;A549/DDP细胞的IC50为9.040μg/ml,95%可信区间6.504~14.783μg/ml,A549/DDP的IC50约为A549的15.29倍;与阴性对照组及无处理组相比,转染mi R-25抑制剂的A549/DDP细胞内mi R-25含量明显下降,其增殖受到明显抑制,凋亡率明显提高,且顺铂对转染抑制剂的A549/DDP细胞的增殖抑制作用也明显提高,其IC50下降,A549/DDP细胞的耐药倍数有所逆转;细胞爬片免疫组化及表达阳性灰度值分析:抑制剂组的灰度值为139.7±2.52,阴性对照组的灰度值为194±4.58,与阴性对照组比较,抑制剂组的A549/DDP的PTEN蛋白表达得到了明显提高(P<0.05)。结论 mi R-25的特异性抑制剂能够明显降低肺腺癌细胞的内源性mi R-25的表达;抑制其增殖活力,增加其凋亡率,当与顺铂联合使用时,它可以提高肺腺癌细胞的对顺铂的敏感性,逆转其耐药倍数,并且上述作用有可能与细胞内PTEN蛋白合成的恢复性升高有关。     

FOXM1表达水平与晚期非小细胞肺癌临床病理特征及靶向药物疗效的关系

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)叉头框转录因子M1(FOXM1)的表达水平及其与临床病理特征、靶向药物疗效之间的关系。方法收集新疆医科大学附属肿瘤医院2011-2014年病理确诊的NSCLC 80例,采用免疫组化方法检测组织中FOMX1的表达水平,并结合临床病理特征、靶向药物疗效进行分析。结果 FOMX1表达的阳性率为41.25%。不同年龄、性别、分期及吸烟史的NSCLC患者FOXM1蛋白的表达差异无统计学意义(P0.05)。不同分化程度、淋巴结转移状态的NSCLC患者FOXM1蛋白的表达差异有统计学意义(P0.05)。FOXM1蛋白表达阳性的患者使用靶向药物的无进展生存时间较FOXM1蛋白表达阴性患者短(P0.05)。结论 FOXM1的表达与病理分化程度及淋巴结转移有关,FOXM1表达阳性的患者使用靶向药物的无进展生存时间较表达阴性的患者短。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷联合SAHA对耐顺铂人肺腺癌细胞系A549/DDP的逆转作用及其机制

目的:探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对耐顺铂(DDP)的人肺腺癌细胞系A549/DDP的逆转作用及其可能的机制。方法:以A549、A549/DDP细胞为研究对象,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选出5-Aza-CdR和SAHA对A549/DDP细胞的无毒浓度(即对细胞抑制率<10%的药物浓度),并检测出顺铂与无毒浓度5-Aza-CdR和(或)SAHA联合对耐药细胞株的半数抑制浓度(IC50)和耐药指数;采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测48h后各组细胞耐药相关基因MDRl、LRP mRNA的表达;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。结果:5-Aza-CdR和SAHA对A549/DDP细胞的无毒浓度分别为5μmol/L和1μmol/L,两者均可使A549/DDP细胞对顺铂的IC50值下降,单独或联合应用时逆转倍数分别为1.6、1.8和4.6倍;经5-Aza-CdR和SAHA处理后各组细胞MDRl、LRP mRNA表达均明显减弱,凋亡明显增强,且两者联合具有协同作用(均P<0.05)。结论:5-Aza-CdR和SAHA可以逆转A549/DDP细胞的DDP耐药,且两者联合具有协同作用,其作用机制可能与下调耐药相关基因MDR1、LRPmRNA的表达,减弱肺癌细胞对化疗药物的外排作用有关。     

托瑞米芬对人肺腺癌细胞A549/DDP耐顺铂的逆转作用

【目的】研究托瑞米芬对人肺腺癌细胞系A549／DDP耐顺铂的逆转作用,探讨其与多药耐药蛋白表达之间的关系。【方法】以MTT法检测托瑞米芬及与顺铂联合对A549／DDP细胞的细胞毒性作用,以免疫细胞化学法检测A549／DDP细胞MRP的表达情况。【结果】15μmol／L、2．5μmol／L托瑞米芬对A549／DDP细胞的抑制率分别为5．39％、1．43％,与无药对照组比较无显著性差异（P〉0．05）。≥10μmol／L托瑞米芬可抑制A549／DDP细胞生长（P〈0．01）。2．5μmol／L、5μmol／L托瑞米芬可使顺铂对A549／DDP细胞的IC50从1．764μg／ml分别降至1．047μg／ml、0．588μg／ml,逆转A549／DDP细胞对顺铂的耐药（P〈0．01）,逆转倍数分别为1．686、3．001。A549／DDP细胞MRP呈强阳性表达。5μmol／L、2．5μmol／L托瑞米芬与顺铂联用可以下调MRP表达,与无药组及单用顺铂组比较,具有显著性差异（P〈0．01）。【结论】托瑞米芬能抑制A549／DDP细胞增殖和逆转A549／DDP细胞对顺铂的耐药;其耐药逆转可能与下调MRP表达有关。     

姜黄素增强卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP对顺铂敏感性的研究

目的:探讨姜黄素的使用与卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP对顺铂化疗敏感性的关系。方法:采用MTT法和TUNEL法检测姜黄素、顺铂单独和联合作用时对COC1/DDP细胞增殖和凋亡的影响;RT-PCR检测上述各组细胞凋亡相关基因Bcl-2、Smac的表达。结果:顺铂的浓度在1.25～5μg/mL时与姜黄素合用后耐药细胞生存率下降明显(P<0.05),尤以2.5μg/mL顺铂和20μmol/L姜黄素联合作用时,耐药细胞生存率下降最明显;顺铂与姜黄素联合用药与单独用药相比,凋亡率明显增加(P<0.05);联合用药与单独用药相比Bcl-2 mRNA的表达明显降低(P<0.05),Smac mRNA的表达明显增高(P<0.05)。结论:姜黄素能够显著抑制COC1/DDP增殖,并能增强该细胞系对顺铂的敏感性,机制可能与降低Bcl-2基因的表达,增加Smac基因的表达有关。     

利多卡因对肺癌A549细胞增殖、侵袭及AMPK/mTOR/4EBP1信号通路的影响

目的探讨利多卡因对肺癌A549细胞增殖、侵袭及单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)信号通路的影响。方法设肺癌A549细胞组,5-氟尿嘧啶组(50μmol/L),利多卡因低剂量组(100μmol/L)、高剂量组(200μmol/L),以上各组每组设6个平行孔,培养72 h。试验结束后,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法测定细胞增殖水平,transwell小室测定细胞侵袭水平,实时荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法测定细胞AMPK、mTOR、4EBP1 mRNA和蛋白,以及磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化4EBP1(p-4EBP1)蛋白表达水平。结果与肺癌A549细胞组比较,5-氟尿嘧啶组、利多卡因低剂量组、利多卡因高剂量组吸光度值、存活率及mTOR、4EBP1 mRNA和蛋白、p-mTOR蛋白、p-4EBP1蛋白表达水平降低,穿膜数减少(P<0.05),AMPK mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05);与5-氟尿嘧啶组比较,利多卡因低、高剂量组吸光度值、存活率及mTOR、4EBP1 mRNA和蛋白、p-mTOR蛋白、p-4EBP1蛋白表达水平升高,穿膜数增加(P<0.05),AMPK mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05);与利多卡因低剂量组比较,利多卡因高剂量组吸光度值、存活率及mTOR、4EBP1 mRNA和蛋白、p-mTOR蛋白、p-4EBP1蛋白表达水平降低,穿膜数减少(P<0.05),AMPK mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论利多卡因对肺癌A549细胞增殖、侵袭具有明显抑制作用,其机制可能与利多卡因通过激活AMPK表达进而抑制mTOR/4EBP1信号通路的激活有关。     

MiR-1 targets PIK3CA and inhibits tumorigenic properties of A549 cells

MicroRNAs are small endogenous RNAs that play important roles in the pathogenesis of human diseases, including malignancy. MicroRNA-1 (miR-1) is downregulated in non-small cell lung cancer (NSCLC); however, the underlying mechanisms by which it suppresses tumorigenesis in NSCLC are largely unknown. We investigated whether phosphoinositide-3-kinase catalytic subunit alpha (PIK3CA) was a novel target of miR-1 in the NSCLC cell line A549, and the mechanism of miR-1 inhibition of the tumorigenic properties of A549 cells is discussed. The influence of miR-1 on A549 cells was studied by transfection with miR-1 mimics or inhibitor. MiR-1 overexpression led to downregulation of PIK3CA protein, but not mRNA by western blot and quantitative real-time PCR, respectively. The dual-luciferase reporter assay confirmed that miR-1 targeted PIK3CA directly. PIK3CA downregulation by miR-1 mimics led to a significant reduction of phosphorylated Akt and survivin protein, the downstream targets of the PI3 K/Akt pathway. Cell proliferation was studied using a cell counting kit. Migration and invasion were evaluated by Transwell and Matrigel assays, respectively. Cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. The results were that miR-1 upregulation inhibited A549 cell proliferation, migration, and invasion. These findings indicate that miR-1 may play an important role in the pathogenesis of NSCLC by regulating PIK3CA through the PI3 K/Akt pathway. Increasing miR-1 expression may provide a novel approach for NSCLC treatment.     

mPGES-1抑制剂MK886对白血病HL-60/A细胞凋亡及耐药性的影响

为了探讨膜结合型前列腺素E2合酶1(mPGES-1)抑制剂MK886对耐药白血病HL-60/A细胞诱导凋亡的作用及对其耐药性的影响,采用QT-PCR及Western blot法检测HL-60/A细胞mPGES-1的表达,CCK-8法观察药物对HL-60/A细胞增殖的影响,流式细胞术检测细胞凋亡,ELISA法检测PGE2的合成,Western blot法检测Akt、P-Akt表达,并观察低浓度(10μmol/L)MK886对HL-60/A细胞耐药性及多药耐药基因表达的影响。结果表明,HL-60/A细胞高表达mPGES-1,MK886可时间、浓度依赖性地抑制HL-60/A细胞增殖,诱导其凋亡(r=-0.83,P<0.05),同时,mPGES-1表达及PGE2合成减少,P-Akt表达明显下降。低浓度MK886可下调多药耐药基因mdr-1及蛋白P170表达,增强对化疗的敏感性。结论:MK886可抑制耐药白血病HL-60/A细胞增殖,诱导其凋亡,增强其化疗敏感性,其机制与下调mPGES-1/PGE2合成、抑制P-Akt蛋白及多药耐药基因表达有关。     

非小细胞肺癌组织中ERCC1和RRM1表达与抗肿瘤治疗的疗效及预后关系

目的探讨核苷酸还原酶亚单位M1(RRM1)和核苷酸切除修复交叉互补基因l(ERCC1)蛋白在ⅢB和Ⅳ期非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达,及其对重组人血管内皮抑制素(恩度)联合吉西他滨/奈达铂化疗疗效的预测。方法采用免疫组织化学方法检测51例ⅢB～Ⅳ期肺癌患者组织中ERCC1和RRMl的表达水平。经过4周期以上恩度联合吉西他滨/奈达铂方案化疗,分析比较不同ERCCl和RRMl表达水平与NSCLC治疗预后的关系。结果 NSCLC组织中ERCCl的阳性率为4 3.1%,RRMl的阳性率为62.7%。RRMl与ERCC1蛋白表达显著正相关。RRMl和ERCC1表达均为阴性组的有效率为72.2%;二者表达均为阳性组为19.0%;二者表达任一阳性组为58.3%,3组之间比较差异均有统计学意义;ERCC1和RRM1低表达的患者生存期明显长于高表达者。结论 ERCC1和RRM1的表达可作为NSCLC患者恩度联合吉西他滨/奈达铂方案化疗敏感性及其预后判断的指标之一。     

Knockdown of Forkhead box A1 suppresses the tumorigenesis and progression of human colon cancer cells through regulating the phosphatase and tensin homolog/Akt pathway

BackgroundThis study aimed to evaluate the role and the underlying mechanisms of Forkhead box A1 (encoded by FOXA1) in colon cancer.MethodsWe analyzed FOXA1 mRNA and protein expression in colon cancer tissues and cell lines. We also silenced FOXA1 expression in HCT116 and SW480 cells to evaluate the effects on cell proliferation, cell cycle, migration, and invasion by using MTT, colony formation, flow cytometry, and the Transwell assay, respectively.ResultsFOXA1 immunostaining was higher in colon cancer tissues than adjacent healthy tissues. FOXA1 mRNA and protein expression was significantly increased in human colon cancer cells compared with a normal colonic cell line. FOXA1 expression was also significantly higher in colorectal cancer tissues from TCGA data sets and was associated with worse prognosis in the R2 database. FOXA1 expression was negatively correlated with the extent of its methylation, and its knockdown reduced proliferation, migration, and invasion, and induced G2/M phase arrest in HCT116 and SW480 cells by suppressing the phosphatase and tensin homolog/Akt signaling pathway and inhibiting epithelial–mesenchymal transition.ConclusionFOXA1 may act as an oncogene in colon cancer tumorigenesis and development.     

GP方案结合PD-1抑制剂治疗NSCLC的疗效及对Survivin蛋白、免疫细胞水平的影响

目的 分析GP方案结合程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)抑制剂治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的疗效及对Survivin蛋白、免疫细胞水平的影响.方法 选取2018年3月至2019年3月该院收治的105例NSCLC患者,按照随机数字表法将其分为对照组(52例)及观察组(53例).对照组给予常规GP方案治疗,观察组在对照组...     

WT1基因表达下调对K562/A02细胞阿霉素敏感性的影响

目的 探讨WT1基因表达下调对人红白血病耐药细胞系K562/A02阿霉素敏感性的影响.方法 将WT1mRNA的短发夹RNA(short hair RNA,shRNA)构建至真核表达载体后转染K562/A02细胞,流式细胞术检测转染效率;荧光定量RT-PCR和Western blot法分析WT1基因在转染前后表达的差异;pWT1shRNA转染K562/A02细胞48 h并经阿霉素作用后,MTT法检测各组细胞阿霉素IC50值;流式细胞术检测细胞阿霉素累积量及细胞凋亡率.结果 与未转染对照组及空载体组相比,转染WT1shRNA质粒的K562/A02细胞WT1mRNA和蛋白水平均明显降低;经阿霉素诱导24 h后,其对阿霉素的敏感性明显增高,相对逆转率为71.5%,细胞内阿霉素的累积量较各对照组明显增高(P值均<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.05).结论 靶向WT1shRNA干扰质粒可有效抑制K562/A02细胞WT1基因表达,增强K562/A02细胞对阿霉素的敏感性.     

PLK1基因沉默对K562/A02细胞周期、增殖和耐药性的影响

为了探讨小干扰RNA(siRNA)对K562/A02细胞Polo样激酶1(PLK1)基因的抑制作用及其对细胞周期、细胞增殖和耐药性的影响,将构建的针对PLK1mRNA的siRNA真核质粒,导入K562/A02细胞,用RT-PCR和Western-blot方法分析PLK1基因在转染前后的表达差异;台盼蓝拒染试验检测细胞存活率;流式细胞术(FACS)检测细胞周期和细胞内阿霉素(ADM)的积累量;MTT试验检测细胞对ADM的药物敏感性。结果显示,与对照组相比,转染24和48小时后,siRNA-PLK1质粒转染组的PLK1mRNA下降(34.7±2.1)%和(56.6±1.5)%,蛋白水平下降(49.9±3.2)%和(62.1±1.7)%;转染24和48小时后,细胞存活率下降了30%和59%;转染48小时后,G2/M期细胞比例提高了2.77倍,同时细胞内ADM积累量显著提高;对ADM药物敏感性的相对率为73.8%。结论:PLK1基因沉默能有效抑制K562/A02细胞生长,使细胞周期停滞在G2/M期,同时使得细胞内ADM积累量提高,对ADM敏感性增强。     

CYP3A5基因反义寡核苷酸转染K562/A02细胞逆转耐药的研究

目的:探讨针对细胞色素P4503A亚家族多肽5(CYP3A5)耐药机制进行反义寡核苷酸逆转耐药。方法:CYP3A5基因反义寡核苷酸转染K562/A02细胞后,RT鄄PCR方法检测反义寡核苷酸对CYP3A5基因转录的特异性阻断,MTT法测定不同处理组柔红霉素IC50值。结果:针对CYP3A5基因的反义寡核苷酸转染K562/A02细胞48h后明显抑制CYP3A5基因的转录,而正义、错义寡核苷酸处理组则无明显改变。转染针对CYP3A5基因的反义寡核苷酸,可使柔红霉素对K562/A02细胞的IC50值由(7.728±3.625)mg/L降至(2.494±1.674)mg/L,增敏3.10倍,差异有显著性(P<0.05),而正义、错义寡核苷酸处理组IC50值与对照组相比则无明显差异。结论:针对CYP3A5基因的反义寡核苷酸可显著逆转K562/A02细胞的耐药性。