NLRP3炎症小体在高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞EMT中的作用

目的:观察NLRP3炎症小体在高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞上皮间质转化(EMT)中的作用.方法:以小鼠肾小管上皮细胞为研究对象,高糖处理24 h后,采用real-time PCR法检测细胞表型标志分子(E钙粘素和α-SMA)和NLRP3炎症小体mRNA的表达,ELISA法检测细胞上清液中IL-1β含量.采用NLRP3炎症小体特异性抑制剂MCC950探讨NLRP3炎症小体在高糖诱导小鼠肾小管上皮细胞ETM中的作用.结果:高糖处理24 h可降低小鼠肾小管上皮细胞E钙粘素mRNA表达,上调α-SMA mRNA表达;同时上调NLRP3、pro-IL-1β和pro-caspase-1 mRNA表达,以及IL-1β分泌;抑制NLRP3炎症小体可部分逆转高糖诱导的小鼠肾小管上皮细胞EMT.结论:高糖应激可能通过激活NLRP3炎症小体促进IL-1β分泌诱导肾小管上皮细胞发生EMT.     

高糖诱导大鼠近端肾小管上皮细胞肥大

目的 观察高糖培养对大鼠近端肾小管上皮细胞肥大的影响.方法 SD大鼠,麻醉下,无菌分离单根近球小管并培养,以免疫细胞化学方法鉴定体外培养的肾小管上皮细胞.不同浓度糖(10 mM,20 mM,30mM)培养肾小管上皮细胞,72小时后检测细胞体积、3H-亮氨酸掺入量以及蛋白质含量,以观察细胞肥大情况.结果 高糖(20 mM,30mM)培养72小时,导致肾小管上皮细胞体积明显增大,3H-亮氨酸掺入量及细胞内蛋白质含量明显增加.结论 高糖培养可诱导肾小管上皮细胞肥大.     

miR-93-3p对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤及炎症因子分泌的影响

目的 微小miRNA-93-3p（miR-93-3p）对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤及炎症因子分泌的影响。方法 体外培养肾小管上皮细胞,分为NC组、HG组、anti miR NC组、anti miR-93-3p组、HG+ miR NC组、HG+miR-93-3p组。采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR 93 3p的表达;酶联免疫吸附（ELISA）法检测肿瘤坏死因子 α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）水平;甲基噻唑基四唑（MTT）检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测细胞周期蛋白1（CyclinD1）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（C caspase-3）、磷酸化 磷脂酰肌醇激酶（p-PI3K）、磷酸化 蛋白激酶 B（p-AKT）表达量。结果 与NC组相比,HG组miR 93 3p的表达水平显著降低（P＜0.05）,细胞存活率显著降低（P＜0.05）,CyclinD1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,而细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）,C caspase 3、p PI3K、p AKT蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）,TNF α、IL 6水平显著升高（P＜0.05）;与anti miR NC组相比,anti miR-93-3p组细胞存活率显著降低（P＜0.05）,细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）,C caspase 3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）,TNF α、IL 6水平显著升高（P＜0.05）;与HG+ miR NC组相比,HG+miR 93 3p组细胞存活率显著升高（P＜0.05）,细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）,CyclinD1蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）,C caspase 3、p PI3K、p AKT蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,TNF α、IL 6水平显著降低（P＜0.05）。结论 miR 93 3p通过调控PI3K/AKT信号通路抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤及炎症因子分泌。     

SARA在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中的表达变化

目的：建立高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化模型,检测肾小管上皮细胞转分化过程中Smad锚着蛋白（Smad anchor for receptor activation, SARA）的表达变化。方法：采用Western印迹和实时定量PCR检测细胞波形蛋白（vimentin）、紧密连接蛋白（Zona occludens-1, ZO-1）、SARA蛋白及其mRNA表达水平。结果：30 mmol/L D-葡萄糖刺激后,HK-2细胞vimentin蛋白及其mRNA水平呈时间依赖性升高,而ZO-1蛋白及其mRNA水平呈时间依赖性下降,此变化在高糖刺激48 h时最为显著。同时,SARA蛋白及其mRNA表达水平呈时间依赖性下降。结论：高糖可诱导HK-2细胞发生转分化,SARA可能作为保护因子参与了这一过程。     

高糖环境肾小管上皮细胞Smad1的表达

目的模拟糖尿病条件,观察人肾小管上皮细胞(HK-2)生长情况和Smad1表达的变化,探讨高糖对肾小管上皮细胞的损伤机制。方法用DMEM/F12细胞液培养HK-2细胞,分为对照组,中糖组(12.5mmol/L葡萄糖),高糖组(25mmol/L葡萄糖),分别培养24h、48h、72h后倒置显微镜下观察HK-2的形态和数量变化,采用蛋白印迹技术检测Smad1的蛋白表达。结果高糖组刺激72h后,与对照组相比HK-2细胞数为(105.333±6.429)×105/m L,而对照组HK-2细胞数为(50.333±2.51)×105/m L,差异有统计学意义(P<0.01);高糖组HK-2细胞形态改变,Smadl蛋白表达明显增加。结论高糖能够诱导肾小管上皮细胞数量及形态发生改变,并且这一作用可能与Samd1表达增加有关。     

高糖对人肾小管上皮细胞肌醇加氧酶表达的影响

目的:研究高糖环境下人近端肾小管上皮细胞肌醇加氧酶(MIOX)的表达.方法:将人近端肾小管上皮细胞株HK-2分组培养,正常对照组培养基含5.5 mmol/L D-葡萄糖,渗透浓度对照组培养基含19.5 mmoL/L甘露醇和5.5 mmoL/L D-葡萄糖,高糖组培养基含25 mmol/L D-葡萄糖.分别于培养12、24、48、72 h后取出爬片,应用免疫荧光细胞化学法检测MIOX蛋白的表达.结果:正常对照组和渗透浓度对照组HK-2细胞胞质MIOX蛋白微弱表达,各时间点表达量差异无统计学意义(P>0.05).高糖组培养12 h时,HK-2细胞MIOX蛋白表达即增高,随培养时间的延长,MIOX蛋白表达量逐渐升高,于48 h达高峰.高糖组MIOX蛋白表达水平较正常对照组升高(P<0.01).结论:高糖能促进人近端肾小管上皮细胞MIOX的表达,从而介导糖尿病患者体内肌醇耗竭.     

丹酚酸B对高糖培养肾小管上皮细胞转分化的影响及意义

目的：探讨丹酚酸 B 对高糖诱导肾小管上皮细胞分化的影响及可能机制。方法：体外培养大鼠肾小管上皮细胞 NRK52E 随机分为正常糖（NG）组、高渗（HM）组、高糖（HG）组和高糖＋Sal B（HB）组,分别培养24 h;采用免疫酶细胞化学染色对 NRK52E 细胞进行鉴定,MMT 法检测丹酚酸 B 对细胞生长活性的影响,免疫荧光细胞化学和 Western blotting 检测各组 TGF-β1、E-caderin、α-SMA 和 Col-Ⅳ蛋白的表达。结果：与 NG 组相比较,HG 组肾小管上皮细胞中 TGF-β1、α-SMA 和 Col-Ⅳ蛋白表达增多（P ＜0．05）,而 E-cadherin 蛋白表达降低（P＜0．05）;与 HG 组比较,HB 组肾小管上皮细胞中 TGF-β1、α-SMA 和 Col-Ⅳ蛋白表达减少（P ＜0．05）,而 E-cad-herin 蛋白表达增多（P ＜0．05）。结论：丹酚酸 B 对高糖诱导肾小管上皮细胞的上皮－间充质转化（EMT）有明显抑制作用,其机制可能是通过抑制 TGF-β1的表达,改善了肾小管纤维化病变的发生发展。     

白藜芦醇抑制TXNIP/NLRP3信号通路改善脂多糖诱导的肾小管上皮细胞炎性损伤

[目的]观察白藜芦醇对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞（HK-2）炎性损伤的保护作用,及其对TXNIP/NLRP3炎性通路的影响。[方法]采用脂多糖（LPS,1 mg/L）体外诱导HK-2细胞炎性损伤模型,将细胞分为正常对照组、LPS诱导组、LPS+低剂量（50 μmol/L）白藜芦醇组、LPS+中剂量（100 μmol/L）白藜芦醇组、LPS+高剂量（200 μmol/L）白藜芦醇组;CCK8法检测HK-2细胞相对存活率,酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测炎性因子白介素-6（IL-6）、白介素-1β（IL-1β）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平,Western Blot方法分析诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧酶-2（COX-2）、人硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP）及人隐热蛋白（NLRP3）表达。[结果]与LPS诱导组比较,不同浓度白藜芦醇干预的HK-2细胞相对存活率明显升高（P<0.05）,细胞上清炎性因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平明显降低（P<0.05）,细胞中炎性蛋白iNOS及COX-2表达水平显著降低（P<0.05）;细胞中TXNIP及NLRP3蛋白表达也显著降低（P<0.05）,并表现出剂量依赖性。[结论]白藜芦醇可以明显抑制LPS诱导的HK-2细胞炎症损伤,抑制炎症相关蛋白的表达,其作用机制可能与抑制TXNIP/NLRP3炎性通路活化相关。     

RNAi干扰WT1和Pax2表达对逆转肾小管上皮间充质转化的作用

 【目的】 探讨抑制肾小管上皮间充质转化(EMT)过程中胚胎发育关键基因WT1和Pax2的表达对EMT的逆转作用。【方法】 采用RNAi技术分别抑制WT1和Pax2。分别构建pshRNA-WT1和pshRNA-Pax2表达载体,采用脂质体转染技术,使质粒瞬时转染NEK52E细胞后用10 ng/mL IL-1α刺激细胞,分别提取不同时间点细胞的RNA和蛋白质,采用RT-PCR和Western blot检测细胞WT1、Pax2、Snail、上皮细胞标志E-cadherin和间充质标志α-SMA的mRNA和蛋白质的表达,并观察NRK52E细胞的形态。【结果】构建的pshRNA-WT1和pshRNA-Pax2表达载体可在转染细胞内发挥RNAi作用抑制WT1和Pax2基因的表达,抑制率分别为80.4 %和82.7 %。分别抑制WT1和Pax2基因后EMT过程受阻,α-SMA和Snail的表达显著减少,E-cadherin的表达无显著性变化,细胞形态未发生明显的成纤维化样改变。【结论】 WT1和Pax2基因是EMT中的关键基因,分别抑制胚胎发育关键基因WT1和Pax2均可使EMT受阻。阻断WT1和Pax2的表达有望中止EMT及肾纤维化的发生。     

阿魏酸钠对高糖诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用

目的观察阿魏酸钠（sodiumferulate,SF）对高糖培养的人近端肾小管上皮细胞（humanproximaltubularepithelialcells,HKC）增殖和凋亡的影响。方法选用对数期生长的肾小管上皮细胞,分为对照组、高糖组、高糖加阿魏酸钠组。四甲基偶氮唑盐（microculturetetrazolium,MTT）法观察细胞增殖能力的变化,测定细胞培养液中的乳酸脱氢酶（1actatedehydrogenase,LDH）的含量以判断细胞损伤情况,Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡。结果与对照组比较,高糖组MTT吸光度值（OD值）随培养时间延长明显降低,而高糖加阿魏酸钠组OD值与高糖组比较有明显升高（P〈O．05）。随培养时间的延长,高糖组培养基中LDH水平明显升高,在12h和24h分别为（17．55±2．45）和（28．72±3．11）U／L,而高糖加阿魏酸钠组12h和24hLDH水平降至（11．84±2．18）和（19．984-3．67）U／L,和同时间点高糖组比较均有明显降低（P〈0．05）。高糖处理组培养液中的丙二醛（malondiadehycle,MDA）水平较对照组明显增加（P〈0．01）,超氧化物歧化酶（superoxidedismutase,SOD）活性明显降低（P〈0．01）,阿魏酸钠组培养液中MDA水平明显降低（P〈0．01）,SOD活性明显增加（P〈0．05,P〈0．01）。Hoechst33258荧光染色显示,对照组和高糖加阿魏酸钠组仅见个别凋亡形态细胞,高糖组典型凋亡形态细胞明显增多,细胞凋亡率为34．17％,显著高于正常对照组（5．20％）和高糖加阿魏酸钠组（7．39％,P〈0．01）。结论高糖培养可诱导人近端肾小管上皮细胞的损伤和凋亡,并抑制其增殖。阿魏酸钠对人肾小管上皮细胞系（humankidneycell,HKC）的保护作用可能是通过抑制HKC的损伤和凋亡,以及提高增殖能力实现的。     

辛伐他汀对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:观察辛伐他汀对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化的作用。方法:大鼠肾小管上皮细胞随机分成三组(n=8):对照组,高糖组和辛伐他汀组。对照组加培养液,高糖和辛伐他汀组在培养液中加葡萄糖,终浓度为30mmol/L,辛伐他汀组加入终浓度为1μmol/L辛伐他汀。在6,12,24,48,72 h时用免疫细胞化学和Western blot检测α-SMA的表达。结果:对照组各时间段均无α-SMA表达。高糖组6 h时出现α-SMA阳性表达,48 h达高峰。与高糖组比较,辛伐他汀组各时间点α-SMA的表达均明显减少(P<0.05)。结论:辛伐他汀可抑制高糖诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化。     

氯沙坦对糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的观察糖尿病大鼠肾小管上皮细胞转分化及氯沙坦对其的影响,探讨ARB糖尿病肾病保护作用中与TEMT有关的新机制.方法 50只雄性Wistar大鼠随机分为对照组(n=10只)和糖尿病模型组(n=40只);模型组大鼠给予腹腔内一次注射链脲佐菌素(STZ)60 mg/kg诱导糖尿病模型.模型成功后再随机分为糖尿病组和氯沙坦组.氯沙坦组给予氯沙坦20 mg/kg*d-1一次灌胃.于干预后第16周测定尿蛋白和内生肌酐清除率;光镜观察肾小管间质损害及纤维化;免疫组织化学法检测肾小管上皮细胞TGF-β1、Vimentin和α-SMA表达,并对结果进行半定量分析.结果糖尿病组大鼠24 h尿蛋白排泄增加(P＜0.01),肾小管上皮细胞α-SMA、Vimentin和TGF-β1阳性表达面积分别为0.3690±0.0587,0.1546±0.0141和0.3716±0.0657; 氯沙坦组大鼠24 h尿蛋白排泄较糖尿病组减少,肾小管间质损伤和间质纤维化程度减轻;其肾小管上皮细胞α-SMA、Vimentin及TGF-β1表达较糖尿病组显著下调(P＜0.01).结论氯沙坦能显著下调糖尿病大鼠肾小管上皮细胞α-SMA、Vimentin和TGF-β1表达,阻抑肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化.     

高浓度葡萄糖对晶状体上皮细胞形态及细胞周期的影响

目的：观察高浓度葡萄糖状态对培养的兔晶状体上皮细胞RNA、DNA、超微结构的影响，以探讨糖尿病性白内障的发病机理。方法：高浓度葡萄糖（4.5g/L）作用于培养的兔晶体上皮细胞24、72、144h后采用流式细胞仪检测晶体上皮细胞RNA、DNA、细胞周期、增殖指数。且以倒置显微镜、扫描电镜、透射电镜进行晶体上皮细胞形态学的研究。结果：高浓度葡萄糖作用于培养兔晶体上皮细胞24h各指标无明显变化，72hRNA量、S期细胞增加，G2/M期细胞减少，144G2/M期细胞增加，但分裂指数并未相应提高；形态学上可见实验组细胞微绒毛及细丝丢失，细胞膜破裂，细胞染色质分布不均，细胞器减少、肿胀，髓样体出现。结论：高浓度葡萄糖（4.5g/L）能诱导晶体上皮细胞进入有丝分裂，但又阻碍有丝分裂的完成；同时对细胞膜、细胞核、细胞器均产生有害影响，使晶体上皮细胞的形态结构发生改变，细胞更趋老化，为糖尿病性白内障的发生奠定了基础。     

白蛋白对肾小管上皮细胞增殖的影响

目的探讨蛋白尿检在不同时间点对大鼠近端。肾小管上皮细胞增值的影响。方法观察组采用体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞（Rat proximal renal tubular epithelial cells,NRK-52E）,取生长状态良好,待其接近融合时模拟体内大量蛋白尿环境,给予不同浓度（10、20、30mg·ml^-1）去脂牛血清白蛋白（fat free bovine serum albumin,BSA）刺激,共同孵育6、12、18、24h;对照组给予同体积无血清培养基共同培养。采用MTT试验检测BSA对体外培养NRK-52E细胞毒作用。结果与对照组比较,白蛋白浓度为10mg·ml^-1时对NRK-52E细胞分别作用6、12、18和24h后,对细胞增殖程度影响没有差异（P〉0．05）。当白蛋白浓度为20mg·ml^-1时,对NRK-52E细胞作用6h后,细胞增殖程度与对照组比较没有差异（P〉0．05）,但随着作用时间的延长,细胞增殖低于对照组（P〈0．05）。当白蛋白浓度为30mg·ml^-1时,随着作用时间的延长细胞增殖几乎停滞,与对照组比较有统计学差异（P〈0．05）。结论白蛋白以时间和剂量依赖方式抑制NRK-52E细胞增殖,并可促进肾小管上皮细胞凋亡。     

结缔组织生长因子介导高糖诱导肾小管 上皮细胞肥大的机制

 【目的】 研究高糖诱导肾小管上皮细胞肥大的作用途径及可能机制&#65377;【方法】 HK-2细胞分正常对照组(培养基含葡萄糖1 g/L),等渗对照组(葡萄糖1 g/L + 甘露醇3.5 g/L)和高糖组(葡萄糖4.5 g/L)培养&#65377;收集各组培养至24 h,48 h,96 h的细胞,检测结缔组织生长因子(CTGF)&#65380;p27kip的mRNA水平&#65380;CTGF&#65380;p27kip的蛋白水平&#65380;细胞增殖活力&#65380;细胞周期分布及细胞总蛋白含量&#65377;另外检测各组培养30 min&#65380;1 h&#65380;24 h&#65380;48 h时的磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)水平&#65377;每个检测指标设3个重复样本&#65377; 【结果】 高糖刺激可引起HK-2细胞的CTGF&#65380;p27kip的mRNA及蛋白表达水平显著升高,ERK1/2磷酸化激活,阻滞于G1期的细胞显著增多,细胞增殖活力受抑制,细胞肥大主要指标胞内蛋白总含量进行性增高&#65377; 【结论】 证实了高糖可通过上调CTGF激活ERK1/2信号转导,从转录水平上调p27kip,从而使增殖细胞阻滞于G1期诱导细胞肥大&#65377;     

环孢素A对肾小管上皮细胞MMP-2和 MMP-9表达和活性的影响

 【目的】 观察环孢素A(CSA)对近端肾小管上皮细胞基质金属蛋白酶-2和-9(MMP-2 和 MMP-9)表达和活性的影响&;#65377;【方法】 体外培养大鼠近端肾小管上皮细胞株NRK52E细胞至完全融合时,分别给予不同浓度的CSA 0,0.42,0.84,4.2,8.4 μmoL/L,实验观察48 h和72 h&;#65377;收集培养液,用明胶酶谱法检测MMP-2和MMP-9活性&;#65377;提取总RNA,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测MMP-2和MMP-9的mRNA水平&;#65377; 【结果】 CSA刺激NRK52E细胞呈剂量依赖性抑制MMP-2活性和mRNA表达&;#65377;与对照组(CSA 0 μmoL/L)比较,CSA0.42,0.84,4.2,8.4 μmoL/L的MMP-2活性分别下降为27%,24%,11%,9%;差异均有统计学意义,P < 0.05&;#65377;CSA刺激NRK52E细胞增加MMP-9活性和mRNA表达&;#65377;与对照组比较,CSA 4.2 μmoL/L 刺激48 h MMP-9活性上调为438%,72 h上调为237%,差异均有统计学意义,P < 0.05&;#65377; 【结论】 CSA对肾小管上皮细胞MMP-2表达和活性呈剂量依赖性抑制,以及对MMP-9表达和活性的诱导作用可能与CSA所致肾小管间质损害相关&;#65377;