XAF1基因重组腺病毒载体的构建及其在人肝癌细胞体内外的表达

目的利用携带35型腺病毒纤毛的嵌合型5型腺病毒载体系统Ad5/F35构建XAF1基因重组腺病毒,体内外感染人肝癌细胞SMMC7721并使XAF1基因有效表达。方法将真核表达质粒pcDNA3.1-XAF1和穿梭质粒pDC316用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、筛选、测序获得重组穿梭质粒pDC316-XAF1。将测序正确的pDC316-XAF1和骨架质粒pBHG-fiber5/F35用Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,进行细胞内同源重组,得到重组腺病毒Ad5/F35-XAF1。予终点稀释法测定重组腺病毒的感染滴度。用同样的方法得到携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的报告病毒Ad5/F35-EGFP。建立人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠移植瘤模型,将Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-EGFP重组腺病毒分别感染人肝癌细胞株SMMC7721和瘤内注射;荧光显微镜观察EGFP在细胞和移植瘤冰冻切片中的表达;RT-PCR和Westrenblot法检测XAF1的mRNA和蛋白在细胞和移植瘤组织的表达。结果重组腺病毒Ad5/F35-EGFP感染肝癌细胞和瘤内注射后,予荧光显微镜均可见细胞和冰冻切片中呈现绿色荧光;Ad5/F35-XAF1感染肝癌细胞和瘤内注射后,XAF1mRNA和蛋白表达均显著高于对照组和报告病毒组。结论成功构建重组腺病毒Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-EGFP。该腺病毒载体可携带目的基因在人肝癌细胞株SMMC7721体内和体外进行有效表达。     

FCU1重组腺病毒载体构建及对结肠癌细胞的杀伤作用

目的:构建含融合自杀基因FCU1的重组腺病毒载体,转染293细胞构建重组腺病毒,并感染结肠癌细胞,同时给以前体药物5-FC,观察其对结肠癌细胞的杀伤作用.方法:将FCU1基因采用EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切克隆至穿梭质粒pDC316,构建质粒pDC316-FCU1,并酶切和测序鉴定.pDC316-FCU1与骨架质粒pBHG经脂质体共转染HEK 293细胞,在HEK 293细胞中同源重组并包装重组腺病毒Ad5-FCU1.将Ad5-FCU1感染结肠癌细胞HCT116,同时给以前体药物5-FC,MTT法检测5-FC对HCT116杀伤作用.结果:重组质粒PDC316-FCU1构建成功.pDC316-FCU1与骨架质粒pBHG共转染HEK293细胞后,出现明显的毒斑,纯化后病毒滴度为2×1012 PFU/L.重组病毒Ad5-FCU1感染HCT116细胞后,给以无毒前体药物5-FC显示极强的杀伤作用,当5-FC达100 μmol/L时,存活的HCT116/FCU1细胞极少.而对照组存活率接近90%.结论:成功构建了含融合自杀基因FCU1的Ad5-FCU1重组腺病毒,FCU1/5-FC自杀基因系统对结肠癌细胞具有显著的体外杀伤作用.     

下调大鼠血管内皮细胞血管紧张素转换酶的实验研究

目的构建腺病毒载体使其携带血管紧张素转换酶(ACE)基因短发夹RNA(shRNA),通过RNA干扰技术选择性地下调大鼠血管内皮细胞(ECs)ACE表达。方法采用RT-PCR法从之前构建的真核表达载体p-ACE-shRNA中扩增ACE-shRNA片段,扩增之后将ACE-shRNA片段克隆进pDC316穿梭质粒,再将293细胞被构建好的pDC316-ACE-shRNA穿梭质粒载体和pBHGlox-E1,3Cre骨架病毒转染,进行病毒颗粒包装重组并进行滴度测定和纯化。随后进行原代培养大鼠血管ECs转染,通过实时荧光定量PCR法分别在转染前及转染后24h、48h、72h通过实时荧光定量PCR法来检测ACE mRNA的表达。结果高滴度的重组病毒被制备完成,携带ACE-shRNA的重组腺病毒载体经PCR检测、限制性内切酶和GFP表达证实构建成功,被转染24h时大鼠血管ECsACE mRNA表达无统计学意义变化;但被转染48h时,ECsACE mRNA表达差异有统计学意义(P0.05);被转染后72h时表达更低。结论实验成功构建重组腺病毒载体并携带ACE-shRNA片段,同时证实shRNA可选择性下调原代培养大鼠血管ECs上ACE表达,可能为心血管病基因治疗和应用提供新思路。     

下调大鼠血管平滑肌细胞血管紧张素转换酶的表达

目的构建腺病毒载体使其携带血管紧张素转换酶(ACE)基因短发夹RNA(shRNA),观察选择性下调大鼠血管平滑肌细胞ACE表达。方法从之前构建的真核表达载体p-ACE-shRNA中扩增ACE-shRNA片段,采用RT-PCR法并克隆进穿梭质粒pDC316中,将构建好的pDC316-ACE-shRNA穿梭质粒载体和pBHGlox-E1,3Cre骨架病毒共转染293细胞,进行病毒颗粒包装重组、滴度测定和纯化。随后进行原代培养大鼠血管平滑肌细胞转染,通过实时荧光定量PCR分别在转染前及转染后24h、48h、72h检测ACE mRNA的表达。结果经PCR检测证实携带ACE-shRNA重组腺病毒载体构建成功并制备出了高滴度重组病毒,大鼠血管平滑肌细胞被转染后24h,ACE mRNA表达无明显变化;被转染后48h,ACE mPNA表达显著降低,差异有统计学意义(P0.05);被转染后72h时ACE mRNA表达更低。结论本实验成功构建重组腺病毒载体其携带ACE-shRNA片段,同时证实shRNA可选择性下调原代培养大鼠血管平滑肌细胞上ACE表达,可能为心血管病基因治疗提供新思路。     

大鼠重组腺病毒载体RP105的构建和鉴定

目的构建和鉴定大鼠RP105重组腺病毒载体,并获得具有一定滴度的重组腺病毒表达载体Ad-RP105-EGFP。方法 PCR钓取目的基因RP105,连接入穿梭载体GV135(CMV-MCS-EGFP),形成连接产物。连接好的重组腺病毒载体CMV-RP105-MCS-EGFP转化大肠埃希菌DH5a感受态细胞获得大量阳性克隆,对阳性克隆进行酶切鉴定及测序鉴定。采用AdMax腺病毒包装系统,将成功构建的RP105重组腺病毒穿梭质粒与辅助包装质粒共转染HEK293细胞,通过Cre/loxP重组酶系统的作用实现重组,得到重组腺病毒,并进行重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定。结果重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定与测序证明本实验成功构建了大鼠RP105重组腺病毒载体。RP105穿梭质粒和腺病毒包装质粒共转染HEK293细胞24h后可见大量绿色荧光蛋白表达和聚集,10d后出现典型的细胞病变,说明腺病毒包装成功。再经重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定,重组腺病毒滴度为1×109 PFU/ml。结论本实验成功构建了携带RP105基因的重组腺病毒表达载体Ad-RP105-EGFP。这为下一步研究其对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及分子机制奠定了实验基础。     

STAT3靶向RNAi腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的 观察针对STAT3基因的RNAi腺病毒表达载体对大鼠神经胶质瘤细胞的干扰效果,为探索肿瘤基因治疗的新途径奠定基础.方法设计针对STAT3编码区的短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,克隆到PGEM-T中,构建重组体,再对重组质粒进行酶切鉴定,DNA测序分析后再克隆到穿梭质粒PDC316中,通过Lipofectamine2000的介导和腺病毒包装质粒PBHG共转染至人胚肾HEK293细胞株中,经同源重组后获得重组腺病毒rAD-STAT3,应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定病毒滴度.以阴性为对照,转染到大鼠神经胶质瘤(C6)细胞,Western印迹法检测STAT3蛋白质表达量的改变,RT-PCR法观察STAT3基因表达改变.结果酶切鉴定和测序分析均提示STAT3靶向RNAi病毒表达载体构建成功,阳性病毒载体转染后C6细胞STAT3基因表达及蛋白质表达均较阴性转染的对照组显著下降.结论 STAT3靶向RNAi腺病毒表达载体成功构建,并能有效抑制C6细胞中STAT3基因表达.     

大鼠微小RNA-22腺病毒载体的构建和鉴定

目的构建并鉴定大鼠miR-22腺病毒载体,制备具有一定滴度含miR-22基因的重组腺病毒,为后期研究miR-22在心肌缺血再灌注损伤中的作用及分子机制奠定基础。方法化学合成目的基因序列(含酶切位点),对目的基因进行PCR扩增、酶切,酶切后的目的基因与酶切后的GV202载体连接产生miR-22腺病毒表达载体,将连接好的产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞获得大量阳性克隆,对阳性克隆进行酶切鉴定及测序鉴定。利用脂质体2000试剂,让成功构建的miR-22重组腺病毒载体和腺病毒包装质粒共转染人胚肾293细胞,得到重组腺病毒,完成重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定。结果成功构建了大鼠miR-22腺病毒载体。经重组腺病毒扩增、纯化及滴度测定,最终获得的重组腺病毒滴度为1×109 PFU/ml。结论成功构建制备获得了具有一定滴度含miR-22基因的重组腺病毒,为后期顺利开展有关miR-22在心肌缺血再灌注损伤中的作用及分子机制研究提供了可能。     

CEA启动子驱动下表达Hsp70基因的重组腺病毒的构建及鉴定

目的 构建癌胚抗原(CEA)启动子驱动下靶向表达热休克蛋白70 (Hsp70)基因的重组腺病毒。方法 通过RT-PCR和PCR的方法分别扩增人Hsp70基因和CEA启动子,构建穿梭质粒pDC316-pCEA-Hsp70。将所得的穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞获得重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70。通过梯度离心纯化病毒,采用半数细胞培养物感染量测定病毒滴度。分别以重组的腺病毒感染CEA阳性的人胰腺癌BxPC3细胞和CEA阴性的SW1990细胞,通过RT-PCR和ELISA法检测Hsp70 mRNA和蛋白的表达。结果 酶切和测序证实Hsp70基因和CEA启动子成功插入PDC316质粒。与骨架质粒共转染293细胞获得的病毒经PCR扩增证实重组腺病毒构建成功。最终获得的病毒颗粒数达2.2 ×1011 vp/ml,滴度为1.5×1010 PFU/ml。重组腺病毒感染CEA阳性表达的BxPC3细胞后,可显著增加Hsp70 mRNA和蛋白的表达,而感染CEA阴性的SW1990细胞,Hsp70 mRNA和蛋白的表达无变化。结论 成功构建了能够在CEA阳性细胞中靶向表达Hsp70基因的重组腺病毒Ad5-pCEA-Hsp70,为进一步研究奠定了基础。     

人Rob04基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建人Rob04（hRob04）基因的重组腺病毒表达载体,为研究Rob04的功能和作用机制以及Rob04的基因治疗奠定基础。方法采用DNA重组与细菌内同源重组技术,通过PCR方法以hRob04的表达质粒为模板扩增得到hRob04的编码序列,克隆到穿梭质粒pDC316-hRob04中,经测序验证后,将骨架质粒（pBHGlox_E1）和穿梭质粒共转染到HEK293细胞中,同源重组产生重组腺病毒;包装收获病毒颗粒;PCR鉴定该重组腺病毒是否携带目的基因。结果PCR及限制性内切酶酶切鉴定表明成功构建携带人Rob04基因的腺病毒载体。结论运用同源重组技术能够构建携带人Rob04基因的重组腺病毒载体。     

大鼠5-脂肪氧合酶cDNA的重组腺病毒制备及在大鼠血管外膜成纤维细胞中的表达

目的利用细菌内同源重组法快速构建携带大鼠5-脂肪氧合酶(5-lipoxygenase,5-LO)cDNA的重组腺病毒质粒和制备表达大鼠5-LO的重组腺病毒,并在大鼠原代血管外膜成纤维细胞中实现过表达。方法聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增大鼠5-LOcDNA片段,亚克隆至腺病毒穿梭质粒中,构建成转移质粒pshuttle-CMV-5LO;用PmeI线性化的pshuttle-CMV-5LO转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态BJ5183,通过同源重组获得阳性重组质粒pAdEasy-1-5LO。重组质粒经鉴定后用Pad酶切,转入HEK293细胞,包装成重组腺病毒Ad-1-5LO,经纯化,鉴定,滴度测定,转染体外培养的大鼠原代血管外膜成纤维细胞,Western blot检测腺病毒载体在体外的过表达。结果 5-LOcDNA成功地插入到穿梭质粒中,pshuttle-CMV-5LO与pAdEasy-1在BJ5183中成功发生了同源重组,得到了重组腺病毒质粒pAdEasy-1-5LO,重组腺病毒经PCR和酶切鉴定表明携带有目的基因5-LOcDNA,滴度约为1.0×10~(15)pfu/L,转染大鼠原代血管外膜成纤维细胞后经Western blot检测,细胞内5-LO的表达明显增加。结论细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,制备出的高滴度重组腺病毒Ad-1-5LO实现了在血管外膜成纤维细胞中的过表达,为研究5-LO途径在血管重构中的作用奠定了基础。     

大鼠ANT1基因腺病毒载体的构建及体外表达

目的 构建大鼠线粒体蛋白ANT1基因的腺病毒载体,并检测其在体外培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达.方法 将大鼠线粒体膜蛋白腺(嘌呤核)苷酸移位酶(adenine nucleotide translocase,ANT)1基因片段克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV上,在细菌中将穿梭质粒和pAdXsi载体进行重组,经脂质体转染HEK293细胞对重组腺病毒包装、扩增,用其感染体外培养的VSMC.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,荧光显微镜观察转染效率.用Western印迹检测转染后ANT1在VSMC中的表达.结果 酶切鉴定及PCR结果表明ANT1基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达2×1011 pfu/ml,Western印迹检测ANT1在VSMC中表达明显高于对照组(P<0.05).结论 成功构建了含大鼠ANT1基因的重组腺病毒载体并在VSMCs有效表达,为以后将Ad-ANT1应用于VSMCs凋亡的研究奠定了基础.     

人组织因子途径抑制物腺病毒表达系统的构建及体内表达

目的构建携载人组织因子途径抑制物(tissuefactorpathwayinhibitor,TFPI)基因的重组腺病毒载体,为基因治疗提供实验基础。方法利用基因重组技术,将人TFPI基因连接到穿梭质粒pDC316中,然后将腺病毒骨架质粒pBHGlox△E1,3Cre以及重组穿梭质粒pDC316-TFPI共转染293细胞,并在其中发生Cre重组酶介导的位点,特异性重组及腺病毒包装,扩增后进行滴度测定。将包装成功的携带人TFPI基因的重组腺病毒(Ad-TFPI)转染兔颈动脉,并用携带LacZ报告基因的重组腺病毒(Ad-LacZ)作为对照,3d后RT-PCR、ELISA法检测人TFPImRNA、蛋白的表达。结果得到了携带人TFPI基因的重组腺病毒,包装的病毒蚀斑形成单位(plaqueformationunit,PFU)滴度为7.6×1012/L。在Ad-TFPI转染兔颈动脉后3d,RT-PCR法和ELISA法均检测出TFPI表达,Ad-LacZ转染后未测到人TFPI的表达。结论成功构建了人TFPI腺病毒表达载体,为下一步的基因治疗提供了基础。     

smad7和uPA双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的通过引入内部核糖体进入位点序列,构建并鉴定smad7和uPA基因共表达的腺病毒载体.方法PCR扩增uPA和smad7全长cDNA的片段,先后亚克隆入pIRES质粒;更换酶切位点后,将smad7-IRES-uPA片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,再与pAdEasy-1质粒在RJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.酶切鉴定后在293细胞中包装成重组腺病毒Adsmad7/uPA.RT-PCR检测Adsmad7/uPA在L02肝细胞中的表达.结果该重组腺病毒质粒经测序、酶切鉴定,均与预期结果一致;转染AD-293细胞后,2天可观察到GFP明显表达;RT-PCR检测到转染后的L02细胞中smad7和uPA表达增强.结论成功构建了smad7和uPA双基因共表达重组腺病毒载体,为研究mad7和uPA双基因共表达对大鼠肝纤维化的预防、治疗作用奠定基础.     

人前列腺特异性膜抗原基因重组腺病毒的构建及其表达

目的 体外构建含有人前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因的重组腺病毒载体,并检测其在HEK293细胞中的表达.方法 设计一对含有SfiI酶切位点的PSMA基因上下游引物,以质粒pCMV-SPORT6/PSMA为模板,通过PCR扩增获得PSMA基因全序列.片段回收后经酶切处理,连接到穿梭质粒pShuttle-CMV-EGFP上,获得重组穿梭质粒pShuttle-EGFP-PSMA.经SfiI酶切、PCR及插入片段测序鉴定正确后,将其用I-CeuI和I-SceI双酶切处理,转移到pAdxsi载体上,得到pAdxsi-GFP-PSMA病毒质粒,线性化后经HEK293细胞包装成复制缺陷型腺病毒Ad-PSMA,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,RT-PCR,Western印迹检测目的基因人PSMA的表达.结果 成功构建了含有人PSMA基因的重组腺病毒,病毒滴度为2×1010 pfu/ml.Western印迹检测可见PSMA蛋白的正确表达.结论 该重组腺病毒载体的成功构建及表达,为下一步以人PSMA作为靶抗原构建DC疫苗和基因免疫治疗奠定基础.     

载脂蛋白AⅠ模拟肽对载脂蛋白E基因缺陷鼠高密度脂蛋白促胆固醇流出能力的影响

目的构建带有血管紧张素转化酶(ACE)基因短发夹RNA(shRNA)的腺病毒载体,用RNA干扰技术选择性下调大鼠血管内皮细胞上ACE的表达。方法自先期构建的p-ACE-shRNA真核表达载体中用逆转录聚合酶链反应法扩增出ACE-shRNA片段,并克隆进入穿梭质粒pDC316中,将构建好的穿梭质粒pDC316-ACE-shRNA载体和骨架病毒pBHGlox-E1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒并进行纯化和滴度测定。转染原代培养的大鼠血管内皮细胞,分别于转染前及转?...     

MHC Ⅱ类转激活因子基因的重组腺病毒载体的构建

目的 构建含有主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ类分子激活物(CⅡTA)基因的重组腺病毒载体.方法 回收CⅡTA的PCR产物插人pUC57中,用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,U-Gene凝胶回收纯化3300bp目的基因片段.用EcoR Ⅰ和sal Ⅰ双酶切质粒载体pShuttle-GFP-CMV,用T4DNA连接酶将上述目的基因片段与pShuttle-GFP-CMV片段连接,得到穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-C Ⅱ TA,并经Kpn Ⅰ单酶切及测序鉴定.Ⅰ-Ceu Ⅰ/Ⅰ-See Ⅰ双酶切处理,回收目的片段,将pAdxsi载体片段和插入片段进行酶连接,得到腺病毒质粒pAdxsi-GFP-C Ⅱ TA,经Xho Ⅰ酶切鉴定后转染HEK293细胞并培养出毒.扩增、纯化重组腺病毒AdCⅡTA,并测定病毒滴度.结果 重组穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV-C ⅡTA经Kpn Ⅰ单酶切及测序分析,证实与GeneBank中公布的小鼠CⅡTA(NM_007575)序列完全相符.重组腺病毒pAdxsi-GFP-C Ⅱ TA构建成功后在HEK293细胞中包装产生的重组腺病毒AdC Ⅱ TA对HEK293细胞有致病作用.经多次重复感染并纯化后,病毒滴度达2.0×10~(11)PFU/ml.结论 含小鼠CⅡTA基因的重组腺病毒已成功构建.     

人Tum-5基因逆转录病毒载体及包装细胞株的构建

目的 构建携带Tum-5基因的逆转录病毒载体并对其进行包装,获得稳定的产毒细胞系.方法 采用RT-PCR法从胎肾组织中扩增Tum-5基因片断,并将其定向克隆到逆转录病毒载体pLXSN中进行PCR、双酶切和测序鉴定.利用电穿孔方法 将获得的重组质粒转染PA317细胞,经G418 筛选抗性克隆,收集病毒上清后感染NIH3T3 细胞测定病毒滴度.结果 PCR、酶切证实Tum-5基因克隆至逆转录病毒载体pLXSN,Tum-5基因测序结果 和原始序列相同.重组逆转录病毒载体转染PA317 包装细胞,RT-PCR证实转染后的PA317细胞上清液中存在携带人Tum-5基因的病毒RNA,病毒滴度为2.05×104cfu/ml.结论 成功的构建了携带人Tum-5基因的逆转录病毒载体,获得了稳定的产毒细胞系.     

靶向Slug基因的腺相关腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建并制备携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA病毒载体.方法:首先构建pDC316-EGFP-Slug-siRNA质粒,以PCR鉴定正确的pDC316-EGFP.Slug-siRNA克隆为模板扩增EGFP-Slug-siRNA片段,EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切回收的PCR产物;酶切pSNAV2...     

丙型肝炎病毒HLA-A2限制性复合多表位基因重组腺病毒的包装、筛选及鉴定

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）HLA-A2限制性复合多表位基因的重组转移质粒pAdtrack-CMV-Ub-Mep,转染HEK293细胞,包装重组腺病毒rAd-Ub-Mep。方法复合表位Ub-Mep基因克隆到pAdTrack-CMV穿梭质粒,得到重组的穿梭质粒pAdtrack-CMV-Ub-Mep,将穿梭质粒pAdtrack-CMV-Ub-Mep和腺病毒骨架质粒pAdEasy1共转染HEK293细胞,产生重组腺病毒rAd-Ub-Mep,通过检测绿色荧光蛋白（GFP）的表达和PCR扩增目的基因的方法鉴定重组腺病毒,并测定重组腺病毒滴度。结果经酶切鉴定、PCR鉴定和荧光分析,均证实得到重组的腺病毒。测定病毒滴度为1.2×1011cfu/L。结论成功包装出重组腺病毒rAd-Ub-Mep,构建了HCV HLA-A2限制性多表位基因的重组腺病毒疫苗,为进一步研究HLA-A2限制性复合多表位基因诱导的细胞免疫应答奠定了基础。     

含Apoptin基因重组腺病毒的构建及鉴定

目的:构建携凋亡素(Apoptin)基因重组腺病毒,为进一步研究Apoptin基因抗肿瘤作用分子机制建立基础.方法:利用BamH Ⅰ和Spe Ⅰ双酶切质粒pVAXl Apoptin,获得Apoptin片段并连接入pacAd5 CMV K-N pA,构建含Apoptin基因的穿梭质粒pacAd5-Apoptin.利用尸盘Pac Ⅰ单酶切对pacAd5-Apoptin和腺病毒基因组质粒(pAd5)进行线性化处理后应用脂质体介导法共转染AAV-293细胞,分别利用蚀斑纯化和RT-PCR、Westem blot等方法对重组病毒进行筛选和鉴定,并测定所获得重组病毒的滴度.结果:所构建重组腺病毒中的Apoptin基因得到了正确转录,表达产物的相对分子质量约为13 kDa,与CVA阳性对照一致;所获得重组腺病毒可有效表达Apoptin蛋白,该蛋白与CAV阳性血清具有反应原性,重组病毒滴度为1011PFU/L.结论:成功构建含Apoptin基因的重组腺病毒,所获得重组病毒的滴度可以满足体内外实验要求.