小鼠HMGN2干扰质粒psilence-cmv-4.1-HMGN2构建及体内干扰效果鉴定

目的:构建小鼠HMGN2干扰质粒psilence-cmv-4.1-HMGN2,以进一步明确HMGN2的生物学作用。方法:将HMGN2-shRNA片段退火后与小鼠psilence-cmv-4.1链接,饲养孕小鼠,尾静脉注射法导入shRNA表达质粒,提取8.5d胚胎RNA,用RT-PCR检测胎HMGN2的表达量进行鉴定。结果:测序结果显示psilence-cmv-4.1-HMGN2干扰质粒构建成功,RT-PCR结果显示HMGN2在8.5d胎儿表达较高广泛表达,且Psilencer-cmv-4.1-HMGN2尾静脉注射后有明显的抑制效果。结论:成功构建对8.5d胎鼠HMGN2基因具有显著干扰效率的psilencer-4.1-HMGN2干扰质粒,为进一步研究HMGN2基因的功能打下了基础。     

clock基因干扰质粒的构建及干扰效率测定

目的：构建clock基因的干扰质粒，为深入研究clock基因在信号转导通路中的作用提供有效手段。方法：采用M-folder生物软件选择2个clock基因干扰位点，并根据3个干扰片段及一个阴性对照片段，定向克隆到pGenesil-1干扰载体并测序验证。将干扰质粒及对照质粒分别转染至NIH3T3细胞，并通过检测RT-PCR产物量以获得干扰效率。结果：RT-PCR产物捡测结果显示干扰质粒pGenesil-1／clock-Ⅱ干扰效率最高，其clock表达量降低了74％，而pGenesil-1／clock-Ⅰ干扰组clock表达量只降低了2％。结论：成功构建了对clock基因具有显著干扰效率的pGenesil-1／clock-Ⅱ干扰质粒，为进一步研究clock基因的功能奠定了基础。     

BACE1基因RNA干扰质粒的构建及干扰效果的鉴定

目的构建BACE1基因干扰质粒,并研究其在neuro．2a细胞中的表达,为以其为靶点的基因治疗提供稳定转染的质粒。方法选择人、小鼠和大鼠的BACE1基因共有序列为干扰靶点,设计3组连接有GFP的干扰质粒,将构建好的质粒转染nellro-2a细胞,通过RealtimeRT—PCR及Western—blotting的方法分别在RNA及蛋白质水平上检测BACE1的表达,以分析其干扰的效率。结果经酶切及测序证实,插入的DNA片段序列与设计序列完全一致。与空质粒对照组相比,3个干扰靶点对BACE1基因的表达均有不同程度的抑制作用。其中pYr-1．1-siBACE1在mRNA水平及蛋白质水平干扰效果均最好。结论成功构建了BACE1基因的干扰质粒pYr-1．1-siBACE1,并能有效抑制neuro．2a细胞内源性BACE1基因表达,为靶向BACE1基因的治疗提供了有力的工具。     

HMGN2的重组表达质粒的构建及其抗菌功能研究

目的：构建HMGN2重组表达栽体,探讨HMGN2分子抗菌作用。方法：用基因克隆的方法构建pET-32a-c（＋）-HMGN2重组表达质粒,经IPTG诱导表达后,用亲和层析的方法纯化His-HMGN2融合蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定其分子量,行琼脂糖弥散法检测其抗菌功能。结果：成功构建了pET-32a-c（＋）-HMG17重组表达质粒,其表达的融合蛋白对致病性大肠杆菌54080,54299以及金黄色葡萄球茼ATCC25923均有抗菌活性。结论：HMGN2是一种抗菌分子,可能参与了体内的天然免疫防御作用。     

TNFAIP8干扰质粒的构建及最佳干扰效率质粒的筛选

目的:构建并筛选出干扰效率最佳的TNFAIP8-shRNA-p SIREN-Retro Q干扰质粒。方法:通过生物软件选择3个TNFAIP8基因干扰位点,构建干扰质粒并测序验证,将干扰质粒及对照质粒分别转染至A549细胞,通过RT-PCR、Western blot检测干扰效率。结果:经RT-PCR和Western-Blot证实TNFAIP8-shRNA-p SIREN-Retro Q干扰质粒能有效干扰并抑制细胞内TNFAIP8基因的表达,通过流式检测发现降低TNVAIP8表达可以提高细胞对a DR5Sc Fv诱导凋亡的敏感性。结论:成功构建和设计了对TNFAIP8基因具有显著干扰效率的干扰质粒,为进一步研究TNFAIP8基因的功能奠定了基础。     

RNAi表达载体干扰四型肽精氨酸脱亚氨基酶基因在HL-60细胞系中的表达

目的：设计针对PADI-4基因的RNAi表达载体,抑制PADI-4基因在HL-60细胞中的表达,初步确定PADI-4基因在类风湿性关节炎发生发展中的作用,为后续研究奠定实验基础。方法：设计并合成4对针对PADI-4基因编码区的核苷酸链,核苷酸链经体外退火后形成双链SiRNA,克隆进入pSiRNA-hH1neo G2空载体后转化入GT116细胞,通过蓝白斑筛选后,挑取白斑进行扩增,抽提质粒并对重组质粒进行双酶切分析。以脂质体转染法,分别将pSiRNA-hH1neo G2空载体和4个重组质粒载体转染进入HL-60细胞系,于转染的第3、5、7、10、14天后收集细胞,抽提细胞总RNA后,反转录成cDNA,用Real-time PCR技术检测各实验组HL-60细胞内PADI-4基因mRNA水平的表达情况,并做统计分析。结果：经Acc65Ⅰ和HindⅢ双酶切鉴定,重组质粒中已经插入目的片段,为合格质粒；转染pSiRNA表达载体后,HL-60细胞系中PADI-4基因mRNA表达水平下降,其中以第3号载体的干扰效果最优,干扰效率达到62%。结论：成功构建针对PADI-4基因的pSiRNA表达载体,并且筛选出干扰效率最好的载体,为后续研究PADI-4基因在类风湿性关节炎中的作用奠定实验基础。     

ATF-2基因RNA干扰表达载体的构建及鉴定

目的:构建活化转录因子2(ATF-2)基因RNA干扰的真核表达载体,观察其对HepG2肝癌细胞株增殖及凋亡的影响。方法:根据ATF-2 mRNA序列,合成两条寡聚DNA片段,退火后克隆入质粒载体PBA-siU6,DNA测序鉴定重组质粒PBA-siATF-2。脂质体介导质粒转染HepG2细胞。Westernblot法检测ATF-2蛋白表达;MTT方法检测细胞增殖率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率。结果:ATF-2基因RNA干扰载体经测序分析证实插入64 bp序列正确无误;Westernblot法显示干扰组细胞内ATF-2蛋白表达量明显降低;ATF-2基因的下调导致HepG2细胞增殖阻滞和凋亡发生。结论:成功构建了ATF-2基因RNAi真核表达载体,下调HepG2细胞ATF-2基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：分化型胚胎软骨基因1可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子,与肿瘤的发生发展有着重要的联系。 目的：构建针对人分化型胚胎软骨基因1的小干扰RNA表达载体。 方法：从NCBI中查找人分化型胚胎软骨基因1基因全长mRNA序列,利用Katahdin提供的在线小干扰 RNA模板序列设计软件,设计针对分化型胚胎软骨基因1的2条shRNA 的 DNA 模板单链,合成靶向分化型胚胎软骨基因1基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒连接,在JM-109菌株中扩增,并进行质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR以及测序鉴定。 结果与结论：将含有分化型胚胎软骨基因1目标序列25 bp 的双链 DNA插入片段,连接到pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒形成重组质粒。质粒DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可用于后续实验。菌落PCR结果表明产物大小约为170 bp,与预期相符。测序结果表明pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1的干扰合成片段,无碱基突变。成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰 RNA表达载体。     

RNA干扰MAD2基因对细胞增殖的影响

目的:探讨MAD2对HepG2细胞周期的影响。方法:构建针对MAD2基因的shRNA表达载体,MAD2基因与GFP融合的绿色荧光蛋白真核表达质粒pmad2-EGFP共转染HepG2细胞株,用Western印迹法检测shRNA的抑制效应;用MTT法测定细胞增殖率;用流式细胞仪检测细胞周期。结果:shRNA的重组质粒表达载体能明显抑制MAD2绿色荧光融合蛋白的表达。HepG2细胞转染有效干扰质粒48h后,细胞增殖抑制率达65%。有效干扰质粒引起G0/G1期和S期细胞的明显降低,G2/M期细胞增多。结论:在细胞水平,可通过RNA干扰特异性抑制MAD2基因来抑制细胞的增殖,为研究MAD2基因在细胞增殖中的作用机制奠定基础。     

Gcn5基因shRNA的载体构建及其对干细胞分化中组蛋白乙酰化修饰的干扰作用

目的构建组蛋白乙酰化酶转录辅激活酶Gcn5基因表达的干扰shRNA质粒并初步检测其性质，为研究干细胞诱导分化过程中乙酰化修饰所起的调控作用奠定基础。方法选择7条组蛋白乙酰化修饰关键因子Gcn5基因片段，用带有绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）基因的pGenesil-1作为载体，构建相应7个shRNA质粒。脂质体共转染5-氮杂胞苷（5-azacytidine，5-aza）诱导的大鼠间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），利用乙酰化酶特异性抗体Gcn5（H75）对转染细胞进行免疫化学检测，荧光显微镜图象分析系统，记数细胞，在同视野中记数转染阳性细胞以及干扰的阳性细胞，初步计算出其转染率和干扰效率。结果通过限制性内切酶酶切和DNA序列分析，重组质粒shRNA与设计相吻合；免疫细胞化学检测，发现转染阴性对照HK的细胞显现“饱满核”，乙酰化作用蛋白表达明显；转染shRNA质粒的细胞呈现十分明显表达减弱的“淡染核”或不表达的“空洞核”，转染率和干扰效率分别为93．7％和46．6％。结论构建的shRNA质粒能够达到干扰乙酰化作用的目的，为深入研究乙酰化作用奠定了一定的试验基础。     

HLCDG1基因siRNA表达质粒的构建及其对A549细胞周期和增殖的影响

目的:本研究旨在应用RNA干扰技术，诱导转基因肺癌细胞HLCDG1基因沉默并观察其对肺癌细胞周期和增殖的影响。 方法:构建HLCDG1基因短小干扰双链RNA表达载体，筛选HLCDG1基因表达沉默的肺癌细胞株并应用MTT和流式细胞仪分析这一肺癌细胞株增殖和细胞周期分布状况。 结果:根据siRNA表达载体的设计原则，构建了能在哺乳动物细胞稳定表达的siRNA载体5个（4个位点匹配实验组和1个位点错配对照组），依次命名为pHL-si-1、pHL-si-2、pHL-si-3、pHL-si-4 和 pHL-si-c。上述载体分别与表达HLCDG1的重组体pcDNA3.1(+)/HLCDG1共转染A549细胞，筛选到一株共转染pHL-si-1载体和pcDNA3.1(+)/HLCDG1重组体的A549细胞，它几无HLCDG1基因表达，这株细胞暂命名为A549-HLCDG1-si-1。MTT和流式细胞仪分析表明，A549-HLCDG1-si-1细胞增殖能力明显提高，进入S期和G2+M期增多，滞留G1期减少。 结论:采用RNAi技术特异阻断HLCDG1基因表达，验证了HLCDG1基因对A549肺癌细胞有生长抑制作用。     

shRNA干扰A549细胞KIAA0101基因表达的初步研究

目的探讨小发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)真核表达质粒介导的RNA干扰技术对人肺腺癌A549细胞KIAA0101基因表达的抑制作用。方法应用pSIREN-RetroQ载体构建KIAA0101基因shRNA重组质粒,经脂质体法导入A549细胞,分别设置为空白对照组、阴性对照组、干扰A组和干扰B组,采用实时定量PCR法和免疫印迹(Western blot)法检测检测转染后细胞KIAA0101基因mRNA与表达蛋白质的变化,四唑盐(MTT)比色法测定各组干扰细胞活性。结果成功构建KIAA0101基因shRNA重组质粒,相对阴性对照组与空白对照组,干扰B组KIAA0101的mRNA与蛋白质表达水平均下降达70%(P≤0.05)以上,MTT法结果显示降低KIAA0101的表达可抑制肺癌细胞的生长活性。结论shRNA干扰质粒可以显著降低细胞内KIAA0101mRNA与蛋白质的表达水平,并且抑制癌细胞的生长活性,为该基因在肺癌中的深入研究奠定了基础。     

蛋白激酶B2慢病毒载体的构建及其沉默效果的验证

目的：利用RNA干扰技术, 以蛋白激酶B 2（AKT2）的mRNA为靶点,设计、构建AKT-2 的RNA干扰 慢病毒载体,并对其沉默效果进行验证。方法： 根据目的基因设计3 个小干扰RNA（siRNA）靶点,进行引物合 成。将单链的引物退火成双链oligo 序列,连接入双酶切线性化的RNA干扰载体。测序验证正确的转化子,进行 高纯度质粒抽提。提取3 种阳性克隆质粒测序,转染HEK293-T 细胞后产生慢病毒质粒。实验大鼠被随机分为5 组, 每组10 只,空白对照组不注射慢病毒,NC-shRNA 阴性感染组、PL-AKT2-shRNA-1 感染组、PL-AKT2-shRNA-2 感染组、PL-AKT2-shRNA-3 感染组。大鼠附睾分别被注射200 μL 含有NC-shRNA、PL-AKT2-shRNA-1、PLAKT2- shRNA-2、PL-AKT2-shRNA-3 的病毒液;免疫印迹检测大鼠附睾AKT2的蛋白沉默效果。结果： 测序结果 证明3 种慢病毒载体被包装成功。感染大鼠附睾后,AKT2的蛋白表达量均较阴性感染组和正常对照组明显降低, 其中以PL-AKT2-shRNA-3 质粒组干扰效果更为有效。结论：成功设计了AKT-2 基因的RNA干扰靶点和制备了 AKT-2 基因的慢病毒载体,基因沉默效果明显。     

靶向髓样细胞表达的激发受体1基因短发夹RNA真核质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码髓样细胞表达的激发受体1(TREM-1)基因短发夹RNA(shRNA)真核质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 针对TREM-1的靶位点设计含shRNA的靶序列,分别构建pGCsi-TREM-1 shRNA1和pGCsi-TREM-1 shRNA2的质粒表达载体和pGCsi-NegshRNA阴性质粒表达载体,通过酶切及测序进行鉴定.鉴定后以脂质体包裹转染肺泡上皮A549细胞,分为未转染对照组(A组)、转染空质粒载体pGCsi对照组(B组)、转染阴性shRNA质粒表达载体pGCsi-NegshRNA对照组(C组)、转染TREM-1 shRNA1质粒表达载体组(D组)和转染TREM-1shRNA2质粒表达载体组(E组),48 h后观察转染细胞绿色荧光蛋白表达效果.转染24、48、72 h后,以A组为对照采用MTT法测定B、C、D、E组细胞的存活率.转染48 h后,通过荧光定量PCR检测各组TREM-1 mRNA的表达水平并与转染前相比较.结果 经酶切和测序鉴定证实,目的 TREM-1基因shRNA1和shRNA2片段已被克隆到pGCsi载体中.荧光显微镜下,B、C、D、E组A549细胞有明显的绿色荧光蛋白表达.各时间点B、C、D、E组细胞存活率均达90%以上.A、B、C 3组转染前后TREM-1mRNA的表达水平差异无统计学意义,D、E组转染的重组质粒均能有效抑制A549细胞的TREM-1mRNA的表达([(1.945±0.252)×105比(1.010±0.194)×105,(1.933±0.216)×105比(1.202±0.171)×105,均P＜0.05],抑制率分别为48.07%和37.82%.结论 成功构建了靶向TREM-1基因的shRNA质粒表达载体,可有效抑制细胞中TREM-1目的 基因的表达,为后续脓毒症的基因治疗提供了依据.     

影响肺炎克雷伯菌粘附上皮细胞作用的研究

目的:研究不同理化及生物因素对肺炎克雷伯菌粘附宿主细胞的影响,探讨其粘附宿主细胞的可能机制。方法:用肺炎克雷伯菌临床分离株K.pnueumoniae 03183(K.p03183)建立粘附宿主细胞模型,通过结晶紫染色及扫描电镜观察其粘附效率;以不同理化及生物因素预处理K.p03183,平板菌落计数法观察上述因素对K.p03183粘附细胞的影响;用基因芯片技术,检测HMGN2蛋白预处理细菌对于其粘附相关基因表达的影响。结果:K.p03183可粘附至A549、T24、HeLa等3种上皮细胞系,其粘附率与E.coli 25992接近;氯化锂和盐酸胍、高碘酸钠及热预处理可明显降低K.p03183对于A549和T24的粘附率(P0.05);同时,胃蛋白酶及HMGN2蛋白预处理K.p03183,也可抑制其对A549和T24的粘附(P0.01);但胰蛋白酶预处理却能增加细菌对于A549细胞的粘附(P0.05);同时,HMGN2还可通过上调dksA基因表达,从而干扰细菌粘附细胞。结论:肺炎克雷伯菌可能借助细胞壁及其表面蛋白和碳水化合物等成分粘附至宿主上皮细胞,通过非共价键结合表面蛋白或消除碳水化合物成分,抑制细菌粘附至宿主细胞。     

附睾血管内皮生长因子基因慢病毒干扰载体的构建

目的：以血管内皮生长因子（VEGF）的mRNA 为靶点,设计、构建VEGF 的RNA干扰慢病毒载体,并 对其在大鼠附睾的沉默效果进行验证。 方法：构建3 种附睾VEGF-shRNA 慢病毒表达载体VEGF-shRNA-1、 VEGF-shRNA-2、VEGF-shRNA-3, 提取3 种阳性克隆质粒测序, 转染HEK293-T 细胞后产生慢病毒质粒。大鼠随 机分为空白对照组、NC-shRNA 阴性感染组、VEGF-shRNA-1 感染组、VEGF-shRNA-2 感染组、VEGF-shRNA-3 感染组,将病毒液分别注射到各组大鼠双侧附睾;实时荧光定量 PCR及蛋白免疫印迹检测各组大鼠附睾VEGF 的mRNA 及蛋白沉默效果。结果： 测序结果证明3 种慢病毒载体被包装成功。感染大鼠附睾后,VEGF 感染组 mRNA 及蛋白表达量均较阴性感染组和空白对照组明显降低,其中以VEGF-shRNA-3 感染组干扰效果更为有效。 结论：成功设计了VEGF 基因的RNA干扰靶点和制备了VEGF 基因的慢病毒载体,VEGF-shRNA-3 能有效抑制 附睾VEGF 的表达。     

细胞因子信号转导抑制因子1 RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定*☆

背景：以往关于细胞因子信号转导抑制因子1的研究多用脂质体或其他载体转染的技术,但存在效率低和安全性差等问题。 目的：构建细胞因子信号转导抑制因子1 RNA干扰慢病毒载体并进行鉴定。 方法：实验设计3组针对细胞因子信号转导抑制因子1的短发夹RNA序列,应用基因重组技术插入pPll3.7载体,测序正确的重组病毒质粒与包装质粒通过共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,感染A549细胞,western blot检测目的蛋白细胞因子信号转导抑制因子1在靶细胞中的表达。 结果与结论：实验通过对重组载体进行测序分析证实短发夹RNA插入慢病毒载体,慢病毒载体上清成功转染A549细胞后western blot检测结果显示该载体抑制了细胞因子信号转导抑制因子1蛋白在A549细胞有表达。说明实验成功构建了细胞因子信号转导抑制因子1 RNA干扰慢病毒载体。 关键词：细胞因子信号转导抑制因子1;慢病毒载体;RNA干扰;A549细胞;组织构建 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.07.030