高糖环境下VEGF与PEDF在GMC中表达及rAAV-AS基因的干预作用

目的 探讨高糖对大鼠肾小球系膜细胞(GMC)色素上皮细胞衍生因子(PEDF) 和血管内皮生长因子(VEGF)表达影响以及腺相关病毒介导血管抑素(rAAV-AS)基因的干预作用.方法 将培养的大鼠GMC株分为6组,高糖作为刺激因素,rAAV-AS 作为干预因素.分别设低糖组、高糖组、高糖加腺相关病毒(rAAV)组及高糖加rAAV-AS 治疗组.用免疫细胞化学及ELISA法测定各组系膜细胞PEDF 以及VEGF蛋白表达.结果 高糖可下调GMC中PEDF蛋白的表达,上调GMC中VEGF蛋白的表达.rAAV-AS可逆转高糖导致GMC的VEGF蛋白表达的增加及PEDF蛋白表达的降低.结论 rAAV-AS可以一定程度改善高糖诱导的VEGF和PEDF表达失衡而发挥对糖尿病肾病(DN)的保护作用.     

血管内皮生长因子对培养内皮细胞增殖和移行的影响

目的　研究低氧培养心肌细胞分泌出的血管内皮生长因子 (VEGF)蛋白对培养内皮细胞增殖和移行的影响。方法　将培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVECs)分为 4组 :正常对照组 ,低氧培养组 ,含VEGF的低氧培养心肌细胞分泌液组 (分泌液组 ) ,分泌液 +低氧培养组。分别采用流式细胞仪、免疫组织化学等方法检测VEGF对HUVECs细胞周期、增殖细胞核抗原表达、氚一亮氨酸掺入量及HUVECs移行的影响。结果　VEGF增加正常培养和低氧培养HUVECs由静止期 DNA合成前期向DNA合成期的转换 ,使DNA合成期及DNA合成后期 分裂期细胞数增加 ,从而促进HUVECs增殖 ,并使常氧和低氧培养HUVECs增殖细胞核抗原的表达、氚一亮氨酸掺入量及移行细胞数目增加。低氧抑制HUVECs的增殖和移行 ,VEGF可拮抗低氧对HUVECs增殖、移行的抑制作用。结论　低氧培养心肌细胞分泌出的VEGF蛋白不仅增加常氧培养HUVECs增殖、移行 ,而且能够拮抗低氧的抑制作用     

重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素对1型糖尿病大鼠肾脏TGF-β1和VEGF表达的影响

目的 尾静脉注射重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素(rAAV-AS),研究rAAV-AS在1型糖尿病大鼠肾脏中表达以及其对转化生长因子(TGF-β)1和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 清洁级SD雄性大鼠随机分为正常组(NC组,n=1 0),其余大鼠使用链脲佐菌素(STZ)60 mg/kg腹腔注射诱导糖尿病模型,分为糖尿病组(DM组,n=10),重组腺相关病毒空载体组(rAAV-0组,n=10),重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素组(AS组,n=10,2×1012 VG/kg)；尾静脉注射给药,8 w末,检测各组大鼠尿微量白蛋白变化,免疫印迹法检测肾组织中AS的表达以及TGF-β1和VEGF的表达.结果 DN组基本不表达AS,给予rAAV-AS治疗后,大鼠肾组织中AS表达明显增多(P＜0.05)；DN组的MAU、Glu、HbA1c明显增高,给予rAAV-AS治疗后,MAU明显降低(P＜0.05)；光镜:与NC组大鼠相比,DN组病变较明显:肾小球细胞数显著增多,毛细血管袢塌陷,管腔闭塞,肾小球明显体积增大,肾小球基底膜增厚、淋巴细胞数量增多,肾小管肿胀、变性、空泡形成,肾间质可见大量淋巴细胞和单核巨噬细胞浸润.rAAV-0组较DN组未见改善,AS组上述病变较DN组有改善,可见肾小球细胞数教多,毛细血管腔轻度狭窄,肾小管-间质见少量淋巴细胞浸润.免疫组化结果:DN组的TGF-β1和VEGF表达明显增多,rAAV-AS治疗后,TGF-β1和VEGF表达减少(P＜0.05).结论 重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素能在一定时间内在肾组织中表达；重组腺相关病毒载体介导的人血管抑素对大鼠糖尿病肾病具有保护作用,且这种保护作用可能通过降低TGF-β1和VEGF的表达.     

正五聚蛋白3对血管紧张素Ⅱ刺激后血管内皮细胞凋亡及血管活性物质分泌的影响

目的探讨正五聚蛋白(PTX)3对血管紧张素(Ang)Ⅱ刺激后的血管内皮细胞(HUVECs)凋亡及血管活性物质分泌的影响。方法以10~(-7) mol/L AngⅡ刺激体外培养的HUVECs 0、12、24和48 h后,Western印迹检测HUVECs中PTX3蛋白的表达。利用Lipofectamine2000将PTX3 siRNA转染至HUVECs,Western印迹检测其转染效果。将HUVECs随机分为空白组(未做任何处理)、AngⅡ组(10~(-7)mol/L AngⅡ刺激)、AngⅡ+siNC组(转染阴性对照序列后,给予10~(-7) mol/L AngⅡ刺激)和AngⅡ+siPTX3组(转染PTX3 siRNA后,给予10~(-7)mol/L AngⅡ刺激),噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞仪检测各组细胞的凋亡,实时聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组细胞中血管活性物质内皮素(ET)-1和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达。结果随着AngⅡ刺激时间的延长,PTX3蛋白表达水平显著升高。转染PTX3 siRNA后成功下调了AngⅡ引起的PTX3表达。AngⅡ刺激可引起HUVECs增殖减弱,凋亡增强,ET-1和iNOS mRNA表达升高;下调PTX3表达能够减弱AngⅡ引起的HUVECs损伤,促进HUVECs增殖,抑制凋亡,并下调ET-1和iNOS mRNA表达。结论 PTX3在AngⅡ刺激后HUVECs中表达升高,下调其表达可抑制AngⅡ诱导的细胞凋亡及血管活性物质的分泌。     

缺氧条件下血管活性因子对血管内皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响

目的　探讨在缺氧条件下人脐静脉血管内皮细胞血管内皮生长因子 (VEGF)表达及缩血管活性物质内皮素 ,舒血管活性物质NO和NO抑制剂LNNA对VEGF基因表达的影响。方法　体外培养人脐静脉血管内皮细胞 ,经缺氧及血管活性物质处理 ,Northern杂交、酶联免疫检测和计算机图像分析等观察VEGFmRNA和蛋白表达水平。结果　缺氧 6h内皮细胞可见VEGF表达。ET可促进VEGFmRNA的表达 ,NO可明显抑制VEGFmRNA的表达 ,NO抑制剂LNNA也影响VEGFmRNA的表达。ELISA检测VEGF蛋白水平分别为 6h组 (8 2± 1 1) μg/L ,ET +6h组 (9 37± 1 0 2 ) μg/L ,NO +6h组 (2 86± 0 91) μg/L ,LNNA +6h组 (14 75± 1 87)μg/L。 结论　缺氧可诱导人脐静脉血管内皮细胞分泌VEGF并受血管活性物质的调控 ,ET促进其表达 ,NO抑制其表达。     

大黄酸对肿瘤坏死因子-α诱导的脐静脉内皮细胞黏附作用影响的观察

目的 观察不同剂量的大黄酸(Rhein)对TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)黏附作用的影响. 方法 将HUVECs分为单纯HUVECs组、单纯TNF-α 40 ng/ml(TNF-α)组、Rhein100 μg/ml+TNF-α 40 ng/ml(Rhein100)组、Rhein 50 μg/ml+TNF-α 40 ng/ml(Rhein50)组、Rhein 10 μg/ml+TNF-α 40 ng/ml (Rhein10)组.采用Western blot和RT-PCR检测HUVECs细胞间黏附因子-1(ICAM-1)的蛋白和mRNA的水平.采用人单核细胞株(THP-1)和HUVECs的黏附性实验检测内皮细胞的黏附功能. 结果 与TNF-α组比较,Rhein100、Rhein50、Rhein10组ICAM-1蛋白相对表达量下降[(2.88±0.04)vs(1.27±0.32),(1.28±0.17),(1.32±0.25),P＜0.05或P＜ 0.01];Rhein100和Rhein50组ICAM-1 mRNA的水平下降[(2.12±0.24)vs(1.19±0.17),(1.26±0.23),P＜0.05或P＜0.01];在黏附性实验中,Rhein100组HUVECs所黏附的单核细胞数目下降[(1.28±0.07)vs(1.07±0.14),P＜0.01]. 结论 Rhein能抑制TNF-α所诱导的HUVECs的ICAM-1的过度表达,可能是Rhein对HUVECs的保护机制之一.     

高糖上调内皮细胞间黏附分子1和血管细胞黏附分子1表达的作用机制

目的探讨高糖上调内皮细胞间黏附分子1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子1(VCAM-1)表达的作用机制。方法高浓度葡萄糖(20mmol/L)处理分离培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs),以2′-7′-二氯荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)标记流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)。Western blot分析细胞内抑制性蛋白κB(IκB)和核转录因子-κB(NF-κB)蛋白表达和磷酸化水平。免疫荧光法检测NF-κB的活化。结果高糖处理HUVECs后,伴随ROS的显著升高,IκB蛋白明显下调,磷酸化的IκB和NF-κB均增多,使NF-κB移位至细胞核内,导致ICAM-1、VCAM-1的表达明显增强。结论高糖通过刺激ROS的产生和NF-κB的活化上调内皮细胞ICAM-1和VCAM-1黏附因子的表达。     

TGIF2对高糖诱导的血管内皮细胞生物学行为的影响

目的探讨同源异型结构域蛋白转化生长影响因子(TGIF)2对高糖诱导的血管内皮细胞生物学行为的影响。方法将培养的人脐静脉内皮(HUVECs)细胞分为对照组(未处理)、高糖组(葡萄糖处理)、空载体阴性对照质粒(NC)高糖组(葡萄糖+转染NC质粒)和TGIF2高糖组(葡萄糖+转染psiC HECK2-TGIF2 3'-UTR质粒),处理24 h和48 h后,以3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测细胞增殖;处理48 h后,以RT-PCR和Western印迹检测各组细胞中TGIF2 mRNA和蛋白表达,Transwell法检测细胞迁移,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果与对照组相比,高糖组、NC高糖组和TGIF2高糖组HUVECs细胞中TGIF2 mRNA和蛋白表达水平、细胞活力、迁移能力均显著降低,凋亡率显著升高(P0.05);与高糖组相比,TGIF2高糖组中TGIF2 mRNA和蛋白表达、细胞活力、迁移能力显著升高,细胞凋亡率显著降低(P0.05)。结论高糖诱导下,TGIF2在血管内皮细胞中表达下降,上调其表达对高糖诱导的血管内皮细胞增殖、迁移和凋亡具有一定的保护作用。     

蛋白激酶Cβ_2通过调控PPARα介导高糖诱导的人内皮细胞损伤

目的 研究蛋白激酶C(PKC)β_2、PPARα在高糖诱导入脐静脉内皮细胞(HUVECs)表达血管内皮生长因子(VEGF)、血管细胞黏附分子1(VCAM-1)mRNA中的作用及相互关系.方法 将培养的HUVECs分为以下8组:正常糖(NG,5 mmol/L D-葡萄糖)组、高糖(HG,25 mmol/L D-葡萄糖)组、渗透压对照(L,NG+20 mmol/L L-葡萄糖)组、正常糖卒载体转染(NN,NG+Ad5-null)组、高糖PKCβ_2转染(HB,HG+Ad5-PKCβ_2)组、高糖+非诺贝特(HF,HG+40 μmol/L非诺贝特)组、高糖PKCβ_2转染+非诺贝特(HBF,HB+40μmol/L非诺贝特)组,另以非诺贝特共孵育20 min作为HF20组,以上各组细胞均培养6 d.以RT-PCR 检测VEGF、VCAM-1 mRNA的表达水平,用Western印迹法测定PPARα蛋白表达,采用激光共聚焦检测PKCβ_2蛋白的表达和转位.结果 (1)HG组VEGF、VCAM-1 mRNA表达增加,分别为NG组的1.91倍和1.56倍(均P<0.05);HB组VEGF、VCAM-1 mRNA表达较HG组进一步增加,分别为NG组的2.59倍和2.07倍(均P<0.05).HF组VEGF、VCAM-1 mRNA表达则明显下调,分别为HG组的68%和74%(均P<0.05);与HG组相比,HF20组VEGF、VCAM-1 mRNA表达差异无统计学意义.(2)HG组PPARa蛋白表达较NG组减少了20%,HB组PPARα蛋白水平进一步下降,为HG组的78%,与HG组相比,HF组PPARα蛋白水平上调了13%(P<0.05).(3)HG诱导PKCβ_2核转位激活,定量分析示HG组浆/核荧光强度比值较NC组降低37%(P<0.05),HB组PKCβ_2核转位与HG组相比更加明显.结论 高糖通过诱导HUVECs PKCβ_2核转位,进而调控PPARα表达,增加VEGF、VCAM-1 mRNA的表达.     

PGC-1α对高糖诱导的血管内皮细胞内ROS生成的影响

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活因子1α（PGC-1α）对高糖诱导的血管内皮细胞内活性氧簇（ROS）生成的影响。方法将人脐带静脉内皮细胞（HUVECs）分成对照组、空病毒Ad组、d-PGC-1α感染组、PGC-1αsiRNA转染组,分别将四组细胞置于正常糖及高糖环境中进行培养。用活性氧检测试剂盒处理标本,以酶标仪检测细胞内荧光强度,显示细胞内ROS浓度。结果高糖组HUVECs内ROS浓度明显高于正常糖组（P〈0.01）;与对照组及空病毒Ad组比较,d-PGC-1α感染组ROS浓度明显降低,PGC-1αsiRNA转染组明显升高（P均〈0.01）。结论与正常糖组比较,高糖组HUVECs内ROS浓度明显升高;过度表达PGC-1α蛋白后,HUVECs内ROS浓度明显降低;抑制细胞内PGC-1α蛋白表达,则HUVECs内ROS浓度明显升高。提示PGC-1α可作为防治糖尿病血管并发症的新靶点之一。     

Regulation of vascular endothelial growth factor by melatonin in human breast cancer cells

Melatonin exerts oncostatic effects on breast cancer by interfering with the estrogen‐signaling pathways. Melatonin reduces estrogen biosynthesis in human breast cancer cells, surrounding fibroblasts and peritumoral endothelial cells by regulating cytokines that influence tumor microenvironment. This hormone also exerts antiangiogenic activity in tumoral tissue. In this work, our objective was to study the role of melatonin on the regulation of the vascular endothelial growth factor (VEGF) in breast cancer cells. To accomplish this, we cocultured human breast cancer cells (MCF‐7) with human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). VEGF added to the cultures stimulated the proliferation of HUVECs and melatonin (1 mm ) counteracted this effect. Melatonin reduced VEGF production and VEGF mRNA expression in MCF‐7 cells. MCF‐7 cells cocultured with HUVECs stimulated the endothelial cells proliferation and increased VEGF levels in the culture media. Melatonin counteracted both stimulatory effects on HUVECs proliferation and on VEGF protein levels in the coculture media. Conditioned media from MCF‐7 cells increased HUVECs proliferation, and this effect was significantly counteracted by anti‐VEGF and 1 mm melatonin. All these findings suggest that melatonin may play a role in the paracrine interactions between malignant epithelial cells and proximal endothelial cells through a downregulatory action on VEGF expression in human breast cancer cells, which decrease the levels of VEGF around endothelial cells. Lower levels of VEGF could be important in reducing the number of estrogen‐producing cells proximal to malignant cells as well as decreasing tumoral angiogenesis.     

VEGF对体外培养的脐静脉内皮细胞增殖和迁移能力的影响

目的探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）对体外培养的脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖和迁移能力的影响。方法以VEGF基因转染HUVECs和在培养液中加入VEGF蛋白后培养HUVEC,用RT-PCR法检测VEGF mRNA的表达鉴定转染的效果,用3H-TdR掺入法检测VEGF对HUVECs增殖的影响,用划痕实验观察VEGF对HUVECs迁移能力的影响。结果转染VEGF基因的HUVECs中VEGFmRNA的表达高于对照组,表明转染成功。3H-TdR掺入法和划痕实验显示,转染VEGF基因和在培养液中加入VEGF蛋白,都可促进体外培养的HUVECs增殖和迁移。结论VEGF能够促进体外培养的HUVECs增殖和迁移;将VEGF基因导入细胞与直接在培养基中加入VEGF蛋白具有相同的效果。     

ERK1/2信号通路在内皮微粒诱导人脐静脉内皮细胞ICAM-1表达中的作用

目的:探讨细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）信号通路在内皮微粒（EMPs）诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）表达细胞间黏附分子-1（ICAM-1）中的作用。方法:体外培养HUVECs,选取生长良好的第4～5代细胞,分为EMPs不同浓度作用组、EMPs不同时间作用组及ERKl/2特异性抑制剂组。应用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测ICAM-1和磷酸化ERK1/2蛋白的表达。用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测ICAM-1 mRNA的表达。结果:EMPs作用HUVECs后,ICAM-1 mRNA和其蛋白以及磷酸化ERK1/2蛋白的表达显著高于对照组,且呈浓度和时间依赖性的关系（均P<0.01）;而ERKl/2特异性抑制剂PD98059对ICAM-1 mRNA和其蛋白以及磷酸化ERK1/2蛋白的表达,均有明显的抑制作用（均P<0.01）。结论:EMPs可诱导HUVECs中ICAM-1表达,其机制可能与激活ERK1/2信号通路有关。     

p38信号通路在内皮细胞微粒诱导人脐静脉内皮细胞表达细胞间黏附分子-1中的作用

目的观察p38信号通路（P38MAPK）在内皮细胞微粒（EMPs）诱导人脐静脉内皮细胞（HU—VECs）表达细胞间黏附分子-1（ICAM-1）中的作用。方法将体外培养的HUVECs随机分组：①EMPs不同时点观察组：用EMPs（终浓度105／m1）分别刺激细胞0、3、6、12、24h;②EMPs不同剂量作用组：分别用终浓度为0、10^2、10^3、10^4、10^5／ml的EMPs刺激细胞24h;③EMPs＋p38MAPK特异性抑制剂SB203580组：在EMPs（终浓度10^5／ml）刺激前,与终浓度为5μmol／L的SB203580共同孵育30min。用蛋白免疫印迹法（Western blot）测定p38MAPK磷酸化表达,实时荧光定量PCR测定ICAM—1mRNA的表达。结果EMPs可激活p38MAPK,使磷酸化p38MAPK蛋白表达量及ICAM—1mRNA表达量增加,且呈剂量和时间依赖性。p38MAPK特异性拈抗剂SB203580可显著抑制EMPs的此作用。结论p38信号通路可能部分参与了对EMPs诱导HUVECs表达ICAM-1的调控。     

Melatonin prevents human pancreatic carcinoma cell PANC-1-induced human umbilical vein endothelial cell proliferation and migration by inhibiting vascular endothelial growth factor expression

Abstract: Melatonin is an important natural oncostatic agent, and our previous studies have found its inhibitory action on tumor angiogenesis, but the mechanism remains unclear. It is well known that vascular endothelial growth factor (VEGF) plays key roles in tumor angiogenesis and has become an important target for antitumor therapy. Pancreatic cancer is a representative of the most highly vascularized and angiogenic solid tumors, which responds poorly to chemotherapy and radiation. Thus, seeking new treatment strategies targeting which have anti‐angiogenic capability is urgent in clinical practice. In this study, a co‐culture system between human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and pancreatic carcinoma cells (PANC‐1) was used to investigate the direct effect of melatonin on the tumor angiogenesis and its possible action on VEGF expression. We found HUVECs exhibited an increased cell proliferation and cell migration when co‐cultured with PANC‐1 cells, but the process was prevented when melatonin added to the incubation medium. Melatonin at concentrations of 1 μm and 1 mm inhibited the cell proliferation and migration of HUVECs and also decreased both the VEGF protein secreted to the cultured medium and the protein produced by the PANC‐1 cells. In addition, the VEGF mRNA expression was also down‐regulated by melatonin. Taken together, our present study shows that melatonin at pharmacological concentrations inhibited the elevated cell proliferation and cell migration of HUVECs stimulated by co‐culturing them with PANC‐1 cells; this was associated with a suppression of VEGF expression in PANC‐1 cells.     

胰高血糖素样肽-1抗动脉粥样硬化的效果和机制研究

目的 探索胰高血糖素样肽（GLP）-1对氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤的作用及机制。方法 将体外培养HUVECs分为对照组（无处理）和GLP-1预处理组（分别给予0、2.5、5和10 nmol/L GLP-1预处理24 h后,再以100 μg/ml ox-LDL氧化24 h）。应用MTT法检测细胞生存率,评估GLP-1在ox-LDL诱导HUVECs损伤中的作用;应用免疫荧光技术评估GLP-1在ox-LDL诱导单核细胞对HUVECs的黏附的影响;应用ELISA法检测HUVECs在接受ox-LDL和GLP-1处理后E-选择素,细胞间黏附分子（ICAM）-1、血管细胞黏附分子（VCAM）-1的分泌,并应用RT-PCR法检测E-选择素、ICAM-1、VCAM-1基因表达。结果 MTT试验显示（2.5、5和10 μmol/L）的GLP-1均可降低ox-LDL对HUVECs的杀伤作用,保护作用与浓度呈正相关（P<0.05）;免疫荧光检测结果显示,GLP-1可以降低单核细胞对ox-LDL损伤HUVECs的黏附作用,且和浓度呈正相关（P<0.05）。GLP-1处理后的ICAM-1、VCAM-1及E-选择素的表达和分泌均有显著下降（均有P<0.05）。结论 GLP-1可能通过对抗HUVECs氧化损伤,下调ICAM-1、VCAM-1和E-选择素的表达与分泌,减少单核细胞趋化和黏附,发挥抗动脉粥样硬化作用。     

溶血磷脂酰胆碱对人脐静脉内皮细胞血管紧张素系统的影响

目的 观察溶血磷脂酰胆碱（Lysophosphatidyl choline,LPC）对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）血管紧张素系统的影响。方法 体外培养HUVECs,分为正常对照组、低浓度（10μg/L）LPC 组、中浓度（20μg/L）LPC 组和高浓度（40 μg/L）LPC 组。采用放射免疫法和RT-PCR 法检测LPC 对HUVECs 血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,AngⅡ）蛋白及AngⅡ 1 型受体（AngiotensinⅡ type1 receptor,AT1R）、AngⅡ 2 型受体（AngⅡ type2 receptor,AT2R）mRNA 表达的影响。结果 与正常对照组相比,LPC 可显著上调HUVECs AngⅡ蛋白及AT1R mRNA 的表达。结论 LPC 能够上调人脐静脉内皮细胞血管紧张素系统部分组分的表达。