糖尿病的基因治疗技术：大鼠胰岛素原基因真核细胞表达质粒构建与鉴定

目的：构建大鼠胰岛素原基因的真核细胞表达质粒pCMV／proinsulin并进行序列测定。方法：实验选用雄性SD大鼠1只，从大鼠胰腺组织中提取总RNA，通过RT-PCR法获得胰岛素原基因cDNA全长序列，并采用现代分子生物学技术，借助真核细胞表达质粒pCMV-Script vector具有多克隆酶切位点的特点，选择适当的限制性酶切位点(EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ)，并使大鼠胰岛素原基因cDNA两端带有相同的酶切位点，利用其黏性末端进行定向克隆，从而将大鼠胰岛素原基因准确地插入到表达质粒pCMV上。结果：经RT-PCR法扩增并通过DNA核酸序列测定获得大鼠胰岛素原基因。经PCR法及酶切法初步筛选阳性克隆重组子，并进一步进行DNA核酸序列测定(双脱氧末端终止法)，确定其序列与目的基因序列完全一致。结论：成功构建重组质粒pCMV／proinsulin，为进一步进行胰岛素原基因转染糖尿病大鼠和非胰岛β细胞，使之产生胰岛素、建立类胰岛β细胞系的研究奠定了扎实的基础。     

胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒构建及在大鼠脊髓内的表达

目的：构建胰岛素样生长因子1的真核细胞表达质粒，分析pcDNA3．1-hIGF-1体内转基因的町行性。方法：实验于2004—06／09在吉林大学基础医学院动物实验室完成。①选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只，随机数字表法分为胰岛素样生长因子1组、模型对照组、正常对照组，4只／组。②聚合酶链法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出胰岛素样生长因子1cDNA，然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3．1中，酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的人源性胰岛素样生长因子基因序列。③胰岛素样生长因子1组应用直接注射法将阳离子脂质体和pcDNA3．1-hIGF1混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中；模型对照组注射等剂量pcDNA3．1和阳离子脂质体混合液。正常对照组未作任何处理。1周后应用免疫组化法观察人源性胰岛素样生长因子在大鼠脊髓中的表达。结果：实验选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只，全部进入结果分析。①聚合酶链反应片段鉴定结果：琼脂糖电泳显示，扩增带大小与预期的人源性胰岛素样生长因子cDNA相同。②重组的真核表达质粒的鉴定结果：酶切鉴定显示，重组的真核细胞表达质粒pcDNA3．1-hOGF-1所含的IGF—1cDNA序列和插入方向均正确。③基因转染后各组胰岛素样生长因子1免疫组化测定结果：基因转染1周后，胰岛素样生长因子1组脊髓组织内阳性细胞数明显高于模型对照组和正常对照组（48．2&;#177;5.3,29．3&;#177;4．2，23．8&;#177;8．3，P〈0．01）。结论：阳离子脂质体介导pcDNA3．1-hIGF1体内转基因的方法是可行的。     

胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒构建及在大鼠脊髓内的表达

目的:构建胰岛素样生长因子1的真核细胞表达质粒,分析pcDNA3.1-hIGF-1体内转基因的可行性。方法:实验于2004-06/09在吉林大学基础医学院动物实验室完成。①选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只,随机数字表法分为胰岛素样生长因子1组、模型对照组、正常对照组,4只/组。②聚合酶链法从人的肝细胞cDNA文库中克隆出胰岛素样生长因子1cDNA,然后定向插入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,酶切电泳和基因测序鉴定插入质粒的人源性胰岛素样生长因子基因序列。③胰岛素样生长因子1组应用直接注射法将阳离子脂质体和pcDNA3.1-hIGF1混合后转染至大鼠胸段脊髓组织中;模型对照组注射等剂量pcDNA3.1和阳离子脂质体混合液。正常对照组未作任何处理。1周后应用免疫组化法观察人源性胰岛素样生长因子在大鼠脊髓中的表达。结果:实验选取清洁级成年雄性Wistar大鼠12只,全部进入结果分析。①聚合酶链反应片段鉴定结果:琼脂糖电泳显示,扩增带大小与预期的人源性胰岛素样生长因子cDNA相同。②重组的真核表达质粒的鉴定结果:酶切鉴定显示,重组的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-hIGF-1所含的IGF-1cDNA序列和插入方向均正确。③基因转染后各组胰岛素样生长因子1免疫组化测定结果:基因转染1周后,胰岛素样生长因子1组脊髓组织内阳性细胞数明显高于模型对照组和正常对照组(48.2±5.3,29.3±4.2,23.8±8.3,P<0.01)。结论:阳离子脂质体介导pcDNA3.1-hIGF1体内转基因的方法是可行的。     

2型糖尿病的发病易感基因

目的:综合分析2型糖尿病的易感基因,从基因水平阐明2型糖尿病的发生发展过程,为病因学研究提供证据。资料来源:应用计算机检索Pubmed1995-01/2005-02有关2型糖尿病遗传学及其基因扫描的文章,检索词“Type2DiabetesMellitus,genetics,association,genescan,predisposinggenes”,并限定文章语言种类为English。资料选择:对检索到的有关2型糖尿病遗传学及其基因扫描的相关信息进行整理,选取针对性强的文章,同一领域的文献则选择近期发表或权威杂志的文章。资料提炼:共检索到的2型糖尿病遗传学及基因扫描的相关文献47篇,其中15篇符合要求,排除32篇。资料综合:2型糖尿病的发病机制复杂,目前尚未完全阐明。目前对2型糖尿病的研究策略主要有两种:①基因组扫描与连锁分析。②候选基因策略的遗传关联研究:包括与糖代谢、脂代谢及其他路径关联的易感基因。结论:寻找2型糖尿病易感基因的策略主要有基因扫描、连锁分析和遗传学关联研究。近年来,应用这些遗传学分析方法发现了一些与2型糖尿病易感性关联的染色体区域和基因,并取得了很大的进步。     

EGFL7原核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建类表皮生长因子域7（EGFL7）原核表达载体,并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。【方法】以人肝癌细胞系 HepG2总RNA为模板,PCR扩增 EGFL7基因,克隆至原核表达载体pET‐21a（＋）中,转化大肠杆菌 BL21（DE3）,IPTG 诱导表达。 His‐tag 磁珠纯化重组蛋白 EGFL7,SDS‐PAGE 鉴定。【结果】克隆目的基因序列正确,未发生碱基突变;重组表达质粒pET21a（＋）‐TRX‐EGFL7经双酶切鉴定构建正确;表达的重组蛋白相对分子量为80 kD ,与预期相符。【结论】成功在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化了EGFL7重组蛋白,为后续研究奠定了基础。     

初次诊断2型糖尿病真胰岛素、胰岛素原及其比值的测定

目的：探讨测定初次诊断的2型糖尿病患者真胰岛素、胰岛素原及其比值的临床意义。方法：对90例受试者进行OGTT实验,并将他们分为初次诊断的（DM）、糖耐量减低（IGT）及糖耐量正常（NGT）三组,分别测定受试者空腹胰岛素原免疫反应性胰岛素、真胰岛素。结果：IGT组的真胰岛素、胰岛素原显著高于糖耐量正常组。初次诊断的2型糖尿病组的真胰岛素、胰岛素原显著高于糖耐量正常组。结论：2型糖尿病空腹胰岛素原与真胰岛素比值的升高是胰岛β细胞分泌功能分泌受损的标志。     

四种乙肝核酸疫苗质粒的构建及在真核细胞中的表达

目的:构建四种乙肝核酸疫苗质粒pCI/S、pCI/S2S、pCI/S1S2S、pCI/S2SS2,并检测其转染真核细胞后的蛋白表达。方法:从慢性乙肝患者的混合血清中制备HBV DNA模板,分别扩增和连接,得到四个基因片段S、S2S、S1S2S、S2SS2,与pCI载体进行连接,得到四个重组质粒pCI/S、pCI/S2S、pCI/S1S2S、pCI/S2SS2,将其分别转染SP2/0细胞,检测目的抗原蛋白的表达情况。结果:四种重组质粒转染细胞后,裂解液中均可检测出目的抗原蛋白的表达。结论:所构建的四种重组质粒均能在哺乳动物细胞内表达相应的目的抗原蛋白,可用于下一步动物实验。     

重组人胰岛素原的克隆表达及其在1型糖尿病检测中的初步应用

目的 构建人胰岛素原原核表达载体,诱导表达获得重组蛋白,并初步验证重组人胰岛素原在1型糖尿病胰岛素自身抗体检测中的价值.方法 采用PCR逐步合成法获得目的 基因,构建原核表达质粒pBVIL1/INS,转化大肠埃希菌E.coli HB101,诱导表达获得纯化重组蛋白,用重组蛋白作为包被抗原,初步建立检测胰岛素自身抗体的ELISA方法.结果 获得了可被1型糖尿病患者血清识别的重组人胰岛素原.以重组人胰岛素原作为包被抗原初步建立的ELISA方法,其敏感度和特异度分别为54.5%和100%.结论 重组人胰岛素原具有良好的抗原性,可作为1型糖尿病患者辅助诊断试剂的候选抗原.     

2型糖尿病的发病易感基因

目的：综合分析2型糖尿病的易感基因，从基因水平阐明2型糖尿病的发生发展过程，为病因学研究提供证据。 资料来源：应用计算机检索Pubmed 1995—01／2005—02有关2型糖尿病遗传学及其基因扫描的文章，检索词“Type 2 Diabetes Mellitus．genetics．association，genescan，predisposing genes”，并限定文章语言种类为English。 资料选择：对检索到的有关2型糖尿病遗传学及其基因扫描的相关信息进行整理，选取针对性强的文章，同一领域的文献则选择近期发表或权威杂志的文章。 资料提炼：共检索到的2型糖尿病遗传学及基因扫描的相关文献47篇，其中15篇符合要求，排除32篇。 资料综合：2型糖尿病的发病机制复杂，目前尚未完全阐明。目前对2型糖尿病的研究策略主要有两种：①基因组扫描与连锁分析。②候选基因策略的遗传关联研究：包括与糖代谢、脂代谢及其他路径关联的易感基因。 结论：寻找2型糖尿病易感基因的策略主要有基因扫描、连锁分析和遗传学关联研究。近年来，应用这些遗传学分析方法发现了一些与2型糖尿病易感性关联的染色体区域和基因，并取得了很大的进步。     

重组质粒pEGFP-Brn-4的构建与鉴定

目的构建神经同源盒基因Brn-4真核表达重组质粒。方法从新生SD大鼠脑组织提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的方法扩增编码鼠Brn-4的基因片段,应用基因重组技术将鼠Brn-4基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C2中,经BamHI、EcoRⅠ双酶切和单酶切证实所构建的载体。结果 RT-PCR方法获得鼠Brn-4的基因片段,限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子。结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4通过鉴定,结构正确,为后续研究在神经干细胞中表达及其体内研究奠定了基础。     

转化生长因子β1基因克隆及重组真核表达质粒的构建

背景：通过基因转移方法研究某一外源性基因在细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段，与病毒载体相比，应用DcDNA4．0-TGF-β1真核表达质粒的转染方法无遗传毒性和细胞毒性，有更高的安全性。目的：通过克隆转化生长因子β1基因，观察构建重组转化生长因子β1基因真核表达质粒的可行性。设计、时间及地点：以细胞为观察对象的体外实验，于200703／2008—02在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。材料：2月龄清洁级健康SD大鼠，雌雄不拘，用于分离细胞中RNA。方法：从大鼠骨髓细胞中分离提取转化生长因子B1的mRNA，反转录聚合酶链反应扩增后，克隆入pGEM—T载体，PCR鉴定重组子；酶切下目的基因转化生长因子B1，再亚克隆入载体pcDNA4．0质粒，酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析。主要观察指标：TGF-β1 cDNA、pGEM—T—TGF-β1和重组子pcDNA4．0-TGF—β1的表达。结果：经过反转录一聚合酶链反应扩增得到TGF-β1 cDNA条带；PCR扩增鉴定得到pGEM—T—TGF-β1。酶切鉴定得到亚克隆重组子pcDNA4．0-TGF-β1，经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致。结论：成功克隆大鼠转化生长因子β1基因，并构建出重组转化生长因子β1真核表达载体。     

大鼠Delta1基因真核表达载体的构建与鉴定

背景:最近有数据表明,Notch信号通路在外周移植免疫应答反应中发挥重要的调节作用,可以促进调节性T的分化,诱导抗原特异性的免疫耐受.推测Notch/Notch配体可能在MHC:TCR界面发挥作用.目的:构建大鼠Deltal基因(Notch配体)真核表达载体,并观察其在树突状细胞中的表达.方法:应用RT-PCR方法从大鼠骨髓细胞中获得全长Delta1基因片段,并将此基因片段构建在pcDNA3.1(+)真核表达载体上.利用脂质体基因转染技术将含大鼠Delta1基因片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1转染入树突状细胞中,观察Delta1基因在树突状细胞中的表达.结果与结论:双酶切鉴定结果显示,Delta1已成功构建在pcDNA3.1的Hindlll和Xbal双酶切位点之间,任选一个酶切阳性克隆pcDNA3.1/Deltal送上海生工生物公司进行序列测定,测序结果与Genebank中Delta1基因序列完全一致,阅读框正确.转染Delta1基因的树突状细胞形态与其亲本细胞类似,蛋白免疫印迹法检测到细胞内Deltal的表达显著增高.实验成功利用基因转染方法将Delta1基因导入树突状细胞,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/Delta1,并使之高效表达并分泌Delta1蛋白.     

MeCP2特异性shRNA真核细胞表达质粒的构建与鉴定

目的构建MeCP2特异性SiRNA表达质粒pSilence-MeCP2.方法根据人MeCP2 mRNA序列设计作用靶序列,化学合成两条互补的DNA寡核苷酸链,该序列中包含靶序列正义链、反义链,两者间的连接序列及与质粒相匹配的酶切位点序列,连接质粒后转化感受态细胞(E.Coli),使其在大肠杆菌内大量复制,提取质粒,PCR鉴定.结果合成的寡核苷酸序列与要求的序列完全相符,且以正确的方向插入.结论成功构建两个MeCP2特异性SiRNA表达质粒psilence-MeCP2/I和psilence-MeCP2/Ⅱ.     

MeCP2特异性shRNA真核细胞表达质粒的构建与鉴定

目的构建MeCP2特异性SiRNA表达质粒pSilence-MeCP2。方法根据人MeCP2mRNA序列设计作用靶序列,化学合成两条互补的DNA寡核苷酸链,该序列中包含靶序列正义链、反义链,两者间的连接序列及与质粒相匹配的酶切位点序列,连接质粒后转化感受态细胞(E.Coli),使其在大肠杆菌内大量复制,提取质粒,PCR鉴定。结果合成的寡核苷酸序列与要求的序列完全相符,且以正确的方向插入。结论成功构建两个MeCP2特异性SiRNA表达质粒psilence-MeCP2/Ⅰ和psilence-MeCP2/Ⅱ。     

Perspectives on postgenome medicine: Gene therapy for diabetes mellitus

Several topics in diabetes research and practice in the coming 'post-genomic era' are described. 1) Insulin-producing pancreatic beta cells are a plausible target of gene therapy for type 1 diabetes mellitus. Functional genomics will reveal the mechanism of beta cell growth and regeneration. Attempts are being made to differentiate non-beta cells(including ES cells) into insulin-producing cells in vitro or in vivo. 2) Very recently, an intron variation in calpain 10 gene was found to be associated with type 2 diabetes, which confirmed the importance of SNPs in common diseases. More and more SNPs related to type 2 diabetes will be discovered and, in combination with pharmacogenomics, 'personalized medicine' based on SNP information of the individuals will hopefully be achieved.     

构建血红素氧合酶1基因真核表达质粒及在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达

目的：克隆血红素氧合酶1基因并构建其真核表达重组质粒，进一步检测血红素氧合酶1基因转染大鼠主动脉平滑肌细胞及其表达目的蛋白的效果。 方法：实验于2007-02／12在泸州医学院中心试验室完成。取雄性健康成年SD大鼠1只，腹腔注射氯化汞（1mg／kg）24h后，麻醉状态下取肾脏，从大鼠肾组织中提取总RNA，通过反转录-聚合酶链反应扩增大鼠血红素氧合酶1基因片段，并将其克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，运用脂质体将重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1转染主动脉平滑肌细胞，通过反转录-聚合酶链反应和Western blot分析血红素氧合酶1基因细胞转染及表达的效果。 结果：经双酶切及测序鉴定证明，正确克隆了血红素氧合酶1基因并成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。反转录-聚合酶链反应及Western blot分析显示血红素氧合酶1基因能成功转染主动脉平滑肌细胞并在mRNA水平和蛋白水平有效表达。 结论：①成功构建血红素氧合酶1基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-HO-1。②脂质体包裹重组质粒瞬时成功转染到体外培养的主动脉平滑肌细胞并得到有效表达。     

大鼠半乳凝素9基因克隆及真核表达载体的构建

背景:研究提示,半乳凝素9在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控方面发挥作用,但其作用机制尚不明确.目的:克隆大鼠半乳凝素9基因片段,构建pDC316-GFP-Galectin-9真核表达质粒,以进一步了解半乳凝素9各种功能和反应机制,设计、时间及地点:单一样本观察,于2008-11/2009-01在北京本元正阳基因技术有限公司完成.材料:SPF级雄性Lewis大鼠1只.方法:采用反转录聚合酶链反应技术,从大鼠肝脏组织中扩增出大鼠半乳凝素9基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组到pDC316-GFP真核表达载体上,构建pDC316-GFP-Galectin-9重组质粒,通过用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组DNA进行鉴定.主要观察指标:重组质粒的鉴定结果.结果:总RNA经RT-PCR扩增后,经琼脂糖凝胶电泳,在1 kb下方可见一条明显扩增的条带,与预计的半乳凝素9-cDNA长度相符.重组质粒经Not Ⅰ/HindⅢ双酶切和未作酶切的重组质粒pDC316-GFP-Galectin-9一起经琼脂糖凝胶电泳,前者出现了980 bp和5.8 kb 2条带(980 bp为Galectin-9-cDNA产物,5.8 kb为pDC316-GFP线状质粒),后者出现6.7 kb条带(重组质粒pDC316-GFP-Galectin-9),初步表明重组质粒构建成功.测序结果用NCBI上的BLAST进行比对分析,其核酸序列与GeneBank中的半乳凝素9的mRNA的编码序列(N M_012977)同源性完全相符,进一步证实所克隆的基因为大鼠半乳凝素9-cDNA.结论:成功克隆了半乳凝素9基因并构建成其真核表达质粒.     

干细胞治疗糖尿病的研究现状及未来

目的:综述干细胞治疗糖尿病的研究现状及未来发展。资料来源:应用计算机检索Pubmed2000-01/2006-11有关干细胞治疗糖尿病方面文献,检索词“diabetes mellitus and stem cell not review”,限定文章语言种类为English。资料选择:对检索到的干细胞治疗糖尿病相关文献进行整理,选取针对性强文章。同一领域文献则选择近期发表或权威杂志文章。资料提炼:共检索到359篇相关文献,有关胚胎干细胞、胰腺干细胞、造血干细胞、神经干细胞、骨髓基质干细胞在糖尿病方面研究文章50篇,其中29篇符合要求。资料综合:干细胞极强的自我更新能力和多向分化潜能为糖尿病的细胞治疗开辟了新途径,按其发育阶段不同可以将干细胞分为胚胎干细胞和胰腺干细胞、造血干细胞、神经干细胞、骨髓基质干细胞等成体干细胞。干细胞移植是治疗糖尿病的一条新途径。干细胞生成胰岛素分泌细胞前需要经过诱导分化、细胞选择和细胞成熟3个阶段。干细胞治疗糖尿病研究已取得一定进展,部分实验已纠正糖尿病动物的高血糖状态。结论:干细胞定向分化为胰岛β细胞研究为糖尿病患者点燃了新希望,其勿庸置疑的成为治疗糖尿病的最佳种子细胞。