耐多药结核分枝杆菌KatG及rpoB基因变异的研究

目的建立快速检测耐多药结核分枝杆菌的分子药敏方法,掌握盐城、南通地区结核分枝杆菌KatG及rpoB基因的突变特点,了解耐药分子机制及探索痰标本结核分枝杆菌耐INH、RFP直接检测的可行性。方法对收集的47例耐INH、RFP的结核分枝杆菌临床痰分离株行PCR-自动测序法检测KatG及rpoB基因突变,以结核分枝杆菌标准株H37Rv为参比菌株,应用BACTEC460TB快速培养系统进行自动培养、药敏。结果47例耐INH、RFP分离株结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变阳性分别为29/47、39/47,两者同时突变率为47%。结论PCR-直接测序法敏感、特异,是可靠快速检测结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变,适合于临床肺结核患者MDR-TB痰标本耐药性的快速检测。     

耐多药结核分枝杆菌KatG及rpoB基因变异的研究

目的：建立快速检测耐多药结核分枝杆菌的分子药敏方法，掌握南通地区结核分枝杆菌KatG及rpoB基因的突变特点，探索结核分枝杆菌耐异烟肼、利福平直接检测的可行性。方法：收集47例耐异烟肼、利福平的结核分枝杆菌临床分离株行PCR结合DNA直接测序法检测KatG及rpoB基因突变。以结核分枝杆菌标准株H37Rv为参比菌株，应用BACTEC460TB快速培养系统进行结核分枝杆菌自动培养、药敏。结果：47例耐异烟肼、利福平分离株结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变阳性分别为29例(61．7％)、43例(91．5％)，两者同时突变26例(55．3％)。结论：PCR-直接测序法敏感、特异、可靠实用，可快速检测结核分枝杆菌KatG及rpoB基因突变，用于临床耐多药结核快速检测。     

用PCR-SSCP技术检测结核分支杆菌rpoB, KatG, rpsL基因突变

目的：用PCR－SSCP技术检测肺结核患者痰及分离株结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变，了解耐药分子机制及探索痰标本结核分支杆菌耐RFP，INH，SM直接检测的可行性，方法：对32例耐INH，RFP，SM肺结核患者临床痰标本及30株耐INH，RFP，SM结核分支杆菌临床分离株行PCR－SSCP方法检测rpoB,KatC,rpsL基因突变，结果：32份耐多药临床痰标本中rpoB,KatG,rpsL基因扩增产物SSCP其电泳条带与结核分支杆菌标准株H37Rv电泳条带相比，基因突变阳性分别为28／32，19／32，23／32，30例结核分支杆菌临床分离株rpoB,KatG,rpsL基因突变阳性为28／30，18／30，22／30，结论：PCR－SSCP方法敏感，特异，可快速检测结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变，适合于临床肺结构患者痰标本耐药性的快速检测。     

PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌耐药基因的检测

目的 探讨采用直接检测结核病人痰标本中rpoB基因和KatG基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)的耐药性。方法 用PCR-SSCP技术分析对35例耐INH(或含耐异烟肼)，63例耐RFP(或含耐RFP)的肺结核病人痰标本和20例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。结果 以结核分支杆菌H37RV为对照，63例耐RFP痰标本中57例PCR扩增阳性，其中46例SSCP图谱与H37RV标准株有差异，rpoB突变率为65．2％。35例耐INH肺结核病人痰标本有20例扩增阳性，15例SSCP图谱与H37RV标准株有差异，突变率为42．8％。20例非结核病人痰标本rpoB基因和KatG基因扩增均为阴性。结论 PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。     

PCR-SSCP检测耐多药结核菌基因与细菌培养结果对比分析

目的应用PCR-SSCP检测常规及BACTEC培养耐INH、RFP、SM的耐多药结核分枝杆菌临床分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变,分析其敏感性和特异性,评价其在检测结核分枝杆菌耐药性方面的价值和临床实用性。方法22株常规培养和8株BACTEC培养检出的高浓度及低浓度耐INH、RFP、SM耐多药结核分枝杆菌分离株,分别用PCR-SSCP检测KatG、rpoB、rpsL基因,观察其电泳条带,并与结核菌标准株H37RV对比。结果22株常规培养耐INH、RFP、SM的耐多药结核分枝杆菌分离株中,KatG、rpoB、rpsLPCR扩增产物,用SSCP分别检出KatG基因16株(72.7%)、rpoB基因19株(86.4%)和rpsL基因14株(63.6%)。8株BACTEC培养耐INH、RFP、SM的耐多药结核分枝杆菌分离株中分别检出KatG基因5株(62.5%),rpoB基因6株(75%)、rpsL基因5株(62.5%)。综合两者KatG、rpoB和rpsL基因检出率分别为70.0%(21/30)、83.3%(25/30)和63.3%(19/30)。高浓度耐药与低浓度耐药分离株中的检出率有显著差异(P<0.05),常规培养与BACTEC培养分离株中的检出率无显著差异(P>0.05),与结核菌标准株H37RV电泳条带对比,特异性为100%,敏感性97%。结论PCR-SSCP敏感、特异,可快速检测结核分枝杆菌的KatG、rpoB和rpsL基因,可用于耐多药结核分枝杆菌的临床检测。     

耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的：探讨耐多药结核病（MDR－TB）临床分离株rpoB,KatG,rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。方法：采用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）技术分析了同时耐异烟肼（INH），利福平（RFP），链霉素（SM）的多耐药临床分离株和35株药敏感株的rpoB,KatG,rpsL基因突变，结果：以结核分支杆菌H37RV为对照，35株药物敏感株的rpoB,rpsL基因SSCP图谱正常，其特异性为100％，KatG基因有2株图谱异常，特异性为94％，71株结核分支杆菌临床分离株均未发现rpoB,KatG,rps基因缺失，其PCR扩增产物SSCP分析结果表明，36株多耐药临床分离株中，32株rpoB基因图谱异常，21株KatG基因图谱异常，26株rpsL基因图谱异常，其敏感性分别为rpoB(89%),KatG(58%),rpsL(72%)，结论：结核分支杆菌耐RFP，INH，SM耐药性的产生主要是由于rpoB,KatG,rpsL基因突变所致，PCR－SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一。     

耐多药结核分枝杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的:探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制,应用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐SM和RFP耐药性测定中的应用价值。方法:采用PCR-SSCP技术对168株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因,然后进行SSCP分析。结果:以结核分枝杆菌H37RV为对照,82株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100%。86株同时耐SM和RFP的耐药株中,68株(79.1%)有rpsL基因图谱异常;81株(94.2%)有rpoB基因图谱异常。结论:rpoB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐RFP和SM的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌SM和RFP耐药性。     

结核分枝杆菌耐药基因快速检测

目的 探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制，采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值。方法 采用PCR-SSCP技术对122株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测，即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因，然后进行SSCP分析。结果 以结核分枝杆菌H37RV为对照，48株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100.0％，74株同时耐链霉素和利福平的耐药株中，59株(79.7％)有rpsL基因图谱异常；69株(93.2％)有ropB基因图谱异常。结论 ropB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐利福平和链霉素的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌链霉素和利福平耐药性。     

快速检测结核分枝杆菌γpoB基因突变的研究

目的 :应用PCR SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌γpoB基因突变 ,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 :以结核分枝杆菌H37Rv为对照、5 0例耐RFP(单耐和多耐 )结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本 ,采用PCR SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌γpoB基因突变。结果 :5 0例耐RFP菌株中有 45例PCR SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别 ,与药敏试验结果做对比 ,PCR SSCP检测敏感性为 90 % ,特异性为 10 0 % ;12例敏感菌株与H37Rv条带一致 ,35份肺结核病人痰标本 ,2 1份痰PCR扩增阳性 ,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别 ,而用PCR SSCP 2 8份图谱与H37Rv有差别 ,阳性率为 80 %。结论 :PCR SSCP检测结核分枝杆菌γpoB基因突变快速、简便、易行 ,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定 ,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法     

结核分支杆菌耐药分子机制的检测技术的研究

目的：探讨结核分支杆菌对异烟肼、利福平耐药的分子机制，建立快速检测耐药分支杆菌基因型的分子生物学方法。方法：采用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR—SSCP)同时检测结核分支杆菌敏感株和耐异烟肼、利福平耐药株的KayG基因、rpoB基因突变。结果：78株结核分支杆菌临床分离株均未发现KatG、rpoB基因缺失。以结核分支杆菌H37RV为对照，36株药物敏感株的KarG、rpoB基因SSCP图谱均正常。42株同时耐异烟肼和利福平的多耐药株中，KatG和rpoB基因突变率分别为66．7％(28／42)，90．5％(38／42)。结论：结核分支杆菌耐异烟肼、利福平耐药性的产生是由于KatG基因和rpoB基因突变所致。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分支杆菌异烟肼、利福平耐药性。     

耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的:探讨耐多药结核病(MDR-TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析了同时54株耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和45株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变。结果:以结核分支杆菌H37RV为对照,45株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常,其特异性为100%;KatG基因有2株图谱异常,特异性为96.3%。89株结核分支杆菌临床分离株均未发现rPOB、KatG、rpsL基因缺失,其PCR扩增产物SSCP分析结果表明:54株多耐药临床分离株中,49株rPOB基因图谱异常;32株KatG基因图谱异常;40株rpsL基因图谱异常。其敏感性分别为rPOB(90.7%)、KatG(59.3%),rpsL(74.1%)。结论:结核分枝杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。PCR-SSCP技术有望成为结核分枝杆菌耐药性检测的方法之一。     

PCR-SSCP快速检测耐多药结核分枝杆菌

目的:了解本地区结核病耐药基因突变情况,探讨PCR-SSCP作为新的分子药敏试验方法在临床的应用价值。方法:通过提取耐INH、RFP、SM的肺结核患者痰中结核分枝杆菌DNA,进行PCR-SSCP分析,检测结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL基因是否存在突变,并与传统L-J药敏实验对照。结果:30株耐多药株中,耐RPF、INH、SM基因突变阳性率为90%(27/30)、63%(19/30)、53%(16/30)。3个基因联合突变共8株(26.7%),2个基因联合突变共18株(60%),即26株(86.7%)。单基因突变共2株,2株无基因突变。结论:通过PCR-SSCP方法可检测出绝大部分耐多药结核病的耐药基因,rpoB、katG、rpsL基因突变与本地区结核杆菌对RFP、INH、SM耐药性有关。与传统L-J药敏实验对比,PCR-SSCP是一种敏感、快速的指导临床用药的先进检测方法。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术鉴别结核分枝杆菌利福平耐药基因

目的:采用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆茵rpoB基因突变,并探讨其在结核分枝杆菌对RFP耐药性测定方面的临床价值.方法:应用聚合酶链反应-单链构象多态性技术分别检测48株RFP药物敏感和耐药结核分支杆茵临床分离株,先用PCR扩增rpoB基因,随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变,并与药敏结果做对照分析.结果:48株结核临床分离株中11株RFP敏感株SSCP带谱均与对照相同,37株砌RFP耐药株中有3株带谱与对照相同,另34株SSCP带谱与对照有不同程度的差异.48株临床分离株的L-J药敏法与SSCP的平行分析结果对比,PCR-SSCP方法检测RFP耐药结核菌的敏感性为91.90%,特异性为90.90%.结论:PCR-SSCP技术可快速准确检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,此技术可用于临床结核分枝杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测,以及时指导临床合理选用敏感抗结核药物.     

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐药性

目的：探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析(poly merase chain reaction-single strand cinfomlation polymorphism，PCR-SSCP)方法的临床应用价值。方法：用PCR-SSCP方法检测58株结核分枝杆菌临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比。结果：经常规药敏试验检测，58株结核分枝杆菌临床分离株中共有41株耐药，其中，耐异烟肼(INH)为35株，高耐药株27株；耐利福平(RFP)为31株，高耐药株24株；耐链霉素(SM)有31株，高耐药株26株。同时耐3种药物的有21株(51．2％)，耐2种药物的14株(34．1％)，单耐药株6株(14．6％)．PCR-SSCP方法对58株临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变的检测率为40％(23／58)，45％(26／58)，38％(22／58)，其中检出3个基因同时突变的有13株(32％)，2种基因突变的12株(29％)，1种基因突变的有10株(23．8％)．常规药敏试验与PCR-SSCP法检出结核分枝杆菌同时耐3种药物的符合率为61．9％(13／21)，检出耐2种药物的符合率为85．70k，(12／14)，检出耐1种药物的符合率为50％(3／6)．高耐药株中突变率为80．5％(62／77)，低耐药株中突变率为60％(12／20)．结论：PCR-SS-CP方法对耐2种以上药物的结核杆菌检出率较高，且耐药基因突变率随着耐药浓度增高而增高。将PCR-SSCP法与药敏试验联合应用可互相弥补，已成为临床指导用药的好方法。     

耐多药结核分支杆菌耐药分子机制的研究

目的　研究耐多药结核病 (MDR TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值及鉴定是否含有质粒。方法　采用聚合酶链反应 单链构象多态性 (PCR SSCP)技术分析了 4 6株同时耐异烟肼 (INH)、利福平 (RFP)、链霉素 (SM)的多耐药临床分离株和 6 2株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变。同时对 78株结核分支杆菌临床分离株按碱性溶菌法抽提分离并鉴定是否含有质粒。结果　以结核分支杆菌H37RV为对照 ,6 2株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常 ,其特异性为 10 0 %。KatG基因有 2株图谱异常 ,特异性为 96 8%。rPOB、KatG、rpsL基因突变率分别为 91 3%、6 0 9%、71 7%。结核分支杆菌 30株药物敏感株和 37株同时INH、RFP、SM的多耐药临床分离株均未提取分离与鉴定含有质粒。结论　结核分支杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。未发现结核分支杆菌含有质粒及由质粒介导的耐药机制。     

痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因的快速检测及利福平耐药机制研究

目的快速检测痰耐药结核分枝杆菌rpoB基因，了解利福平耐药的分予机制。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物．用PCR方法从耐药肺结核患者痰及临床分离菌株扩增rpoB基因片段，对扩增获得的rpoB基因片段进行序列测定，比较分析耐多药、全耐、单耐利福平、全敏感或标准结核分枝杆菌株之间的基因序列差异。结果于6h内从耐药肺结核痰中快速检测到rpoB举因。耐多药菌株、全耐及单耐利福平分离菌株均检测有rpoB基因点突变，突变位点主要为531、516或526常见密码子，且绝大多数为单碱基突变，发现1例MDR-TB出现479位和531位密码子同时突变。敏感株和标准株无基因突变。结论PCR及序列分析方法可快速、准确检测结核分枝杆菌rpoB基岗及其突变，结核分枝杆菌埘利福平的耐药性与rpoB基因点突变有关。     

结核病临床标本中结核分支杆菌利福平耐药基因型的快速测定

目的：建立快速测定结核临床标本中结核分支杆菌RFP耐药性的方法，探讨其应用价值。方法：应用PCR－SSCP银染色法和EB染色法对58株结核分支杆菌临床分离株和17例临床标本的rpoB基因进行分析。结果：PCR－SSCP分析结核分支杆菌rpoB基因的敏感性为1～10PgDNA；通过SSCP图谱分析可特异检测结核分支杆菌的rpoB基因突变。32株RFP耐药株中30株（93．8％）发生rpoB基因突变，呈现四种类型的异常SSCP图谱；26株RFP敏感株中1株（3，8％）有rpoB突变。2例涂片阳性培养阳性结核性疾标本有rpoB基因突变，与常规药敏试验相符；5例涂片阳性培养阴性和10例涂阴培阴的结核性标本均未发现rpoB基因突变。结论：大部分结核分支杆菌RFP耐药性产生是由于其rpoB基因突变所致，采用PCR－SSCP方法可快速测定结核病临床标本中结核分支杆菌RFP耐药基因型。     

结核分支杆菌耐异烟肼分子机制的研究

目的为了解新疆地区结核分支杆菌耐异烟肼（INH）分离株KatG基因突变情况，探讨其在INH耐药性中的可能作用。方法采用PCR和PCR—SSCP方法对60株结核分支杆菌临床分离株KatG基因突变进行检测。结果以结核分支杆菌H37RV为对照，28株药物敏感株的KatG基因PCR扩增产物273bp片段28例SSCP图谱正常。32例耐INH分离株中KatG基因扩增均阳性，其中11株SSCP图谱异常，其敏感性为34．37％。结论新疆地区结核分支杆菌INH耐药株存在KatG基因突变，其突变对INH耐药性的影响有待于进一步研究。     

耐多药结核分支杆菌耐药分子机制的研究

目的研究耐多药结核病(MDR-TB)临床分离株rPOB、KatG和rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值及鉴定是否含有质粒。方法采用聚合酶链反应单链构象多态性(PCR—SSCP)技术分析了46株同时耐异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)的多耐药临床分离株和42株药物敏感株的rPOB、KatG、rpsL基因突变。同时对67株结核分支杆菌临床分离株按碱性溶菌法抽提分离并鉴定是否含有质粒。结果以结核分支杆菌H37RV为对照，42株药物敏感株的rPOB、rpsL基因SSCP图谱正常，其特异性为100％；KatG基因有2株图谱异常，特异性为95．8％。tPOB、KatG、rpsL基因突变率分别为91．3％，60．9％，71．7％。结核分支杆菌30株药物敏感株和37株同时INH、RFP、SM的多耐药临床分离株均未提取分离与鉴定含有质粒。结论结核分支杆菌耐RFP、INH、SM耐药性的产生主要是由于rPOB、KatG和rpsL基因突变所致。未发现结核分支杆菌含有质粒及由质粒介导的耐药机制。     

深圳地区结核临床分离菌基因突变与耐药的关系

目的研究深圳地区结核分枝杆菌临床分离株的基因突变与利福平（RFP）、异烟肼（INH）、链霉素（SM）和乙胺丁醇（EMB）耐药之间的关系。方法采用反向斑点杂交技术（RDBHA）对182株结核分枝杆菌临床分离株的rpoB、katG、inhA、rpsL和embB基因突变位点进行检测,并采用L-J比例法检测这些分离株对RFP、INH、SM、EMB的耐药性。结果 182株临床分离株中,总的基因突变率为34.62%（63/182）,其中rpoB基因突变率最高,达24.17%（44/182）。多重耐药结核菌（MDR-TB）占17.03%（31/182）。以L-J比例法作为金标准,采用RDBHA技术检测分别与RFP、INH、SM、EMB耐药相关的rpoB、katG/inhA、rpsL、embB基因突变,其灵敏度分别为88.89%、67.50%、81.82%和64.29%,特异度分别为97.08%、94.37%、97.99%和92.86%。结论深圳地区结核分离株ropB基因突变最普遍,S531L位点是其突变率最高的位点。深圳地区结核分枝杆菌对4个一线抗痨药物耐药现象均较严重,反向斑点杂交技术（RDBHA）可快速检测结核分枝杆菌耐药基因突变,能给临床提供快速用药指导。