人PIF1全长基因及其截短体真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人PIF1基因5端、3端及全长基因的真核表达载体。方法从pCR2.1-TOPO-PIF1原始质粒中,采用PCR方法扩增目的基因PIF1,PIF1N及PIF1C,将目的基因和目的载体pcDNA3.1(-)分别酶切;纯化酶切产物后定向连接,并将其转化大肠杆菌DH5α,对生长出的克隆行特异限制性内切酶酶切鉴定,鉴定为阳性的克隆送样测序。结果凝胶成像结果显示重组基因pcDNA3.1(-)-PIF1,pcDNA3.1(-)-PIF1N及pcDNA3.1(-)-PIF1C酶切后条带大小分别为1 926,540,1 428bp。结论成功构建hPIF1基因5端、3端及全长基因表达载体,分别为pcDNA3.1(-)-PIF1N,pcDNA3.1(-)-PIF1C及pcDNA3.1(-)-PIF1。     

人紧密连接蛋白claudin-6真核表达载体的构建

目的构建人紧密连接蛋白claudin-6的cDNA真核表达载体。方法应用RT-PCR、T-A克隆、限制性内切酶切及亚克隆等技术将claudin-6基因全长克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结果酶切鉴定、PCR扩增以及序列分析表明已经将claudin-6基因全长序列克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）质粒中。结论获得了人claudin-6基因的全长cDNA片段,构建了claudin-6原核克隆载体和真核表达载体。实验中发现,中国人claudin-6基因的461位点碱基为A,而GeneBank中西班牙人claudin-6基因的461位点碱基为G,说明claudin-6基因461位点可能存在多态性。     

Glypican3 N端融合基因构建及鉴定

目的 构建人磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(glypican3,GPC3)N端融合基因.方法 采用RT-PCR技术,从人肝癌细胞株HepG2 mRNA中扩增GPC3 N端基因片段,经双酶切后,T4DNA连接酶将此片段定向连接至质粒pcDNA3.1,并转化大肠埃希菌DH5a,增菌培养后提取质粒并PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果 GPC3 N端基因片段正确插入质粒pcDNA3.1,片段大小及序列正确.结论 成功构建重组质粒pcDNA3.1-GPC3N.     

pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体的构建

从胰腺癌PaTu8988S细胞中提取总RNA,并克隆AKR1B10基因,构建pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体。转化感受态大肠杆菌DH5α细胞,提质粒,酶切及测序鉴定,pcDNA 3.1-AKR1B10真核表达载体构建成功。     

CML28树突状细胞核酸疫苗的构建及其表达研究

为了构建负载CML28的核酸疫苗，并在树突状细胞中进行表达，用分子克隆的方法，从K562细胞中克隆出CML28的cDNA全长，将其亚克隆至pGEM—T载体，经测序后酶切，克隆至真核表达载体pcDNA3．1HisA，将重组质粒pcDNA3．1HisA—CML28进行酶切分析和测序鉴定；从正常人外周血中分离外周血单个核细胞（PBMC），在IL-4和GM—CSF条件下诱导分化为树突状细胞（DC），并进行鉴定；用电穿孔的方法将重组质粒pcDNA3.1 HisA—CML28导入到DC中，Western Blot检测His-CML28融合蛋白的表达。结果表明：经酶切分析和测序鉴定，重组质粒pcDNA3.1 HisA—CML28含有正确的CML28全长序列；经电穿孔导入Dc后，重组质粒能表达His—CML28蛋白。结论：成功构建了CML28树突状细胞核酸疫苗。     

人Regucalcin cDNA真核表达载体的构建及表达

目的构建人regucalcin（RGN）全长cDNA的真核表达载体，观察其在人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2细胞）中表达。方法用RT-PCR技术扩增获得人HK-2细胞RGN全长cNDA，将扩增的产物连接入pMD18-T克隆载体上。将重绢质粒转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，再用双酶切方法将RGN基因定向连接到真核表达载体DECFP-NI中，构成pEGFP-RGN，将pEGFP-RGN转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确。再用双酶切方法将RGN基因与EGFP定向连接到真核表达载体pcDNA3．1（＋）-zeocin中，构建真核表达pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo的重组体。将pcDNA3．1-RGN．EGFP-zeo转化人大肠杆菌DHSa内并提取质粒，双酶切鉴定、DNA测序鉴定准确，用脂质体转染入HK-2细胞。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo表达情况。结果RGNcDNA全长是897bp。以此构建的pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo真核表达载体，经DNA测序与GenBank中的人RGNcDNA序列一致。荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察到pcDNA3．1-RGN-EGFP-zeo转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论本实验成功构建了pcDNA3．1-RGN．EGFP．zeO真核表达质粒，并在HK-2细胞中表达。     

小鼠结缔组织生长因子基因克隆及其真核表达载体构建

背景:研究证实结缔组织生长因子在动脉粥样硬化血管平滑肌中呈高表达,构建结缔组织生长因子真核表达载体以特异性上调结缔组织生长因子在血管平滑肌内的表达是进一步通过细胞及动物实验研究其作用机制的基础.目的:克隆小鼠结缔组织生长因子基因、构建其真核表达载体,并在血管平滑肌细胞中瞬时表达.设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2007-09/2008-04在辽宁医学院省高校分子细胞生物学与新药开发重点实验室完成.材料:1个月龄昆明小鼠10只.真核表达载体{pcDNA3.1(+)由辽宁医学院分子生物学实验室保存.方法:以小鼠肾脏总RNA为模板,通过反转录-聚合酶链反应方法获得结缔组织生长因子(CTGF)目的基因,连接到pMD18-T载体上,酶切鉴定测序,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体.主要观察指标:酶切测序鉴定重组体pcDNA3.1(+)-CTGF.将pcDNA3.1(+)-CTGF转入血管平滑肌细胞,Western观察结缔组织生长因子蛋白表达.结果:酶切、测序鉴定证实成功扩增出小鼠结缔组织生长因子目的基因并构建其真核表达载体,Western检测证实,重组体转入血管平滑肌细胞后,细胞内高表达结缔组织生长因子蛋白.结论:成功克隆小鼠结缔组织生长因子目的基因并构建其真核表达载体,重组体能在血管平滑肌中表达.     

小鼠Atrogin-1基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达

目的：构建小鼠Atrogin-1基因真核表达载体,研究其功能,并探讨其在癌性恶液质骨骼肌萎缩中的作用机制。方法：提取小鼠C2C12细胞RNA,反转成cDNA,PCR合成含有酶切位点的Atrogin-1 cDNA全长,酶切后连接到真核表达载体pcDNA3.1,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,经鉴定及测序证实cDNA片段大小和序列正确,然后用其转染293T细胞,Western blot法检测Atrogin-1蛋白的表达。结果：pcDNA3.1-Atrogin-1含大小、序列正确的Atrogin-1cDNA片段,转染pcDNA3.1-Atrogin-1的293T细胞裂解液中能检测到Atrogin-1蛋白高表达。结论：成功构建了Atrogin-1基因真核表达载体pcDNA3.1-Atrogin-1,并在真核细胞中表达了目的蛋白,其是研究癌性恶液质的重要工具。     

人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

背景:人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。目的:构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。方法:以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其C端936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。结果与结论:经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E表达载体的构建

目的 构建水痘-带状疱疹病毒（VZV）糖蛋白E的真核表达载体。方法用PCR方法扩增VZV糖蛋白E基因，并将其克隆到真核表达载体pcDNA3．1并用双酶切和测序方法鉴定。结果扩增的目的基因包括了全长的糖蛋白E基因，长度约1．9kb。并且成功构建了糖蛋白E基因重组表达载体。结论构建的重组表达载体基因序列正确，为进一步研究此蛋白的免疫原性打下了基础。     

外源性子宫珠蛋白基因对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨人子宫珠蛋白（UG）基因对宫颈癌Hela细胞系细胞增殖及凋亡的影响。方法构建真核细胞表达载体pcDNA3．1-UG（＋），以脂质体介导法稳定转染体外培养的人宫颈癌Hela细胞，同时转染空载体pcDNA3．1质粒，以未转染细胞为对照，转染成功后分别命名为pcDNA3．1-UG（＋）／Hela组、pcDNA3．1／Hela组、Hela组。应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Western blot方法分析目的基因表达，并采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞凋亡。结果pcDNA3，1-UG（＋）／Hela组UGmRNA及UG蛋白出现明显的高表达，与对照组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）；pcDNA3．1UG（＋）／Hela组细胞生长速度明显慢于未转染Hela细胞，其细胞凋亡率与未转染Hela细胞相比差异也有统计学意义；然而pcDNA3．1／Hela组细胞生长速度和凋亡率均无明显变化。结论转染UG基因能诱导Hela细胞凋亡及抑制Hela细胞生长。     

IL-21重组载体的构建及其诱导T细胞活化增殖的研究

目的构建小鼠IL-21基因真核重组表达载体,为IL-21基因治疗肿瘤奠定基础。方法分离BALB/c小鼠脾细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增IL-21基因片段,构建重组质粒pcDNA3.1(-)-IL-21,分组免疫小鼠,检测其脾细胞膜表面CD分子。结果重组质粒测序结果与GenBank中序列一致,大小为490 bp。核酸疫苗免疫组小鼠脾细胞表面CD分子表达量明显高于PBS和pcDNA3.1(-)空质粒组。结论成功的构建了重组质粒pcDNA3.1(-)-IL-21,该核酸疫苗免疫小鼠后,可有效地诱导其体内T细胞的活化增殖。     

日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号蛋白的真核表达

目的从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出信号蛋白Sj14-3-3编码基因，并亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1( )，旨在制备重组诊断抗原和分子疫苗。方法提取日本血吸虫成虫总RNA，分离mRNA，RT-PCR法制备cDNA．并扩增出Sj-4-3-3编码基因，通过线性TA克隆载体pGEM-T连接，亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1( )，经转染至COS-7细胞中表达，Western blotting鉴定。结果RT-PCR产物、pGEM-T-Sj14-3-3及pcDNA3．1( )-Sj14-3-3分别经双酶切后均获得一特异性基因片段，经SDS-PAGE及Western blotting鉴定后的分子量为29kD。结论真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-Sj14-3-3在COS-7细胞中的表达产物是一分子量为29kD的蛋白，并能被抗Sj14-3-3单克隆抗体识别。     

多发性骨髓瘤黏蛋白-1基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

本研究旨在构建多发性骨髓瘤黏蛋白1（两串联）基因（rnuc1-2vntr）的真核表达载体及该重组体在COS-7细胞中的表达,为研制多发性骨髓瘤基因疫苗奠定基础。以MUC1—2VNTR蛋白的编码基因作为目的基因,在其前端加上KOZAK序列后,两端分别加上HindⅢ和XbaⅠ酶的酶切位点,将人工合成的全基因定向插入pcDNA3．1／myc—his B载体中,转化E-coli感受态细胞获得重组菌株,经酶切及测序鉴定为pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒后,采用Lipofectimine脂质体介导法转染COS-7细胞,用荧光显微镜对荧光表达进行观察,然后用Western blot检测重纽体在细胞内外的表达。结果表明：合成的MUC1-2VNTR基因全长约140bp,所构建的pcDNA3．1-2vntr／myc—hisB重组质粒经双酶切及测序鉴定后,与预期片段大小相符,并含有完整的阅读框架和目的基因。将其转入COS-7细胞后48小时,荧光显微镜和Western blot检测均可证实黏蛋白1表达。结论：成功的构建了多发性骨髓瘤真核表达载体pcDNA3．1—2vntr／myc—hisB,并在COS-7细胞中成功地表达黏蛋白1,这为黏蛋白1的功能研究和多发性骨髓瘤基因疫苗的研制提供了实验基础。     

人核心蛋白聚糖基因靶向肺癌细胞特异性表达载体的构建及其表达

目的构建调控人核心蛋白聚糖基因特异性在肺癌细胞A549内表达的基因表达载体,为进一步应用该基因进行肺癌靶向治疗的研究奠定实验基础。方法应用PCR技术从人外周血基因组中扩增肺癌细胞特异性表达的人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂的启动子,利用基因重组技术将该启动子插入真核细胞表达载体pcDNA3.1（＋）,替换该载体的CMV启动子与增强子序列,从而构建成由人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因的启动子启动基因表达的基因表达载体。将人核心蛋白聚糖基因通过基因重组技术插入到上述载体人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因启动子的下游。PCR产物通过测序鉴定核苷酸序列。重组载体通过限制性酶切进行鉴定。结果 PCR扩增的人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂的启动子片段长度为1 250 bp;该启动子经测序获得的核苷酸序列与Genebank上该基因上游5′末端转录调控区的序列完全一致;重组载体的酶切鉴定结果显示（1）该启动子成功插入到pcDNA3.1（＋）载体,并替换CMV启动子与增强子序列,（2）人核心蛋白聚糖基因成功插入该载体。结论成功构建由人分泌型白细胞蛋白酶抑制剂基因启动子调控人核心蛋白聚糖基因表达载体,该载体实现调控人核心蛋白聚糖基因在肺癌细胞内特异性表达。     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆及其重组表达载体的构建意义

目的构建MAGE-3基因重组真核表达质粒pcDNA3.1/MAGE-3,制备肿瘤DNA疫苗,为提高患者生存期内生活质量选择更优秀的治疗措施。方法从人黑色素瘤细胞株中提取总RNA,进行RT-PCR扩增出全长cDNA,并克隆入PUC19载体,经DNA测序证实序列无误后,将MAGE-3基因克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体。结果经RT-PCR扩增出大小约950bp的基因片段,成功克隆入PUC19载体,经DNA测序证实为MAGE-3,编码MAGE-3基因全部947bp序列,读框正确,进一步亚克隆获得携有MAGE-3基因的重组质粒pcDNA3.1/MAGE-3。结论成功构建了MAGE-3真核表达质粒,为其作为新型DNA疫苗用于肿瘤免疫治疗奠定了基础,对提供有效治疗方案,提高患者的生存率和延长患者的生存期产生正面意义。     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景:超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因.目的:构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率.设计、时间及地点:细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供.携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存.腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司.方法:质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;1-Ceu Ⅰ+1-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率.结果:构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp(pshutIle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用Xho Ⅰ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×10~(11) PFU/mL.成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%.结论:实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞.