转化生长因子-β1基因治疗对种植体周骨质疏松的影响

目的探讨转化生长因子- β1（TGF- β1）基因治疗对种植体周围骨质疏松和骨缺损的影响。方法构建pCDNA3.1（+）- TGF- β1真核表达载体，转染大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs），并与聚乳酸- 羟基乙酸（PLGA）体外黏附。制备骨质疏松大鼠股骨植入钛种植体模型，将24只Wister大鼠随机分为实验组、对照组和空白对照组，实验组为在种植体周骨缺损处植入TGF- β1基因修饰BMSCs复合PLGA；对照组为BMSCs复合PLGA。术后第4和8周取标本行免疫组化和组织学分析，观察种植体周骨组织中TGF- β1的表达和组织学变化。结果术后第4周，实验组骨缺损区的TGF- β1表达较对照组和空白对照组明显；第8周实验组骨缺损区被新生骨充填，骨质较对照组和空白对照组明显改善。结论TGF- β1基因修饰BMSCs体内回植后，可在种植体周围骨组织内表达TGF- β1，并可以影响种植体周骨缺损的修复和骨质疏松状况。     

张应力下成骨性转录因子在骨髓间充质干细胞中的表达

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对单一周期的机械力刺激的反应以及Ets-1、Cbfa1和ALP的基因表达.方法:密度梯度离心法体外分离培养大鼠骨髓MSCs;应用四点弯曲加力系统对细胞施加40 min、2 000μ8的机械牵张力,检测MSCs细胞增殖及ALP活性,并采用实时荧光定量RT-PCR检测Ets-1、Cbfa1和ALP的基因表达.结果:机械力刺激下,MSCs的增殖活力、ALP活性以及Ets-1、Cbfa1和ALP的基因表达均显著增高.Ets-1表达较早,加力后0.5 h达到最高峰;而Cbfa1表达较晚,加力后6 h达到最高峰;ALP的表达与Cbfa1相似.3个基因表达增高均在6～12 h后恢复到正常水平.结论:单一周期的张应力可诱导Ets-1、Cbfa1和ALP在MSCs中呈时间依赖性表达,并促使MSCs短暂性骨向分化.机械力刺激是MSCs骨向分化的关键驱动因子,对牵张成骨骨痂形成具有重要的作用.     

碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子对大鼠外胚间充质干细胞增殖活性的影响

目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对大鼠外胚间充质干细胞增殖活性的影响,为研究颅面与牙齿的发育机制及外胚间充质干细胞的诱导分化提供理论依据。方法 采用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法检测经 10 ng/ml bFGF、100 ng/ml IGF-1刺激4 d后大鼠外胚间充质干细胞的吸光度值。结果 培养4 d后,bFGF处理组吸光度值高于对照组(P<0.05),而IGF-1组及bFGF+IGF-1组与对照组差异均无显著性(P>0.05)。结论 bFGF可促进大鼠外胚间充质于细胞的增殖,bFGF和IGF-1可能协同促进其分化。     

脂多糖和转化生长因子-β1对牙髓细胞Toll样受体4的表达及信号通路的影响

目的研究牙髓炎症过程中,在促炎因子脂多糖（LPS）和抑炎因子转化生长因子-β1（TGF-β1）同时存在的情况下,牙髓细胞表面Toll样受体4（TLR4）的表达水平及相关信号分子的变化情况。方法LPS、TGF-β1作用于体外培养的牙髓细胞,用流式细胞术检测牙髓细胞表面TLR4的表达;实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）、Westernblot方法检测相关信号分子的表达水平,包括进化保守的Toll信号中介分子（ECSIT）和核转录因子-κB（NF-κB）;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测前炎症因子白细胞介素-6（IL-6）的分泌水平;然后进一步通过real-time PCR法检测临床炎症牙髓组织中相应指标的变化。结果体外培养的牙髓细胞在LPS、TGF-β1共同作用下,细胞表面TLR4的表达水平没有明显变化,但是IL-6分泌增加,ECSIT表达增加,NF-κB入核增加。临床标本的real-time PCR结果表明：炎症状态下的牙髓组织中TGF-β1 mRNA表达增加,TLR4 mRNA表达没有明显变化,ECSIT及IL-6 mRNA表达增加。结论牙髓炎症发展过程中,虽然牙髓组织中TGF-β1表达增加,抑制细胞表面TLR4的表达,但TLR4的信号通路仍然被活化,主要机制可能是LPS引起信号分子ECSIT的活化,从而抑制TGF-β1信号通路的活化。     

转化生长因子β促进面突外胚间充质干细胞向平滑肌细胞分化

目的　探讨转化生长因子β(TGF-β)对面突外胚间充质干细胞向平滑肌细胞分化的影响。方法　 60 pmol/LTGF-β作用于面突外胚间充质干细胞,分别于1 d、2 d后进行抗α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体免 疫组化图象分析检测,2 d后定量RT-PCR检测α-SMA mRNA的表达。结果　免疫组化显示,TGF-β诱导组表达α- SMA的细胞数约为95%,而未加分化抑制剂的自然分化组表达α-SMA的细胞数约为65%。图象分析显示,1 d、2 d TGF-β诱导组抗α-SMA着色平均灰度值小于未加分化抑制剂的自然分化组。定量RT-PCR显示TGF-β诱导组α-SMA mRNA量大于自然分化组。有分化抑制剂的对照组细胞不表达α-SMA。结论　TGF-β诱导组细胞表达α-SMA强于 自然分化组。TGF-β可以促进外胚间充质干细胞向平滑肌细胞分化。     

胰岛素样生长因子1诱导外胚间充质细胞向成牙本质细胞样细胞分化

目的：探讨SD大鼠颌突外胚间充质细胞向成牙本质细胞的分化机制。方法：在建立SD大鼠颌突外胚间充质细胞体外培养模型的基础上，用胰岛素样生长因子1(IGF-1)刺激外胚间充质细胞，采用倒置微镜和免疫组化等方法从形态学和功能方面检测细胞的变化。结果：在不含LIF的培养液中加入100ng/mL IGF-1培养的外胚间充质细胞，10d后在倒置显微镜下可见一些细胞出现单一细胞浆突起，似成牙本质细胞。消化后爬片经免疫组化抗DSP染色，部分细胞胞浆呈强阳性着色。结论：IGF-1可部分地诱导外胚间充质细胞向功能性成牙本质细胞分化，可能是牙齿发育过程中的重要细胞因子之一。     

张应力诱导大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及其差异基因表达分析

目的探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）在张应力作用下成骨向分化及其相关基因的差异表达。方法密度梯度离心法体外分离培养大鼠骨髓MSCs;应用四点弯曲加力系统对细胞施加2 000 με的机械牵张力,骨钙素免疫组化染色、碱性磷酸酶（ALP）活力测定MSCs骨向分化,cDNA芯片技术对加力前后MSCs进行mRNA检测,通过芯片杂交、生物信息处理,分析二者间基因差异表达。结果MSCs经应力加载后,其细胞生长曲线与对照组相比差别不大,但骨钙素表达水平和ALP活性显著增高,27 K Rat Genome Array芯片发现,加载前后MSCs表达差异基因共有416条（2.8%）,其中表达增强247条（61条显著增强）,表达降低169条（74条显著降低）。结论张应力可诱导MSCs骨向分化,而差异表达的基因可能在这一过程中起重要作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞和颅骨成骨细胞在张应力下细胞骨架的改变

目的　探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)和颅骨成骨细胞(OB)在机械张应力刺激下的反应和细胞骨架蛋白F-actin的变化。方法　体外分离培养大鼠骨髓MSCs和颅骨OB,应用四点弯曲加力系统对细胞施加2 000με 的机械张应力,加力时间分别为0 h、2 h、6 h、12 h。采用激光共聚焦显微镜观察特异性荧光染料标记的微丝蛋白 F-actin和细胞核,并用图像分析软件对细胞形态学参数进行测量。结果　MSCs和OB荧光强度减弱,F-actin纤维束稀疏,排列紊乱;胞核轮廓模糊,部分细胞可观察到凋亡小体;MSCs体积明显变小,OB体积变化不明显。定量分析表明, MSCs的细胞总面积、总荧光密度、绿色荧光(F-actin)密度均显著降低(P<0·05或P<0·01);OB的总荧光密度、绿色荧光密度和胞核红色荧光密度也显著下降(P<0·05或P<0·01)。结论　机械张应力刺激可引起MSCs和 OB细胞骨架F-actin解聚和重排,部分细胞发生凋亡;MSCs对机械力刺激的反应比OB更敏感。     

水蛭素对牙龈成纤维细胞碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β1表达的影响

目的 观察水蛭素对人牙龈成纤维细胞（HGFs）碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）及转化生长因子-β1（TGF-β1）表达变化的规律,探讨水蛭素影响牙龈改建的可能作用机制。方法 体外培养并鉴定HGFs,利用不同浓度的水蛭素分别作用于正常（对照组）和受长期机械外力作用后增生的HGFs（实验组）,通过实时定量聚合酶链反应法和免疫细胞化学法检测TGF-β1及bFGF的表达。结果 未加入水蛭素时,受长期机械外力作用后,实验组促进HGFs增殖胶原合成的TGF-β1表达升高,而抑制胶原合成的bFGF表达降低（P<0.05）。加入水蛭素干预增生的HGFs后,可正向调节bFGF表达,而负向调节TGF-β1的表达（P<0.05）。结论 外力作用干扰了HGFs胶原合成与降解之间的平衡,水蛭素可能通过调节这一平衡而促进牙龈改建过程。     

间充质干细胞相关生长因子在牙槽骨修复的应用进展

牙槽骨缺损是导致口腔功能障碍的主要原因,如何修复骨缺损,并恢复其功能是近年来的关注重点。目前临床中使用的骨重建技术有一定的局限性,组织工程学和骨再生医学应运而生。间充质干细胞因其增殖分化后能够代替损伤的组织,有望成为治疗骨缺损的有效替代方案。最近的研究表明间充质干细胞旁分泌生长因子能够诱导骨修复。该文总结了近年来骨缺损修复的基础研究和临床实验结果,重点对间充质干细胞旁分泌效应在牙槽骨修复中的作用及相关生长因子的特点进行介绍。     

Wnt／β-catenin信号通路在大鼠骨髓间充质干细胞牵张中的表达

目的：了解经典Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞（BMSCs）加载牵张中的作用。方法：分离培养大鼠BMSCs,通过自行研制的细胞加载装置．对BMSCs施加机械张应力刺激。用实时荧光定量RT—PCR与Western印迹检测Wnt3A、B—catenin与Lef-1的表达,同时检测BMSCs细胞增殖及骨向分化转录因子Runx2与成骨因子碱性磷酸酶（ALP）的变化情况。所得数据应用SPSS19．0软件包进行配对￡检验。结果：在牵张力刺激下,经典Wnt信号通路的3个关键分子Wnt3A、β-atenin与IJef_因表达显著增强（P〈0．05）。BMSCs的增殖、Runx2表达以及ALP活性也在加力后增强（P〈0．05）。结论：张应力加载激活了经典Wnt信号通路．并刺激BMSCs增殖与骨向分化,提示Wnt／β-catenin参与了牵张成骨的分子调控过程。     

局部应用血管内皮生长因子及骨髓间充质干细胞对超比例随意皮瓣成活率的影响

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）及人骨髓间充质干细胞（MSC）联合应用对超比例随意皮瓣成活率的影响。方法采用密度梯度离心法和贴壁筛选法分离、培养人MSC,鉴定其纯度及生物学特性。40只Wistar大鼠随机分成空白对照组、VEGF组、MSC组、MSC+VEGF联合应用组,每只大鼠背部设计2 cm×5 cm带蒂皮瓣,术后连续 14 d观察皮瓣愈合情况。术后第14天处死各组动物,计算皮瓣成活百分率;切取距蒂部4 cm处皮瓣行组织学检查,观察远蒂端皮瓣的微血管数量。结果1）经流式细胞术和成脂、成骨诱导方法鉴定,本研究分离并培养的MSC具有多向分化潜能。2）经临床观察,各组大鼠均未出现免疫排斥反应。空白对照组、VEGF组、MSC组、MSC+VEGF 组动物的皮瓣成活百分率分别为55.4%±4.4%、70.7%±6.3%、65.1%±7.1%、93.4%±9.4%,3个实验组皮瓣成活百分率均高于空白对照组（P<0.05）,MSC+VEGF组成活百分率最高,高于其他3组,差异均有统计学意义（P<0.05）。3）组织学检查可见：与其他3组相比,MSC+VEGF组的肉芽组织最为丰富,成纤维细胞多,新生毛细血管最多。结论 1）采用贴壁筛选法和密度梯度离心法结合的方法可以得到纯化且具有多向分化潜能的MSC;2）人MSC具有无免疫反应性或免疫反应性低的特点,跨物种应用不会引起免疫排斥反应;3）VEGF和MSC联合应用具有协同作用,可在短期内重建缺血区域的血液循环,解决超比例皮瓣的远蒂端缺血问题,提高皮瓣成活率和创面组织的修复质量。     

肥大细胞、Clusterin/apoJ和转化生长因子-β在不同时期血管瘤中的表达及相关性

目的探讨肥大细胞、Clusterin/apoJ和转化生长因子-β（TGF-β）在不同时期血管瘤发生、发展过程中的表达及相关性。方法采用免疫组织化学方法检测不同时期血管瘤中Clusterin/apoJ、TGF-β的表达水平以及采用甲苯胺蓝染色法对各期肥大细胞进行染色。结果增生晚期肥大细胞计数明显多于增生早、中期（P<0.01）,退化早期肥大细胞计数明显多于退化中、晚期（P<0.01）。Clusterin/apoJ和TGF-β在增生晚期的表达明显强于其在增生早、中期的表达（P<0.01）,在退化早期的表达明显强于其在退化中、晚期的表达（P<0.01）。不同时期中肥大细胞计数与Clusterin/apoJ和TGF-β表达的平均阳性面积率间具有显著正相关性（P<0.01）,不同时期中Clusterin/apoJ和TGF-β表达的平均阳性面积率间具有显著正相关性（P<0.01）。结论肥大细胞可能对血管瘤的消退进程起促进作用。Clusterin/apoJ和TGF-β可能具有促进血管内皮细胞凋亡,发挥促进血管瘤消退的作用;TGF-β可能通过正性调节Clusterin/apoJ的表达而发挥促进血管瘤自然消退的作用。     

生长因子诱导间充质干细胞三维体外软骨形成的研究进展

间充质干细胞软骨向分化的潜能已被广泛研究,并且已经表明这些干细胞的软骨形成潜能彼此不同。通常,软骨诱导最常见的生长因子来自转化生长因子(TGF)-β超家族。对文献的全面回顾表明,在含有地塞米松和TGF-β3的培养基中,三维培养中的间充质干细胞似乎表现出较高的软骨形成潜力。一些报道还表明加入TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,骨形态发生蛋白(BMP)-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7和BMP-9,以及其他类型的细胞因子如成纤维细胞生长因子-2、糖皮质激素、胰岛素样生长因子-1等,也促进间充质干细胞软骨形成分化,但这些结果仍未得到一致支持。然而,迄今为止,目前的制剂并不是总会诱导间充质干细胞向成软骨稳定分化。本文综述了多种生长因子单独和组合对间充质干细胞三维体外软骨向分化影响的研究。     

上皮-间充质转化的生物学作用

上皮-间充质转化(EMT)描述的是上皮细胞在外界因素的作用下,获得某些间充质细胞特征(如极性丧失、细胞骨架蛋白的改变和成纤维细胞样外形等)的现象,其在许多生理和病理过程中都具有重要的作用.学者们近年来对EMT生物学作用的研究主要围绕胚胎发育、损伤修复、脏器纤维化以及癌症的发生和发展等几个方面展开.因此,本文拟从上述几个...     

血管内皮细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞生物学效应的研究

目的:体外研究腺病毒AdCMV转染VEGF基因对大鼠骨髓间充质干细胞的增殖及功能分化的影响.方法:体外培养扩增大鼠BMSCs,AdCMV-EGFP转染BMSCs,确定重组腺病毒的最适MOI,应用MTT法检测转染AdCMV-VEGF对大鼠BMSCs增殖的影响.采用RT-PCR方法检测转染后细胞VEGF的表达,通过检测成骨条件培养液诱导培养后细胞的碱性磷酸酶活性评价BMSCs向成骨细胞分化的能力.结果:AdCMV-EGFP在400particle/cell时转染效率最高,且对细胞无毒副作用,未转染细胞、AdCMV-EGFP转染细胞与AdCMV-VEGF转染细胞光吸收(A)值在转染后第3天存在明显差异(P<0.05).RT-PCR检测AdCMV-VEGF转染细胞有VEGF基因的表达,未转染AdCMV-VEGF细胞组未见VEGF基因mRNA的表达.通过成骨诱导后AdCMV-VEGF转染细胞碱性磷酸酶活性明显高于未转染AdCMV-VEGF细胞(P＜0.05).结论:在体外AdCMV-VEGF能够成功转染大鼠BMSCs,能够促进BMSCs的增殖和向成骨细胞的分化.     

表皮生长因子对间充质干细胞迁移的影响及其信号机制

目的：探索表皮生长因子（EGF）对间充质干细胞（MSC）迁移的影响及其信号机制,提高口腔颌面部损伤修复的能力。方法：采用全骨髓贴壁法培养MSC,通过流式细胞仪分析其表面标记（CD45、CD34、CD90、CD29）以及成骨、成脂肪等多向诱导分化潜能鉴定其特征。采用MTT法分析不同浓度的EGF对MSC增殖的影响,采用Transwe ll体外迁移体系观察不同浓度的EGF对MSC迁移的影响,随后以MEK阻断剂PD98059（50μM）、p38 MAPKSB203580（30μM）、PKC非选择性阻断剂Straurosporine（10 mM）及磷脂酶C阻断剂U73122（10μM）等分别处理MSC,观察合适浓度的EGF影响MSC迁移与PKC/ERK 1/2途径等途径的关系。结果：培养的MSC表现出CD90、CD29强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;EGF促进了MSC迁移,U73122、Straurosporine及PD98059等可明显抑制了EGF所诱导的MSC迁移效应。结论：EGFF引起的MSC迁移效应与PLC/PKC/ERK 1/2途径相关,能有效促进颌面部损伤的修复。     

顺铂诱导舌鳞癌细胞发生上皮-间充质转化及获得肿瘤干细胞样特性的实验研究

目的: 建立舌鳞癌顺铂耐药株,观察其是否具有肿瘤干细胞样特性以及是否发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。方法: 使用顺铂梯度浓度递增法构建舌鳞癌顺铂耐药细胞株,通过MTS、流式细胞术和球囊培养对比舌癌顺铂耐药株和其亲本细胞株化疗耐药性及肿瘤干细胞特性的变化,通过qRT-PCR和Western 免疫印迹检测肿瘤干性因子SOX2、OCT4、BMI1和ABCG2的表达,以及舌癌顺铂耐药株和其亲本细胞株中EMT的指标E-cadherin和Vimentin的表达水平,通过Transwell侵袭迁移实验研究侵袭和迁移能力的变化。采用SPSS 17.0 软件包对数据进行统计学处理。结果: 成功构建了2株舌鳞癌顺铂耐药株CAL27-res和SCC9-res,2株细胞对顺铂具有更强的耐药性。与亲本的舌癌细胞CAL27和SCC9相比,CAL27-res和SCC9-res细胞呈现间充质表型, E-cadherin显著下调(P<0.001),Vimentin和N-cadherin显著上调(P<0.001),侵袭、迁移能力显著增强(P<0.001)。同时,CAL27-res和SCC9-res细胞球囊形成能力增强,肿瘤干性因子SOX2、OCT4、BMI1和ABCG2上调(P<0.001),CD44⁺/CD24^-细胞的比例增高(P<0.001)。结论: 顺铂诱导的舌鳞癌耐药细胞发生EMT且获得了肿瘤干细胞样特性。     

胚胎干细胞上清液诱导Tca8113细胞发生上皮-间充质转化的实验研究

目的:采用胚胎干细胞培养上清液诱导口腔鳞癌细胞发生上皮-间充质转化,初步探讨其意义.方法:应用129小鼠胚胎干细胞培养上清液诱导培养舌鳞癌Tca8113细胞.分别在1周和2周后,采用免疫荧光和免疫细胞化学检测诱导前、后Tca8113细胞中Oct4、角蛋白(CK)和波形丝蛋白(vimentin)的表达情况.半定量反转录PCR检测snail、slug、E-cadherin和CD44、Bmi-1、hTERT表达随诱导时间的变化情况.结果:Tca8113细胞经条件培养基诱导后,细胞形状逐渐由铺路石样变为长梭形;Oct4集中表达在细胞核中,vimentin转变为阳性表达,CK表达无明显变化;上皮-间充质转化标记snail mRNA表达上调,E-cadherin下调,slug无明显变化.同时,癌干细胞标记CD44、Bmi-1和hTERT mRNA表达上调.结论:口腔鳞癌细胞经胚胎干细胞培养上清液诱导后,可发生上皮-间充质转化,从而可能具备部分干细胞特性.     

人转化生长因子-β1基因转染对人牙龈成纤维细胞成骨特性的影响

目的观察并评价基因转染后牙龈成纤维细胞（GF）表达外源目的基因人转化生长因子-β1（hTGF-β1）对其分化、成骨特性的影响。方法采用碱性磷酸酶（ALP）活性检测方法检测转染对GF ALP活性的影响,免疫组化染色及图像分析评价基因转染后骨钙素（OC）、骨桥素（OPN）、骨涎蛋白（BSP）、骨结合素（ON）含量的变化,体外矿化结节形成实验检测转染后细胞成骨特性的变化。结果转染后GF的ALP活性较未转染组有显著的提高（P<0.05）,并且与牙周膜成纤维细胞（PDLCs）的ALP活性接近（P>0.05）。OC含量检测显示转染后GF的OC含量与未转染组和PDLCs组相比,其差异均无统计学意义（P>0.05）。免疫组化染色后,转染组GF所表达的OPN、ON、BSP含量均高于未转染组GF（P<0.05）,而与PDLCs间差异无统计学意义（P>0.05）。第21天和第24天时,在矿化液作用下PDLCs及转染GF在倒置显微镜下可见致密的结节形成,von Kossa染色可见紫色的矿化结节形成。未转染GF未见结节形成。而转染GF在未经矿化液诱导情况下,虽出现显著的细胞聚集,但von Kossa染色未见紫色矿化结节形成。结论转染pcDNA3-hTGF-β1后的GF可表达一定的成骨细胞特性,但这种成骨特性有限。