肿瘤源性血管内皮细胞的培养及其细胞生物学特性鉴定

目的 探讨肿瘤来源血管内皮细胞的诱导和体外培养方法,并对其进行细胞生物学特性鉴定.方法 胰蛋白酶灌流消化法收集人脐静脉内皮细胞(HUVEC),采用肿瘤细胞的培养上清液诱导HUVEC增殖,制备肿瘤衍生的血管内皮细胞( Td-EC).采用形态学观察和荧光染色Ⅷ因子相关抗原,鉴定血管内皮细胞,用RT-PCR检测肿瘤血管内皮细胞标志物(TEM)的表达,采用迁徙试验、透射电镜、流式细胞仪细胞周期分析等方法检测、比较HUVEC和Td-EC的生物学特性.结果原代培养的HUVEC约于24h完全贴壁,4～5d 后融合成单层铺路石样结构.Ⅷ因子荧光染色证实培养的细胞是HUVEC.经肿瘤细胞上清液诱导后,用RT-PCR检测到TEM1和TEM8 mRNA在Td-EC中的表达;Td-EC细胞迁徙能力较HUVEC显著增强;Td-EC细胞增生活跃,G0～S期细胞比例明显增高,具有肿瘤血管内皮细胞特性.结论胰蛋白酶灌流消化法可获得大量连续传代扩增的HUVEC,并可诱导生成肿瘤源性的血管内皮细胞.     

Tip30基因对肝细胞肝癌血管生成能力的影响

目的 转染Tip30基因至肝癌细胞株HepG2,研究其对肝癌细胞血管生成的影响。方法 聚乳酸-羟乙酸(PLGA)纳米粒介导含Tip30基因的腺相关病毒质粒(pAAV)转染HepG2细胞后,RT-PCR法检测血管生成相关因子TSP-1和PD-ECGF mRNA的表达;四氮唑盐(MTS)比色法分析HepG2细胞转染培养上清液对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖的影响。小孔趋化分析实验观察HepG2细胞转染培养上清液对HUVECs的趋化作用。结果TSP-1和PD-ECGF mRNA的表达受Tip30基因调控。MTS法检测到Tip30转染后HepG2细胞能够促进HUVECs的增殖。Tip30基因转染HepG2肝癌细胞后的培养上清液使HUVECs的迁移能力减弱。结论 Tip30能调控相关血管生成因子,可显著降低HWECs的增殖和迁移,在抑制肝细胞癌的血管生成中有一定的作用。     

MDA-MB-231细胞源exosome对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)VEGF自分泌及体外成管作用的影响

 目的 研究人乳腺癌MDA MB 231细胞源exosome对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)自分泌及体外成管作用的影响,探讨肿瘤细胞源exosome在肿瘤微环境中对血管内皮细胞血管生成的调控作用。方法 低温超速离心及密度梯度离心法提取乳腺癌MDA MB 231细胞源exosome;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HUVEC与exosome共培养24 h后上清液中VEGF的变化水平;Western blot技术检测HUVEC与exosome共培养24 h后VEGF、VEGFR2及p VEGFR2的蛋白表达情况;RT PCR法检测HUVEC与exosome共培养24 h后VEGF的基因表达情况;观察HUVEC与exosome共培养24 h后的体外成管能力。 结果 HUVEC与exosome共培养24 h后上清液中VEGF为(110.851±18.404)pg/mL,与对照组相比差异具有统计学意义(P＜0.05);Western blot结果显示,HUVEC与exosome共培养24 h后VEGF和p VEGFR2的蛋白表达水平均增加(P＜0.05);RT PCR结果显示,HUVEC与exosome共培养24 h后VEGF的基因表达水平增加(P＜0.05);体外成管实验显示,exosome显著提高了HUVEC的管腔形成能力(P<0.05)。结论 乳腺癌MDA MB 231细胞源exosome促进了血管内皮细胞VEGF的表达及分泌,激活了血管内皮细胞VEGF/VEGFR2自分泌环并提高了血管内皮细胞的体外成管能力,对促肿瘤血管生成有一定的调控作用。     

人纤维蛋白溶酶原kringle5(K5)抑制小鼠肝癌的血管生成和肿瘤生长

[目的]体内、体外实验观察人纤维蛋白溶酶原kringle5(K5)对肝癌血管生成和肿瘤生长的影响.[方法]大肠杆菌中表达,组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得K5蛋白,SDS-PAGE和Western blot方法鉴定K5蛋白的表达;MTT法分析K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞(BRCEC)和肝癌细胞株Bel-7402、HepG2增殖的影响;建立皮下种植肝癌鼠模型,瘤内注射K5,检测抑瘤率及肝癌组织微血管密度(MVD).[结果]SDS-PAGE及Western blot鉴定获得K5纯化蛋白;K5特异性地抑制BRCEC的增殖,IC50=160 nmol/L,而对肝癌细胞株Bel-7402、HepG2的增殖无抑制作用;K5显著抑制小鼠肝癌生长,治疗组肝癌组织MVD明显低于对照组.[结论]K5抑制移植性小鼠肝癌血管生成和肿瘤生长,特异性抑制血管内皮细胞的增殖可能是K5抑制肝癌血管生成的主要机制.K5具有治疗肝癌的潜在临床价值.     

电离辐射对血管内皮细胞影响的实验研究

目的　观察电离辐射 (X线 )对血管内皮细胞培养上清液中内皮素 (ET)和一氧化氮 (NO)含量变化及细胞凋亡的影响。方法　采用新生儿脐带静脉血管内皮细胞 (HUVEC)体外原代培养方法 ,用放免法和化学法检测培养上清液中ET和NO含量 ,用透射电镜、流式细胞仪观察细胞形态特征和检测凋亡细胞。结果　血管内皮细胞在电离辐射 2 4h后 ,各辐射剂量组培养上清液中NO含量无变化 ;在 2Gy剂量组ET含量变化不明显 ,而 5、10、2 0Gy各剂量组ET含量明显下降 (P <0 .0 5 )。电离辐射 2 4、4 8h后HUVEC形态无明显改变 ,未检测出明显凋亡细胞。结论　原代培养生长的HUVEC在 2～ 2 0Gy照射时有一定的放射抗性 ,其确切机理有待进一步研究     

透明质酸酶和透明质酸对血管内皮细胞增殖及CD44表达的影响

目的 :探讨透明质酸酶 (HAase)和透明质酸 (HA)对血管内皮细胞增殖的影响和可能机制 ,寻找促血管新生的新途径。 方法 :采用牛主动脉内皮细胞 (BAEC)离体培养模型 ,分别经 HAase或 HA刺激 ,用 MTT法观察 BAEC增殖率的变化 ;经流式细胞术 (FCM)测定细胞周期和细胞表面粘附分子 CD44的表达。 结果 :HAase(5 0μg/ ml)作用后细胞增殖率 (% )为5 0 .10± 1.2 3(P<0 .0 1) ,使细胞周期中 S期和 G2 / M期细胞比例增加 12 .8% ,CD44的表达细胞数和表达量增加 ;而高浓度HA (10 0μg/ m l)则抑制 BAEC的增殖和 CD44的表达。 结论 :HAase可降解细胞外基质中具有抗血管新生作用的 HA,促进内皮细胞的增殖 ,有可能提高促血管生长因子治疗心肌缺血的局部疗效     

中药尿酸利仙含药血清对TNF-a诱导的人血管内皮细胞VCAM-1mRNA表达的影响

目的:观察中药尿酸利仙(含药血清)对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的人血管内皮细胞(ECV)血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)mRNA表达的影响。方法:①体外培养人血管内皮细胞,分别用不同浓度(12.5、25、50μg/ml)的TNF-α刺激;②体外培养人血管内皮细胞,培养液中加入TNF-α至终浓度为25μg/ml,分别孵育细胞8、16、24、48小时。③用25μg/ml的TNF-α孵育细胞16小时,同时用含不同浓度(2.5%、5%、10%)中药尿酸利仙含药血清的培养液进行干预,用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术测定血管内皮细胞VCAM-1mRNA表达。结果:低、中、高浓度TNF-α刺激均可显著上调血管内皮细胞VCAM-1mRNA表达(P0.01),各刺激组间差异无统计学意义(P0.05)。25μg/ml的TNF-α在16、24和48小时均可显著上调血管内皮细胞VCAM-1mRNA表达(P0.01),各干预组间差异无统计学意义(P0.05)。低、中、高浓度的中药尿酸利仙含药血清干预均可显著降低VCAM-1mRNA表达(P0.05,P0.01)。结论:中药尿酸利仙含药血清可抑制VCAM-1mRNA过度表达,可能是减轻TNF-α诱导的人血管内皮细胞炎症损伤及抑制炎症反应的机制之一。     

体外共培养体系中胆管癌细胞对人脐静脉内皮细胞b-FGF和VEGF表达的影响

目的 探讨体外共培养体系中胆管癌细胞(QBC939)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法 建立胆管癌QBC939细胞与HUVEC体外共培养体系,采用CCK-8法检测共培养不同时相HUVEC的增殖;ELISA检测共培养上清液中b-FGF含量;qRT-PCR和Western blot检测共培养不同时相点HUVEC细胞VEGF mRNA和蛋白质的表达.结果 共培养后12、24、48 h和72 h,HUVEC增殖较对照组显著增高(P＜0.01).与0h组比较,共培养12、24、48 h上清液中b-FGF含量显著增高(P＜0.05).共培养12 h时VEGF mRNA表达显著增加,并持续至72 h(P＜0.01),VEGF蛋白表达在共培养12h后显著增高,24、48、72 h时与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 人胆管癌QBC939细胞可促进血管内皮细胞增殖、增加b-FGF分泌和VEGF表达.b-FGF和VEGF表达增加与肿瘤血管新生,以及肿瘤的生长和转移可能具有相关性.     

低效价肝素对离体人血管内皮细胞增殖及损伤的影响

目的 研究低效价肝素对内皮细胞增殖过氧化的影响及对其损伤的保护作用。方法 比色法测定内皮细胞的增殖。结果 在培养液中含内皮细胞生长因子（６０ｍｇ／Ｌ）时，低效价肝素能显著刺激内皮细胞增殖，其作用呈浓度依赖关系；同时发现，脂质过氧化造成培养上清液中ＬＤＨ漏出量增加，低效价肝素能显著降低培养上清液中ＬＤＨ的漏出量。结论 低效价肝素具有保护血管内皮细胞的作用。     

当归补血汤在流体剪切应力环境中对内皮细胞功能的影响

目的观察当归补血汤在流体剪切应力(FSS)环境中对人内皮细胞功能的影响。方法将细胞置于平行平板流动小室,加载稳定层流FSS(0,0.12,1.2,2.4 Pa)6 h后,将不同FSS环境中的细胞随机分为5组:对照组加入无血清培养液灌流;辛伐他汀组加入含0.1μmol/L辛伐他汀培养液灌流;3个中药组分别加入含3 g/L的当归补血汤(当归、黄芪比为1∶1、1∶3、1∶5)培养液灌流。以上各组经FSS加载12 h后,收集细胞及灌流液,检测细胞增殖力、一氧化氮(NO)含量,细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)mRNA及蛋白的表达。结果对照组FSS为1.2、2.4 Pa时,内皮细胞表达eNOS、VEGFR2的水平较其在0、0.12 Pa时升高(P0.05);与对照组相比,当归补血汤在FSS为0、0.12 Pa时能上调细胞eNOS、VEGFR2表达并增强其增殖和分泌NO功能(P0.05)。且当归补血汤(当归、黄芪比为1∶3、1∶5)在FSS为1.2、2.4 Pa时可上调细胞eNOS、VEGFR2表达并增强其增殖和分泌NO功能(P0.05)。结论 FSS环境是影响当归补血汤对内皮细胞作用效果的重要因素之一。     

缺氧促进牛视网膜血管内皮细胞VEGF的表达

目的探讨缺氧对视网膜血管内皮细胞VEGF表达的影响。方法采用细胞克隆、机械除杂法培养视网膜血管内皮细胞;四唑盐比色试验(MTT)比较正常和缺氧状态下牛视网膜血管内皮细胞的细胞数目。应用ELISA法检测正常和缺氧状态下牛视网膜血管内皮细胞VEGF的表达。缺氧状态下加入VEGF抗体后,检测VEGF的表达。结果正常状态下即可检测到VEGF的表达。缺氧状态下,牛视网膜血管内皮细胞VEGF的表达显著增加(P<0.01)。结论缺氧环境能刺激培养的牛视网膜血管内皮细胞的增殖。缺氧能刺激培养的牛视网膜血管内皮细胞VEGF的表达。     

血管内皮细胞对卵巢癌淋巴结定向转移细胞侵袭能力的影响

目的:研究血管内皮细胞对卵巢癌淋巴结高转移细胞的运动迁移和侵袭能力的影响。方法:建立卵巢癌淋巴结高转移细胞(SKOV3-PM4)、人脐血管内皮细胞(human umbilical venous endothelial cells,HUVEC)条件培养基的交互培养体系,通过MTT法测定生长曲线,HE染色观察细胞超微结构的改变,Transwell穿膜运动实验、划痕实验、明胶酶谱分析等实验方法研究交互培养后各组细胞的侵袭转移能力的变化。结果:与同期单独培养的SKOV3-PM4、HUVEC相比,交互培养后的SK-OV3-PM4伪足增多,生长速度明显快于SKOV3-PM4,交互培养后HUVEC呈不规则形态,出现空泡化超微结构,生长速度与HUVEC相似,细胞的运动和侵袭能力增强,基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)在单独的SKOV3-PM4中低表达,在HUVEC中不表达,在共培养的SKOV3-PM4-HUVEC中高表达。结论:HUVEC上清液培养后的SKOV3-PM4的生物学行为和运动侵袭能力发生改变,推测可能与血管内皮分泌的VEGF、MMP-2等因子有关。     

Bevacizumab对肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响

目的探讨Bevacizumab对肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响。方法应用免疫细胞化学法检测肝癌细胞株HepG2中血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFRs）蛋白的表达；ELISA法检测HepG2细胞培养上清液中VEGF蛋白的表达；Bevacizumab处理HepG2细胞48h后，MTT法检测Bevacizumab对细胞增殖的抑制作用，用流式细胞仪检测并分析细胞凋亡变化。设不加药物的HepG2细胞为对照组。结果HepG2细胞中VEGF和VEGFR蛋白呈阳性表达，其细胞培养上清液中存在VEGF蛋白分泌；Bevacizumab可抑制HepG2细胞增殖；并可诱导HeF，G2细胞的凋亡，凋亡率为（17．04±0．14）％，明显高于对照组（2．85±0．08）％（P〈0．05）。结论Bevacizumab町直接抑制肝癌细胞株HepG2的增殖，并诱导其凋亡；为Bevacizumab除抗血管生成之外的抗肿瘤作用机制提供新的研究依据；为Bevacizumab在肝细胞癌治疗的应用提供理论依据。     

骨髓单个核细胞培养上清促进内皮细胞增殖作用

目的：探讨体外培养骨髓细胞分泌促血管生长因子的能力及培养上清对内皮细胞增殖的影响。方法：采用密度梯度离心法分离出大鼠骨髓单个核细胞进行体外培养,并连续收集4周培养上清。酶联免疫吸附实验（ELISA）法测定上清中血管内皮细胞生长因子（VEGF）;以含有不同浓度上清的培养液培养人脐静脉内皮细胞,分析单个核细胞培养上清对内皮细胞增殖的影响。结果：加入单个核细胞培养上清各组MTT比色光密度值较对照组明显增加（P<0.05）。第1,2,3,4周骨髓单个核细胞体外培养上清中VEGF分别为（24.40±7.99,89.28±5.13,115.24±10.08,157.00±15.64）pg/ml。结论： 骨髓单个核细胞培养上清可促进体外培养的人脐静脉内皮细胞增殖,体外培养的骨髓单个核细胞可持续分泌VEGF。     

胰岛素对高糖诱导人脐静脉内皮细胞分泌血栓调节蛋白的影响

[目的]研究胰岛素对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞可溶性血栓调节蛋白(solubility Thrombomodulin,sTM)分泌的影响和可能机制.[方法]将体外培养的人脐静脉内皮细胞分为葡萄糖组(5.5、20和40 mmol/L)、胰岛素组(10 IU/mL)、高糖(40mmol/L)环境下的胰岛素组(10 IU/mL)和对照组(不含葡萄糖和胰岛素),于0、6、24、48和72h等不同时间点收集细胞上清液,采用ELISA法双抗体夹心法检测sTM水平,同时将各时间的细胞上清液与正常血浆等比例混合后测定活化部分凝血活酶时间(Activated partial thromboplastin time,APTT).[结果]在培养的48 h内,高糖环境下(葡萄糖浓度40 mmol/L)内皮细胞分泌sTM的水平随着时间的延长逐渐升高且均高于对照组(P＜0.05),但培养72h后sTM的水平不再升高,反而下降(P＜0.05),高糖环境下(葡萄糖浓度40 mmol/L),APTT值逐渐降低且均低于对照组(P＜0.01)；胰岛素组内皮细胞在不同培养时间,分泌sTM的水平逐渐升高且均高于对照组(P＜0.05),与单独应用高糖(葡萄糖浓度40 mmol/L)相比较均降低(P＜0.05),APTT值随着培养时间的延长逐渐升高,但仍低于对照组(P＜0.01).[结论]生理浓度胰岛素可降低高糖环境下内皮细胞分泌sTM的水平,在一定程度内可以抵消高浓度葡萄糖对内皮细胞的损伤作用.     

人参皂甙对肺癌细胞和血管内皮细胞增生、凋亡及其周期的影响

目的：探讨中药20(R)-人参皂甙Rg3(Rg3)对肺癌细胞和血管内皮细胞增生、凋亡以及细胞周期的影响。方法：进行人肺腺癌细胞株A549、人脐静脉血管内皮HUVEC304细胞培养,不同浓度Rg3干预,采用MTT法、流式细胞术、透射电镜等技术,了解不同浓度Rg3对上述细胞增生、凋亡以及细胞周期的影响。结果：3×10-6 mol/L的Rg3可导致A549细胞明显凋亡,凋亡率为29.8%,与对照组(15.0%)相比差异有统计学意义（P<0.05）。Rg3对A549细胞周期的影响无显著差异。1×10-4 mol/L的Rg3对内皮细胞的生长抑制率为12.53%,显著高于其它组（P<0.05）,不同浓度Rg3对条件培养液（CM）诱导的血管内皮细胞的增生均有明显的抑制作用（P<0.05）,电镜下可见10-6 mol/L浓度的Rg3可使CM诱导的内皮细胞出现凋亡小体。 结论：适当浓度的Rg3有抗肿瘤作用和抑制肿瘤新生血管生成的作用。     

Endostar对肿瘤血管内皮细胞生长及功能的抑制作用

目的 探讨Endostar对肿瘤血管内皮细胞生长和功能的抑制作用及其相关的抗血管形成机制.方法 采用A549细胞上清诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)成为肿瘤血管内皮细胞(tumor-derived endothelial cells,Td-EC),通过MTT法、细胞迁徙试验、流式细胞术、TUNEL法等检测Endostar对Td-EC细胞生物学特性的影响.结果 Endostar在体外对于Td-EC有显著的生长抑制作用,并具有时间和浓度依赖性,但对于HUVEC的生长抑制作用并不显著;一定浓度的Endostar能显著降低Td-EC细胞迁徙活性,促使细胞凋亡数目增加、细胞形态学发生改变,并能显著增加Td-EC S期细胞比例(P<0.01),而同样条件下,Endostar影响细胞迁徙活性及促进细胞凋亡的作用对于HUVEC并不显著(P>0.05).结论 Endostar可以特异性地抑制肿瘤血管内皮细胞的生长及功能.     

血管瘤血管内皮细胞生物学特性的研究

目的:体外培养血管瘤血管内皮细胞(HVEC),研究其生物学特性。方法:采用组织块法对HVEC进行体外培养,倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态学特征,免疫组化法行第八因子相关抗原(VⅢ-RAg)鉴定,流式细胞术行血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)鉴定。观察HVEC体外培养的生长情况,并绘制细胞生长曲线。结果:培养的HVEC光镜下呈典型的"鹅卵石"样表现,VⅢ-RAg和VEGFR2表达均为阳性。结论:HVEC表面存在VEGFR2,组织块法适于培养HVEC。     

羟基红花黄色素A抑制异常增殖血管内皮细胞的机制研究

目的研究羟基红花黄色素A(HSYA)抑制异常增殖血管内皮细胞的作用机理。方法建立人结肠腺癌细胞LS180上清液和人脐静脉内皮细胞ECV304体外共培养模型,通过实时荧光定量PCR检测ECV304细胞中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(KDR)、碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)及其受体(b FGFR)、HSPG2、p53、c-myc mRNA水平的表达;ELISA法检测细胞培养上清VEGF、VEGFR(KDR)、b FGF、b FGFR蛋白的表达。结果在共培养细胞模型中,0.66、0.33 mg/L浓度的HSYA对血管生成促进因子VEGF及其受体KDR、b FGF及其受体b FGFR和癌基因c-myc及与细胞增殖相关蛋白多糖HSPG2的mRNA表达具有抑制作用;对抑癌基因p53 mRNA的表达具有促进作用。0.66、0.33 mg/L浓度的HSYA对血管生成促进因子VEGF及其受体KDR、b FGF及其受体b FGFR的蛋白表达具有抑制作用。结论 HSYA抑制新生血管的生成、抑制共培养模型中血管内皮细胞的异常增殖,其可能的作用机理是通过调控VEGF及其受体、b FGF及其受体、HSPG2、c-myc和野生型p53的表达发挥抗肿瘤作用,揭示HSYA可能是潜在的肿瘤血管生成抑制剂。