超声结合原卟啉Ⅸ对腹水型S180肿瘤细胞的损伤作用

目的：根据原卟啉Ⅸ（PpⅨ）在S180肿瘤细胞内的含量变化及亚细胞定位分析,研究聚焦超声结合PpⅨ对S180肿瘤细胞的损伤作用。方法：应用荧光分光光度法测定PpⅨ存S180肿瘤细胞内的富集;激光共聚焦扫描显微镜观察PpⅨ的亚细胞定位;台盼蓝拒染法检测超声结合不同浓度的PpⅨ作用后细胞的存活率;环境扫描电镜观察细胞膜表面超微结构变化。结果：PpⅨ在S180肿瘤细胞内的富集是一个动态变化过程．45 min达到最高点,此时为最佳声照处理时间点,且此时PpⅨ主要定位于细胞膜;超声激活PpⅨ对S180肿瘤细胞的杀伤作用明显大于单纯超声组,其膜损伤程度也更为严重。结论：细胞膜可能是超声激活PpⅨ作用的一个主要靶点。     

原卟啉Ⅸ介导的声动力疗法对S180 肿瘤细胞膜损伤研究

探讨频率为1.1 MHz、强度为3 W/cm2的聚焦超声,结合1 μg/mL的原卟啉Ⅸ（PpⅨ）对S180肿瘤细胞膜结构和功能的损伤作用。超声联合PpⅨ作用于S180肿瘤细胞后,通过酸性磷酸酶活力检测细胞生长活力;扫描电子显微镜观测细胞膜表面超微结构;生化分析方法检测Na⁺-K⁺-ATPase、Ca²⁺-ATPase活性,细胞膜唾液酸 (SA)及细胞内谷胱甘肽（GSH）含量;通过荧光酶标仪检测细胞线粒体膜电位及细胞色素C氧化酶含量。实验结果显示：与对照组（Control）、原卟啉Ⅸ组（PpⅨ）、超声组相比,超声联合PpⅨ处理组的细胞生长明显受到抑制,其酸性磷酸酶活力（OD值）由对照组063±003下降至0.34±0.01;细胞膜结构严重破坏,表现为微绒毛消失和胞质部分成分流失;膜表面重要成分如Na⁺-K⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase活性明显下降（P<0.05）,细胞膜唾液酸含量及胞内GSH水平急剧降低（P<0.01）。研究表明：超声联合PpⅨ作用于S180肿瘤细胞后,细胞膜蛋白受到严重破坏,部分膜蛋白流失。研究结果还提示：声动力处理后细胞线粒体膜电位水平显著降低（Rhodamin 123平均荧光强度由对照组14 082.78 ± 840.44下降至7 801.53± 409.15）;细胞色素C氧化酶活性由对照组的（0.015 6 ± 0.002 0）U/min/mg降低至（0.008±0.000 0）U/min/mg,提示线粒体也可能是超声联合PpⅨ对S180肿瘤细胞的作用靶点。     

一种基于神经细胞膜电位荧光探针的河豚毒素毒性检测细胞模型

目的:本实验建立一种有效的河豚毒素毒性检测细胞模型,为河豚毒素解毒药物高通量筛选奠定基础.方法:用不同浓度膜电位荧光探针DiBAC4(3)在全黑底透96孔细胞培养板中孵育SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞,利用不同浓度藜芦定使细胞去极化,利用荧光酶标仪测定不同浓度河豚毒素对细胞膜电位的影响.结果:以DiBAC4(3)10...     

NF

目的了解不同刺激剂作用HL-60细胞后对NF-kB活化的特点,为人类功能基因的筛选提供新的方法.方法采用基因转染技术获得能稳定表达IkBa-EGFP融合蛋白的HL-60细胞系,定性和定量检测8种刺激剂作用于该细胞系后荧光强度的变化.结果定性结果发现,在所用的8种刺激剂中,除IL-1ra作用后的细胞荧光强度没有明显的变化外,其它7种刺激剂作用后都有不同程度的细胞荧光强度的降低,尤以PHA作用后的变化更为典型.定量检测结果发现,稳定表达的HL-60细胞自身的荧光强度,随时间延长即有降低,IL-1ra作用后细胞荧光强度的降低同没有刺激时相比没有明显区别;其它7种刺激剂作用后均有明显的荧光强度降低,但它们作用后的特点并不相同.结论该真核转染的细胞可用于NK-kB活化刺激剂的初步筛选,可以作为功能基因组研究中新基因功能初筛的一个平台技术.     

NFkB活化诱导剂筛选细胞的建立

目的:了解不同刺激剂作用HL-60细胞后对NF-kB活化的特点,为人类功能基因的筛选提供新的方法.方法:采用基因转染技术获得能稳定表达IkBa-EGFP融合蛋白的HL-60细胞系,定性和定量检测8种刺激剂作用于该细胞系后荧光强度的变化.结果:定性结果发现,在所用的8种刺激剂中,除IL-1ra作用后的细胞荧光强度没有明显的变化外,其它7种刺激剂作用后都有不同程度的细胞荧光强度的降低,尤以PHA作用后的变化更为典型.定量检测结果发现,稳定表达的HL-60细胞自身的荧光强度,随时间延长即有降低,IL-1ra作用后细胞荧光强度的降低同没有刺激时相比没有明显区别;其它7种刺激剂作用后均有明显的荧光强度降低,但它们作用后的特点并不相同.结论:该真核转染的细胞可用于NK-kB活化刺激剂的初步筛选,可以作为功能基因组研究中新基因功能初筛的一个平台技术.     

不同细胞培养皿对激光共聚焦显微镜成像效果的影响

目的 探讨3种不同玻片厚度的激光共聚焦专用细胞培养皿制备的细胞样品在激光共聚焦显微镜(CLSM)下采集的荧光染色图像差异.方法通过活细胞及固定后细胞荧光染色实验,采用激光共聚焦显微镜观察细胞形态及荧光亮度,检测不同条件下成像的平均荧光强度,考察3种厚度玻片(0.085～0.13、0.13～0.16、0.16～0.19m...     

基于图像处理技术分析细胞吸收光敏剂过程的研究

目的 探讨利用图像处理技术分析细胞吸收光敏剂过程的可行性.方法 将光敏剂血卟啉单甲醚(HMME)注入喉癌细胞的培养皿中一定时间后,利用倒置荧光显微镜在不同时刻拍摄细胞的荧光图片,应用Matlab软件等进行图像处理得到反映不同时刻的细胞荧光强度的参数值L,并对计算结果进行对比.结果 细胞的荧光强度随着时间在15、90、300 min逐渐提高,Sobel算法与Otsu算法都可以较好地反映图像的荧光强度.结论 应用图像处理方法分析光敏剂进入细胞过程的方法简便、实用,具有重要的参考价值.     

补体膜攻击复合物刺激血管内皮细胞胞浆游离钙离子浓度的变化

目的 在单个细胞水平，观测亚溶破补体膜攻击复合物（MAC）诱导的血管内皮细胞[Ca^2 ]i的动态变化。方法 将原代培养的人脐静脉内皮细胞，以Fluo-4/AM(1-6μmol/L）和0.02%PluronicF-127进行细胞钙荧光指示剂负载后，于0℃组装亚溶破剂量的MAC，在37℃条件下，以LSCM实时监测MAC沉积引起的胞浆钙荧光强度的变化。结果 MAC沉积后，多数细胞的钙荧光强度迅速增强，以后随时间的推移，升高的钙荧光逐渐下降，直至恢复至静息水平，定量分析选定的胞浆区域钙荧光强度的变化发现，不同细胞在[Ca^2 ]i的变化高度，持续时间和胞内钙振荡 的特征等方面存在异质性。结论 MAC沉积到内皮细胞表面后，可诱导胞浆游离钙离子的浓度增高，且不同细胞[Ca^2 ]i的变化存在明显的异质性。     

5-ALA诱导白念珠菌生成PpIX与ALA浓度相关性研究

目的 对不同浓度光敏剂5-氨基酮戊酸(5-ALA)在白念珠菌体内生成原卟啉IX (PpIX)进行荧光强度测定,探求PpIX荧光强度与ALA浓度的关系.为光动力治疗白念珠菌选择最佳的光敏剂浓度提供理论依据.方法 实验分为实验组和对照组,将各组白念珠菌悬液与不同浓度5-ALA混合后避光60min孵育.利用共聚焦激光扫描显微镜测量PpIX荧光强度.结果 实验组白念珠菌与不同浓度ALA避光孵育后均有荧光物质PpIX产生,200mg/mL以上ALA浓度组产生的PpIX强度无统计学意义.300mg/mL以下ALA浓度与PpIX生成强度有相关性.对照组没有检测到PpIX.结论 ALA浓度与生成的PpIX荧光强度密切相关.这为临床ALA-PDT治疗白念珠菌疾病提供了实验依据.     

NFкB活化诱导剂筛选细胞的建立

目的：了解不同刺激剂作用ＨＬ－６０细胞后对ＮＦ－ｋＢ活化的特点，为人类功能基因的筛选提供新的方法。方法：采用基因转染技术获得能稳定表达ＩｋＢａ－ＥＧＦＰ融合蛋白的ＨＬ－６０细胞系，定性和定量检测８种刺激剂作用于该细胞系后荧光强度的变化。结果：定性结果发现，在所用的８种刺激剂中，除ＩＬ－１ｒａ作用后的细胞荧光强度没有明显的变化外，其它７种刺激剂作用后都有不同程度的细胞荧光强度的降低，尤以ＰＨＡ作用后的变化更为典型。定量检测结果发现，稳定表达的ＨＬ－６０细胞自身的荧光强度，随时间延长即有降低，ＩＬ－１ｒａ作用后细胞荧光强度的降低同没有刺激时相比没有明显区别；其它７种刺激剂作用后均有明显的荧光强度降低，但它们作用后的特点并不相同。结论：该真核转染的细胞可用于ＮＫ－ｋＢ活化刺激剂的初步筛选，可以作为功能基因组研究中新基因功能初筛的一个平台技术。     

低频超声激活光敏剂ATX-S10和HPD的实验研究

目的:对比低频超声条件下不同体积、不同浓度的ATX-S10和HPD的单态氧的荧光,探讨二者的声激活程度。方法:以17 KHz换能器作为辐射声源,利用光电倍增管收集单态氧的荧光强度,对比不同体积、浓度时ATX-S10和HPD的激活程度。结果:(1)在405 nm处,不同声功率的相对荧光强度在声致发光出现最大值前呈现平缓的阶梯变化趋势,超过60 W后,声致发光迅速增加至4~5倍,到达最大值后迅速下降。(2)相同体积的ATX-S10的荧光强度均比HPD高。同种光敏剂在不同浓度下,出现饱和趋势的体积相同,HPD样品体积大于5 mL,ATX-S10大于6 mL,荧光强度的增加趋势变缓,达到饱和。(3)ATX-S10和HPD在1270 nm附近的荧光强度随浓度的变化逐渐最大,呈近似的线性变化。结论:辐射强度越高,单态氧产量高,激活程度高,浓度越高,激活程度高。相同条件下光敏剂ATX-S10的单态氧产率比HPD高。     

管花苷B对抗H202诱导的PCI2细胞凋亡

目的:观察肉苁蓉提取物管花苷B对H:O:诱导的PCI2细胞损伤的影响.方法:用MTr法检测细胞存活率,以激光共聚焦显微镜荧光染色法检测细胞内活性氧的产生和线粒体膜电位的变化,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测细胞凋亡的发生,并用荧光酶标仪测定caspase-3的活性.结果:100 μmol稬-1H2O2处理细胞24 h显著降低细胞的存活率;诱导细胞发生凋亡,凋亡率达48.O％;细胞内活性氧水平及caspase-3的活性显著升高;而线粒体膜电位却明显降低,红／绿荧光强度的比值由正常的5.97降低为0.41左右.而预先给予l、10或100 mg.L-1浓度的管花苷B处理细胞12 h,可显著提高细胞存活率;并可有效抑制DNA ladder的发生;流式细胞仪检测凋亡率分别降低到30.9％、18.3％和6.2％;激光共聚焦显微镜结果显示管花苷B可明显降低细胞内活性氧的水平;并可逐渐恢复线粒体的高能量状态;easpase-3的活性不断降低,并呈现了一定的剂量依赖性.结论:管花苷B能显著地抑制H2O2诱导的PCI2细胞凋亡,其神经细胞保护作用可能与其降低细胞内活性氧水平,维持线粒体膜电位的高能状态和抑制caspase-3的活性有关.     

外源性ATP诱导PC12细胞的膜孔形成

 目的：探讨外源性三磷酸腺苷(ATP)诱导PC12细胞的膜孔形成及关键分子靶标。方法：用不同浓度的ATP处理培养的PC12细胞,采用倒置相差显微镜观察形态,CCK-8法检测细胞存活率,YO-PRO-1染色检测细胞膜通透性,Western blotting和real-time PCR检测P2X7 受体和pannexin 1（Panx1）表达的变化。结果：（1）ATP（1 mmol/L、3 mmol/L、5 mmol/L）作用3 h,可见随着ATP浓度升高,PC12细胞变圆,脱壁细胞增多;当ATP浓度为3 mmol/L或5 mmol/L时,PC12细胞活力较对照组显著下降（P<0.05）。（2）不同浓度的ATP（0、1、3、5 mmol/L）作用1 h,PC12细胞摄入YO-PRO-1的荧光强度随着浓度增加而增加;同一浓度的ATP作用不同时间（15、30、60 min）,随着时间的增加,胞内的荧光强度也增加。（3）亮蓝G（P2X7受体的抑制剂）预处理可明显拮抗ATP引起的细胞活力下降和胞内荧光强度增强（P<0.05）,而生胃酮（Panx1的抑制剂）预处理不改变细胞活力和胞内的荧光强度（P>0.05）。（4）ATP作用3 h使PC12细胞 P2X7受体的mRNA和蛋白表达明显升高（P<0.05）,而Panx1 mRNA和蛋白表达变化不大（P>0.05）。结论：胞外高浓度ATP引起PC12细胞的膜孔形成可能主要与P2X7受体的表达和激活有关。     

佛波脂对体外培养Th细胞表面CD4分子表达的影响

目的探索佛波脂(PMA)对Th细胞表面CIM分子表达的影响。方法用荧光标记的抗CD3／418抗体同经10、15、20、25ng/mL的PMA和1μg／mL的Ionomycin刺激培养2、3、4h的正常人外周全血细胞中的Th细胞上的CIM分子结合，溶血后用流式细胞仪检测CIM通道的荧光强度(MFI)。结果CIM通道的MFI随PMA质量浓度的升高和刺激时间的延长而降低。结论Th细胞表面CIM分子在刺激培养过程中随PMA质量浓度的升高和刺激时间的延长而减少。     

ALA和HMME水凝胶栓剂的制备和体内外释药研究

目的 制备光敏剂5-氨基酮戊酸(ALA)和血卟啉单甲醚(HMME)水凝胶栓剂,评价其对直肠肿瘤组织的光敏剂递送效率.方法 将皮下移植人直肠癌细胞SW837的BALB/c小鼠随机分为水凝胶栓剂直肠局部给药组、皮肤局部给药组、瘤内注射给药组和静脉注射给药组.用荧光光谱仪测量直肠壁、皮肤和皮下肿瘤中原卟啉(PpⅨ)和HMME的浓度,荧光光谱系统测定相应的光敏剂分布情况.结果 ALA水凝胶栓剂直肠局部给药组的PpⅨ浓度分别是皮肤局部给药组的9.76倍(1 h)和5.80倍(3 h),差异均具有统计学意义(均P＜0.05).皮肤局部给药后2h,ALA在肿瘤组织内达到最大穿透深度(3～6 mm).而HMME水凝胶栓剂直肠局部给药后,直肠壁中的HMME浓度极低,且皮肤局部给药后的最大肿瘤穿透深度不足2 mm.结论 与皮肤相比,ALA更易穿透黏膜屏障,以水凝胶栓剂形式直肠局部给药有望成为ALA用于光动力疗法治疗直肠癌的一种给药方式.     

小鼠骨骼肌细胞离体胰岛素抵抗模型的建立和验证

目的:建立稳定可重复的骨骼肌细胞离体胰岛素抵抗模型,促进胰岛素抵抗病理机制的探索及药物的研发与筛选。方法:采用小鼠骨骼肌成肌细胞C2C12为研究对象,分别以正常分化液及含40和60 mmol/L葡萄糖的分化液诱导分化,每天用相差显微镜观察不同浓度葡萄糖处理对细胞汇聚、融合和形成多核肌管的影响;分别在分化1、3、5和7 d后应用2-NBDG法检测不同处理对细胞基础糖摄取和胰岛素刺激糖摄取的影响;在分化5 d和7 d后应用Western blot法检测不同干预对葡萄糖转运子4(glucose transporter 4,GLUT4)蛋白表达的影响;分化5 d后应用免疫荧光组化法检测不同干预对GLUT4蛋白分布的影响。结果:形态学结果显示,经60 mmol/L葡萄糖(高糖)处理3 d后明显抑制C2C12细胞的生长分化;葡萄糖摄取结果表明高糖处理5 d和7 d后均明显抑制C2C12的基础糖摄取和胰岛素刺激的糖摄取(P0.01),且处理5 d后胰岛素刺激的糖摄取与基础糖摄取的差异无统计学显著性(P0.05); Western blot检测结果表明高糖处理5 d和7 d后,胰岛素刺激的GLUT4表达与基础GLUT4表达的差异无统计学显著性(P0.05),而对照组差异显著(P0.05);免疫荧光组化检测结果表明高糖处理5 d后明显减少C2C12细胞胞膜上GLUT4蛋白分布水平(P0.01)。40 mmol/L葡萄糖处理也在一定程度上发挥作用,但效果不如60 mmol/L葡萄糖明显和稳定。结论:通过高糖刺激可成功构建较为稳定的小鼠骨骼肌细胞离体胰岛素抵抗模型,以60 mmol/L葡萄糖刺激5 d效果最好,通过形态学观察并检测基础和胰岛素刺激的葡萄糖摄取能力和GLUT4蛋白表达与分布能较好地评价骨骼肌细胞离体胰岛素抵抗水平。     

口腔鳞癌中人端粒酶反转录酶、p53和MIB-1的表达及其临床意义

目的 探讨人端粒酶反转录酶(hTERT)、p53和MIB-1蛋白在口腔鳞癌组织中的表达及临床意义.方法 采用Envision免疫组织化学染色方法(IHC)检测20例口腔黏膜普通型增生、35例非典型增生(轻度10例、中度10例和重度15例)以及50例不同分化程度(高分化15例,中分化20例,低分化15例)的口腔鳞状细胞癌(OSCC)中hTERT、p53和MIB-1的表达.结果 hTERT、p53和MIB-1在口腔黏膜普通型增生、非典型增生及不同分化程度的OSCC均有不同程度表达.OSCC表达阳性率[中分化鳞癌hTERT:60％( 12/20)]高于普通型增生[hTERT:10％(2/20)]及非典型增生[中度非典型增生hTERT:30％(3/10)].分化程度低的OSCC表达阳性率[hTERT:66.7％(10/15)]显著高于分化程度高者[hTERT:46.7％(7/15)].结论 hTERT、p53和MIB-1在口腔OSCC发生、发展过程中起重要作用,并与OSCC的分化程度密切有关,可能是OSCC的较好预后指标.     

FITC标记单克隆抗体检测icIL-1ra的方法研究

目的 建立用单克隆抗体技术检测细胞IL-1ra的方法。方法 制备异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IL-1ra单克隆抗体，使其进入U937细胞内与icIL-1ra结合，然后用流式细胞仪(FACS)检测荧光强度，并比较U937细胞在刺激前后荧光强度的变化情况是否与icIL-1ra表达的变化情况相一致。结果 在一定剂量范围内，经PMA分化和LPS刺激的U937细胞的icIL-1ra表达量增加，其检测荧光强度相应增加。结论 用单克隆抗体检测细胞内icIL-1ra是一种快速、准确的方法，本实验方法能够满足实际研究工作中对icIL-1ra定量检测的要求。     

吡格列酮对前脂肪细胞分化及GILZ蛋白表达的影响

目的:探讨吡格列酮在3T3-L1前脂肪细胞分化及糖皮质激素诱导亮氨酸拉链(GILZ)蛋白表达调节方面的作用。方法:形态观察3T3-L1细胞分化过程,不同浓度吡格列酮(1×10~(-4)mmol/L~1×10~(-2)mmol/L)处理细胞48 h,然后于分化的第2、4、6天用油红O染色测定细胞甘油三酯相对含量,实时荧光定量PCR法检测过氧化物增殖活化受体(PPAR)γ2和脂蛋白酶(LPL)的mRNA表达。不同浓度药物处理细胞48 h后,Western blot检测GILZ蛋白表达。结果:油红O法显示甘油三酯相对含量随药物处理浓度的增加而增加,与对照组比,1×10~(-3)mmol/L和1×10~(-2)mmol/L组甘油三酯含量显著性增加(P0.05)。实时荧光定量PCR检测显示PPARγ2、LPL的mRNA表达也是随着药物处理浓度的增加而增加。与对照组比,吡格列酮高于1×10~(-3)mmol/L浓度时,PPARγ2、LPL的mRNA表达显著性增加(P0.01)。Western blot显示GILZ蛋白表达随着药物处理浓度的增加而降低。结论:吡格列酮可下调GILZ表达,上调PPARγ2及下游LPL的表达。     

管花苷B对抗H2O2诱导的PC12细胞凋亡

目的：观察肉苁蓉提取物管花苷B对H2O2诱导的PC12细胞损伤的影响。方法：用MTT法检测细胞存活率，以激光共聚焦显微镜荧光染色法检测细胞内活性氧的产生和线粒体膜电位的变化，DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测细胞凋亡的发生，并用荧光酶标仪测定caspase-3的活性。结果：100μmol&#183;L^-1H2O2处理细胞24h显著降低细胞的存活率；诱导细胞发生凋亡，凋亡率达48．0％；细胞内活性氧水平及caspase-3的活性显著升高；而线粒体膜电位却明显降低，红／绿荧光强度的比值由正常的5．97降低为0．41左右。而预先给予1、10或100mg&#183;L^-1浓度的管花苷B处理细胞12h，可显著提高细胞存活率；并可有效抑制DNA ladder的发生；流式细胞仪检测凋亡率分别降低到30．9％、18．3％和6．2％；激光共聚焦显微镜结果显示管花苷B可明显降低细胞内活性氧的水平；并可逐渐恢复线粒体的高能量状态；caspase-3的活性不断降低，并呈现了一定的剂量依赖性。结论：管花苷B能显著地抑制H2O2诱导的PC12细胞凋亡，其神经细胞保护作用可能与其降低细胞内活性氧水平，维持线粒体膜电位的高能状态和抑制caspase-3的活性有关。