灰毡毛忍冬LmPAL1基因的克隆及表达分析

目的克隆灰毡毛忍冬苯丙氨酸解氨酶(LmPAL1)基因全长序列,并进行生物信息学和表达模式分析。方法提取灰毡毛忍冬花总RNA,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和RACE技术克隆LmPAL1基因的全长cDNA序列;运用相关软件对该基因序列进行生物信息学分析;利用qRT-PCR测定灰毡毛忍冬茎、叶和不同花期花中该基因的相对表达量。结果克隆的LmPAL1基因开放阅读框(ORF)长度为2 145 bp,编码714个氨基酸,生物信息学分析预测为亲水性蛋白,定位于叶绿体中,包含PAL shielding结构域(527～641 aa),并且含有PAL/HAL活性中心序列GTITASGDLVPLSYIAG(196～212aa),与其他LmPAL1具有较高的相似度;LmPAL1基因q RT-PCR结果显示,7个花期材料以金黄色开花期相对表达量较高;与茎、叶比,白色花蕾期花的相对表达量最高,叶的最低。结论成功克隆了LmPAL1基因,为进一步研究该基因的功能以及遗传改良灰毡毛忍冬品质奠定基础,同时为探究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成和调节机制提供了依据。     

灰毡毛忍冬花蕾中绿原酸和咖啡酸的含量测定

目的:比较18种不同来源灵芝的多糖含量差异。方法:采用超声法提取,以0.2%蒽酮-H2SO4显色,紫外分光光度法测定多糖含量。结果:不同来源灵芝中多糖含量具有明显差异,以东北大袋料培养的灵芝多糖含量最高为2.74%,以广东野生赤芝含量最低为1.60%。结论:不同来源的灵芝由于地理环境因素和培养条件的不同,多糖含量存在明显差异,提示不能简单的以灵芝产地和栽培条件评价其质量。本实验为灵芝内在质量评价和为扩展灵芝资源提供参考依据。     

灰毡毛忍冬与正品金银花的绿原酸含量比较

目的：从有效化学成分绿原酸的含量评价灰毡毛忍冬的药用价值，以合理开发利用这一丰富的自然资源。方法：采用高效液相色谱法比较湖南产灰毡毛忍冬与山东省和河南省产的正品金银花(忍冬)的绿原酸的含量。结果：湖南省隆回县和新宁县产的灰毡毛忍冬中绿原酸含量分别为4．00％和4．52％，山东省和河南省产的金银花中绿原酸的含量分别为2．20％和2．46％。结论：灰毡毛忍冬中绿原酸的含量远远高于忍冬花。     

当归香豆酸-3-羟化酶基因ASC3H的克隆及表达模式与阿魏酸含量相关性分析

目的：对当归中香豆酸-3-羟化酶基因（C3H）全长进行克隆,进行生物信息学与基因表达模式分析,结合当归根不同组织部位阿魏酸的含量,推测ASC3H基因功能。方法：基于前期转录组测序结果,通过实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）克隆全长cDNA序列,运用生物信息学方法分析该序列特征,并利用Real-time PCR和高效液相色谱法（HPLC）分别测定当归不同组织中ASC3H基因表达量及阿魏酸含量。结果：克隆获得当归ASC3H全长基因（登录号MN2550298）,开放阅读框（ORF）长度为1 530 bp,编码509个氨基酸,理论相对分子质量为57.86 kDa,等电点8.36,为不含信号肽的亲水性不稳定蛋白,定位于叶绿体中,有跨膜区,具有多个磷酸化位点,含有细胞色素P450的保守结构域CGYDWPKGYGPIINVW＿P450(383～399 aa);多重氨基酸序列比对分析结果显示ASC3H与其他植物的C3H基因具有较高相似性,并与同科植物大阿米芹的同源性最高;Real-time PCR结果显示ASC3H基因在当归不同组织的表达量不同;HPLC结果表明阿魏酸成分在当归根...     

灰毡毛忍冬CHI和CHS基因的克隆及功能研究北大核心CSCD

该研究基于灰毡毛忍冬常规品种和湘蕾品种转录组数据,筛选到黄酮生物合成关键限速酶基因CHI和CHS的Unigene序列并克隆全长cDNA序列,通过在线生物信息学分析软件和qRT-PCR分析编码蛋白特性和不同花期、不同部位下CHI、CHS基因的表达模式,HPLC测定木犀草苷含量并结合表达量做相关性分析。结果显示,灰毡毛忍冬2个品种中CHI、CHS基因,分别包含627、1170 bp的ORF区,且CHI蛋白和CHS蛋白均为稳定、带亲水性的非分泌型蛋白。qRT-PCR结果表明2个品种CHI、CHS基因在不同花发育阶段及茎、叶中均有差异表达,且在关键花期表达差异明显,结合HPLC数据,木犀草苷含量与基因相对表达量之间呈现负相关性。推测灰毡毛忍冬中CHI、CHS基因参与调控黄酮化合物的累积,可进一步进行其功能研究。该研究首次克隆了灰毡毛忍冬中CHI、CHS基因并进行表达分析,丰富了灰毡毛忍冬黄酮生物合成研究,为进一步探究灰毡毛忍冬中木犀草苷等黄酮类成分差异的分子机制以及良种选育提供研究基础。     

灰毡毛忍冬的染色体及核型分析

目的对药用植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand．-Mazz的染色体数目和核型进行研究。方法采用常规制片方法，经显微摄影后对染色体进行分析。结果灰毡毛忍冬的体细胞染色体数目为2n=18，核型公式为K（2n）=2x=18=2m＋8sm（2SAT）＋8st（4SAT），染色体相对长度组成为2n=18=4L＋4M2＋4M1＋6S，染色体总长为47．264μm，长臂总长为34．8261μm，核型不对称系数（AS．K％）为73．71％，属于“3B”型。结论灰毡毛忍冬染色体的数目、核型等清晰准确。     

湖南3个产地灰毡毛忍冬花蕾的挥发油成分分析

目的:比较湖南省3种不同来源的灰毡毛忍冬花蕾中挥发油成分.方法:采用气相色谱-质谱法(GC-MS)研究湖南金银花主流品种灰毡毛忍冬花蕾中挥发油的化学成分.结果与结论:3种不同来源的灰毡毛忍冬花蕾中的挥发油均含有芳樟醇(Linalool)、香叶醇(Geraniol)、α-松油醇(α-Terpineol)、辛烯醇(1-Octen-3oL)、二十一烷醇(3-Henen-1-oL)等26个相同成分,其中芳樟醇的百分含量最高,在隆回、溆浦、新宁产灰毡毛忍冬花蕾中所占相对含量分别为15.77%、28.85%、31.88%.     

灰毡毛忍冬Lm-XL-AP1基因克隆、生物信息学和时空表达分析

目的克隆灰毡毛忍冬突变型品种AP1基因(Lm-XL-AP1),并对其进行生物信息学和时空表达分析。方法通过RACE技术克隆Lm-XL-AP1基因全长,运用生物信息学的方法进行基因同源性和相似性比较分析,预测其编码蛋白,并对其进行各种理化性质分析。运用荧光定量PCR(q RT-PCR)检测该基因在灰毡毛忍冬突变型植株不同花期和不同器官的相对表达量。结果获得AP1基因,开放阅读框(ORF)长729 bp,编码242个氨基酸,与甘菊中MADS-box基因家族AP1基因相似性达80%,且包含MADS和K-box的保守序列。AP1蛋白无跨膜区域,定位于细胞核中;在灰毡毛忍冬突变型植株第6花期相对表达量最高,同时茎、叶中也有表达。结论成功从灰毡毛忍冬突变型植株总RNA中克隆到可能参与控制花器官表达的AP1基因。     

不同品种灰毡毛忍冬ACS3基因克隆、表达及生物信息学分析

目的分别克隆灰毡毛忍冬野生型与湘蕾型ACS3基因,并进行生物信息学和表达模式分析。方法筛选灰毡毛忍冬转录组数据库中与ACS蛋白同源性较高的Unigene序列,设计引物,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及RACE技术对该Unigene进行全长克隆;用生物信息学软件分析蛋白的理化性质、结构域和同源性等特性;借助qRT-PCR检测1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(ACS3)基因在不同品种、不同花期灰毡毛忍冬中表达模式。结果从灰毡毛忍冬野生品种及湘蕾品种中分别克隆得Lm-ACS3(GenBank:MH724196)及Lm-XL-ACS3(GenBank:MH724197),开放阅读框长度均为1452bp,编码483个氨基酸,包含保守的Aminotran_1_2结构域,与其他植物的ACC合酶具较高相似度;qRT-PCR结果显示,野生型ACS3基因不同花期间表达差异显著,从花期3开始呈整体明显上升趋势,湘蕾型中花期间表达差异相对较小。结论分别克隆得到灰毡毛忍冬野生型和湘蕾型ACS3基因,该基因在2品种中具不同表达模式;推测ACS3基因或为导致灰毡毛忍冬不同品种间差异表型的可能功能基因之一,为进一步验证该基因在调控蕾期长短及花表型的生物学功能提供实验基础。     

灰毡毛忍冬种子萌发与幼苗生长影响因子研究

通过研究灰毡毛忍冬种子萌发与幼苗生长影响因子,旨在提高其种子繁殖效率,并为制定种子质量检验方法提供依据。观察灰毡毛忍冬果实和种子形态特征,测定种子吸水量,同时设不同湿沙层积时间、温度和发芽床处理,测定其发芽势、发芽率、发芽指数对种子萌发和幼苗生长的影响。结果表明灰毡毛忍冬种子吸水通透性无障碍,22 h后吸水量接近饱和;4℃湿沙层积处理80 d前,随着层积时间增加种子初始发芽时间缩短,发芽率和发芽势提高,层积100 d,发芽率降低;15℃下,种子发芽和幼苗生长各项指标最佳,其中光照条件下的幼苗子叶宽度显著大于黑暗条件下;种子在纸上、砂上的发芽势、发芽率和发芽指数显著高于其他发芽床,且霉变率低。灰毡毛忍冬的标准发芽试验规程为:种子于4℃湿沙层积80 d,纸上或砂上发芽床,15℃恒温光照培养,首次计数为置床后第4天,末次计数为第23天,统计发芽势的时间为置床后第13天。     

垂序商陆PaAACT基因克隆和表达分析

目的:从垂序商陆根中克隆了商陆皂苷甲生物合成过程中关键酶乙酰乙酰辅酶A转移酶(acetoacetyl-CoA transferase,AACT)基因,进行生物信息学分析和原核表达。方法:提取垂序商陆根的总RNA,然后逆转录合成c DNA,在分析垂序商陆转录组数据的基础上,设计Pa AACT基因的特异性引物,聚合酶链式反应(PCR)扩增Pa AACT基因的c DNA序列,通过构建原核表达载体p ET-32a-PaAACT,诱导表达并且纯化目的蛋白。结果:Pa AACT基因开放阅读框为1 254 bp,编码417个氨基酸。生物信息学分析显示Pa AACT蛋白的分子式为C1 914H3 120N538O576S17,推测其相对分子质量为43. 43 k Da,理论等电点8. 90,不稳定系数32. 27,属于稳定蛋白质。根据生物信息学分析结果,Pa AACT蛋白属于硫解酶家族成员,在C末端含有硫解酶家族的1个保守位点和1个活性位点。Pa AACT蛋白可能位于细胞质中、不含信号肽、没有跨膜区。系统进化分析显示Pa AACT蛋白与甜菜等廖科植物AACT蛋白亲缘关系较近。经IPTG诱导,在大肠埃希菌BL21 (DE3)菌株中表达了Pa AACT重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱获得了纯化的目的蛋白。结论:该研究从垂序商陆中克隆Pa AACT基因,为下一步测定Pa AACT酶催化活性、制备抗体奠定基础,也为研究其在商陆皂苷甲生物合成途径中的作用提供理论依据。     

灰毡毛忍冬种子质量检验方法与分级标准研究

参照《中国农作物种子检验规程》,研究扦样、净度、千粒重、真实性、水分、生活力、相对电导率、发芽等灰毡毛忍冬种子质量检验方法;对38份不同来源的种子做质量检验,采用K-均值聚类制定质量分级标准。结果表明:灰毡毛忍冬种子最少试验量为7.5 g,过20目筛进行净度分析,五百粒法测定千粒重,种子粉碎高恒温(130±2)℃烘干3 h测定水分含量,0.1%TTC溶液25℃避光染色5 h测定生活力,1.0 g种子在25℃超纯水中浸泡12 h测定相对电导率,4℃下沙藏层积80 d后置于15℃光照纸床进行发芽试验;不同来源种子按质量分为3个等级,初步制定了种子质量分级标准。生产上建议使用Ⅰ级和Ⅱ级种子。     

硫熏和烘干金银花中绿原酸、木犀草苷含量对比分析

目的:比较不同产地硫熏和烘干金银花中绿原酸、木犀草苷含量变化,考察硫熏工艺对金银花内在化学成分的影响。方法:采用HPLC测定不同产地、不同炮制方法金银花中绿原酸及木犀草苷含量。结果:硫熏后金银花中绿原酸含量明显升高,而木犀草苷含量变化不大。结论:硫熏对金银花中绿原酸含量影响较大,但对木犀草苷含量基本无影响,不同产地两种成分含量相差较大。     

荆芥柠檬烯-3-羟化酶基因克隆及生物信息学分析

目的:克隆荆芥(Schizonepeta tenuifolia)中的柠檬烯-3-羟化酶基因(limonene-3-hydroxylase,StL3OH),并对该基因的cDNA序列进行生物信息学分析.方法:根据荆芥转录组数据库设计特异性引物,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术克隆StL3OH基因的cDNA序列,...     

欧洲花楸糖基转移酶基因的全长克隆与表达分析

目的:研究欧洲花楸植保素糖基化修饰的相关基因,从欧洲花楸悬浮细胞中克隆糖基转移酶(glycosyltransferase,GT)基因,进行序列分析和原核表达。方法:基于欧洲花楸转录组数据设计特异性引物,克隆得到2条Sa UGTs基因的c DNA序列,构建HIS-MBP-pET28a-SaUGTs原核表达载体,诱导表达Sa UGTs重组蛋白。结果:克隆得到2条糖基转移酶基因Sa UGT1和Sa UGT2序列,完整开放阅读框为1 458 bp和1 431 bp,分别编码485和476个氨基酸,相对分子质量为54. 27 k Da和53. 49 k Da,理论等电点为5. 50和5. 63。生物信息学分析显示,无信号肽,含有糖基转移酶家族保守结构域(PSPG)。系统进化结果显示Sa UGT1和Sa UGT2蛋白与拟南芥UGT85家族亲缘关系较近。实时荧光定量PCR检测显示,欧洲花楸悬浮细胞经酵母提取物(YE)诱导后,Sa UGT1和Sa UGT2的相对表达量明显上调,分别在24 h和12 h达到最大值。通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达Sa UGT1和Sa UGT2重组蛋白,并得到了纯化的重组蛋白。结论:该研究首次在欧洲花楸中克隆得到糖基转移酶基因,并成功构建了原核表达载体,为进一步研究该类基因的功能奠定了基础。